デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

サマリー

オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の髄鞘細胞です。このプロトコルは、ラット皮質からそれらの前駆体であるオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離および培養する方法、および実験要因に応答してin vitroでオリゴデンドロジェネシスを評価するための迅速で信頼性の高い定量的方法について説明しています。

要約

効率的なオリゴデンドロジェネシスは、脊髄損傷、新生児低酸素症、多発性硬化症や横断性脊髄炎などの脱髄疾患を含む多くの研究分野の治療目標です。髄鞘形成は、中枢神経系内での迅速なインパルス伝播を促進するだけでなく、その下にある軸索に栄養サポートを提供するためにも必要です。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、in vitroで研究することで、オリゴデンドロサイトの分化を促進または阻害する可能性のある因子を特定することができます。これまで、このプロセスを評価するために利用可能な方法の多くは、一度に調査できる条件の数が限られているために多数の細胞を必要とするか、または手間のかかる定量化の方法のいずれかでした。ここでは、高純度のOPCを多数単離するためのプロトコルと、複数の条件から同時にオリゴデンドロジェネシスを測定するための高速で信頼性の高い方法について説明します。OPCは、P5-P7新生児ラット皮質から単離され、分化前の3日間in vitroで増殖されます。分化の4日後、オリゴデンドロジェネシスを二重赤外線蛍光スキャンアッセイを用いて評価し、ミエリンタンパク質の発現を決定します。

概要

哺乳動物の中枢神経系（CNS）における効率的な神経伝導がオリゴデンドロサイトによって軸索の髄鞘形成を必要とします。開発中に、オリゴデンドロサイトは、開発前脳と神経管¹の心室ゾーンから移行すると考えられているオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）のプールから生じます。移行後のOPCは、効率的なインパルスの伝播を促進するだけでなく、栄養サポート²と軸索を提供するだけでなく、オリゴデンドロサイトをミエリン形成、成熟へと分化します。成体CNSは、すべてのセル³の約百分の5から8までを含む、グレーと白質全体に分散されているOPCの豊富な人口を維持します。脱髄傷害後、OPCが、損傷部位に遊走増殖し、露出した軸索上の紛失または破損したミエリン鞘を置き換えるために分化します。しかし、いくつかの疾患/損傷の設定では、このプロセスは非効率的であることが見出されたまたは完全に^4失敗することができます。同時に慢性脱髄は、症状^{5を軽減する}ことができる疾患、効率的oligodendrogenesisおよび再ミエリン化の負担に追加すると考えられています。したがって、oligodendrogenesisに関する実験要因の影響を決定するために、in vitroでのOPCを研究するために注目されています。

乏突起膠細胞の分化の異なる段階への洞察は、ステージ特異的な細胞マーカーを同定することによって可能となりました。 ^{8 -}自己再生初期前駆細胞は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRα）、神経/グリア抗原2（NG2）とA2B5 ⁶の発現によって定義されます。 OPCには、それらの分化プログラムを開始し、細胞周期から撤退したように、彼らは、これらのマーカーの発現をダウンレギュレートし、環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ（CNPアーゼ）とO4を含むオリゴデンドロサイトをpremyelinatingを示すタンパク質を発現し始めます。最後に、より成熟したoligodendrocへの分化ytesは、​​ミエリン関連糖タンパク質（MAG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）などのミエリン関連タンパク質の発現によって特徴付けられます。 MBPは、細胞内の末梢膜タンパク質およびミエリン鞘の主要な成分です。 MBP欠損したマウスは、CNSミエリン形成が大幅に震え、痙攣、早期死亡^9,10につながる減少している深刻な表現型を開発。髄鞘形成におけるMBPのこの重要な役割は、in vitroおよびin vivo ¹¹ の両方のオリゴデンドロサイト分化のマーカーとしての使用につながっています。

MBPの定量化は、いくつかの異なる方法を用いて達成することができます。 RT-PCRおよびウェスタンブロット分析は、異なる治療計画の下MBPレベルの定量化を可能にします。免疫細胞化学は、カメラベースの顕微鏡手法が使用される場合にも、定量的であることができる共通の定性的なアプローチです。これらのシステムは、信頼性との基本であるが、オリゴデンドロサイト分化の研究では、それぞれが薬物スクリーニングにおけるそれらの使用を制限し、自分の欠点を有しています。まず、RT-PCRおよびウェスタンブロット分析のために必要とされる主要なOPCの量を同時に検査することができる変数の数を減少させます。免疫細胞化学のための細胞要件がはるかに低いですが定量化が目標である場合には、かなりの時間が各実験に専念しなければなりません。多数の画像が取り込まれ、その後、実験的な分析を容易にするために、定量化する必要があります。これらの注意事項は、高スループットの評価を必要とする研究のために考慮すべき重要な障害となります。ここでは、大幅に必要な細胞の数および定量分析が完了するまでの時間の両方を削減しながら、免疫細胞化学およびミエリン定量化のためのウェスタンブロット方法論の両方から基本的な側面を利用する方法について説明します。

プロトコル

動物を対象とする手順は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）と医学のジョンズ・ホプキンス大学によって承認されています。

1.アッセイプレートの調製、ストックソリューション、およびOPCベースメディア

注：ここで説明したラットOPCベース（佐藤）メディアは、以前に公開された研究^12,13から導出されています。代替的な培地処方は、この手順と適合性であってもよいです。

1. 滅菌脱イオン水で10μg/ mlの濃度に再懸濁し、ポリ-L-リジン（PLL）。ピペット黒壁、透明底24ウェル組織培養グレード皿の各ウェルに希釈されたPLL400μlの。
2. 37℃の組織培養インキュベーター中または一晩、4℃の冷蔵庫中で2時間コート組織培養皿。
3. メッキに少なくとも20分前にコーティングされた皿から吸引除去するPLL。組織培養で蓋を部分的に半開き24ウェルプレートを配置することによって、残りのPLLは井戸から乾燥することができますフード。ウェルが孤立するOPCをめっきする前に完全に乾燥していることを確認します。細胞は液体PLLの存在を持っているプラ​​スチックに付着しません。
4. N -アセチル-L-システイン（NAC）原液（1,000倍）を準備しますダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）20ml中100mgのN -アセチル-L-システイン（NAC）を溶解します。 -20℃で小分けし、店舗。
5. ヒドロコルチゾンストック溶液（1,000倍）を準備：1mgのヒドロコルチゾンと溶解するスワールにエタノール1mlを追加します。 、DMEMの19ミリリットルを加え、-20℃で溶液、アリコートとストアを混ぜます。基本培地へのヒドロコルチゾンの添加は、グリア細胞¹⁴の生存を増強することが示されています。
6. D-ビオチン原液（5,000x）を準備します。PBSの50mlにd-ビオチン2.5mgのを溶かします。溶解を助けるために、0.1 N NaOHを1〜2×5μlの滴を追加します。 -20℃で小分けし、店舗。
7. インスリンストック溶液（100倍）を準備します。組織培養グレードの水50mlに25mgのインスリンを溶解します。 250μlのOを追加します。F 1 N HClを、溶液が透明になるまで混ぜます。 6週間まで4℃で0.22μmフィルターとストアで滅菌します。
8. 佐藤ストック溶液（100倍）を準備します。
   1. プロゲステロンストック溶液（25μgの/μl）を準備します。エタノール100μlの2.5 mgのプロゲステロンを溶かします。
   2. 亜セレン酸ナトリウム原液（400 ngの/μl）を準備します。100μlの0.1N NaOHで4 mgの亜セレン酸ナトリウムを溶解します。 DMEMの10ミリリットルを加え、混合します。
   3. DMEMの100ミリリットルに、人間のアポトランスフェリンの1グラム、ウシ血清アルブミンの1グラム、及びプトレッシンの160ミリグラムを追加し、完全に溶解するように混ぜます。プロゲステロンストック溶液25μl、亜セレン酸ナトリウム原液を1000μLを、加えて混合します。 -20℃で小分けし、店舗。
9. （4.5グラム/ LのD-グルコース、L-グルタミン、および110 mg / Lのピルビン酸ナトリウム）DMEMの100ミリリットルあたり、100μlのNACを追加し、100μlのヒドロコルチゾン、20μlのD-ビオチン、1ミリリットル：OPCベースメディアを準備しますインスリン、1ミリリットル佐藤ストック、100μlの微量元素B、2 mLのB-27サプリメント（50倍）、およびペニシリン/ストレプトマイシン（100倍）の1ミリリットル。 4℃で0.22μmフィルターとストアで滅菌します。
10. PDGF-AAストック溶液（1,000倍）を調製する：20 / mlの溶液を作製するために、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS 12.5mlの250μgのを溶かします。 -80℃で小分けし、店舗。
11. OPC増​​殖メディアを準備します。OPCベースのメ​​ディアは20 ngの/ mlのPDGF-AAを補いました。
12. OPCの分化培地を準備します。OPCベースのメ​​ディアは、45 nMのトリヨードサイロニンを補いました。
13. PBSの500ミリリットルに、BSAの2.5グラムを追加し、0.5 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の2ミリリットルと7.2にpHを調整する：列のバッファを準備します。 4℃で0.22μmフィルターとストアで滅菌します。

2.ラット脳解剖

注：P5、P7の仔ラットは、このプロトコルで使用されています。各ラットの仔の皮質は、約1.5〜2.0×10 ⁶ A2B5陽性細胞が得られます。

1. 250を使用して、すべての解剖器具を滅菌します6; C加熱ビーズ滅菌器。
2. 50ミリリットルコニカルチューブにPBSの（のCa ²⁺およびMg ²⁺なし）15〜20ミリリットルを追加します。 One 50ミリリットルコニカルチューブ3-4ラット仔の皮質のために十分です。氷上で50ミリリットルコニカルチューブを置きます。解剖時にダイスカット皮質組織を保持するために50ミリリットルにコニカルチューブを使用してください。
3. 10センチメートルペトリ皿に冷PBSを追加します。この皿は、光学顕微鏡下で切開するために使用されます。
4. 大きな手術用ハサミで断頭によりラットの子を生け贄に捧げます。 70％エタノールでヘッドをスプレーします。
5. 全脳を抽出
   1. 小さなはさみを使用すると、正中線の下や背中耳と皮皮膚フラップの後ろの皮膚を切りました。正中線脳幹から始まり、目で終わるの頭蓋を削減。根底にある皮質の構造を維持するためにあまりにも深く切らないように注意してください。
   2. 大後頭孔の中に小さな手術用はさみを挿入することにより、小脳に劣っ2の横方向のカットを行います。目の間の追加のカットを行い、アリ嗅球にerior。
   3. 慎重に戻って頭蓋の各半分の皮をむきます。冷PBSで満たされた10センチメートルペトリ皿に全脳と場所を削除してください。
6. 解剖光顕微鏡下では、細かい手術用鉗子で嗅球および小脳を削除します。
7. 腹面は光学顕微鏡で見えるように脳を反転します。
8. 細かいストレートピンセットを使用すると、脳の2/3程度の深さに皮質と視床下部の間、閉じた鉗子先端を配置することによって、鈍的切開を行います。鉗子の場所に入ると端が開くことができます。他の半球のために繰り返します。
9. 視床下部と中脳の領域からの皮質をいじめます。
10. その後面で中脳を保持し、脳の前方端部に向かってそれを剥がすことにより、視床下部、視床、および中脳を削除します。前方の接続を断ちます。
11. 外側にそれをピーリングした後にその接続を切断することによって海馬を削除します細かい曲がった解剖ピンセットを用いて皮質。
12. 細かい曲がった解剖鉗子を使用して、外向きの斜めの動きで、基礎となる皮質からそれを廃棄することにより、残りの線条体を削除します。
13. 皮質の腹面から任意の血管と髄膜をクリアします。
14. 背面が見えるように脳を反転します。髄膜と血管が明らかであるべきです。細かい解剖ピンセットを用いて、基礎となる皮質からはがし髄膜。嗅球の取付け位置からの剥離を開始します。
15. 完全には3-4仔ラットの合計2.4から2.14を繰り返します。
16. 乾燥ペトリ皿に3-4解剖ラット仔の皮質を配置し、1ミリメートル×1ミリメートルのチャンクが達成されるまで滅菌カミソリの刃で切ります。 1 50mlコニカルチューブ（ステップ2）次に、氷上に戻って置きますから、PBSで皿を洗浄することによって、組織を収集します。

3.酵素と機械的組織解離

注：このステップでは、パパインベースの神経解離キットが推奨されます。数Neを使用しましたウラル解離キット（P）は、OPCの単離のために最適な特別な手順が記載されています。

1. 適切な緩衝液で酵素Pを希釈することにより、第1解離酵素を準備します。各50ミリリットルコニカル（1サンプル）の内容は、酵素ミックスの1950μlの合計で再懸濁されます。 10分間、37℃の浴中の酵素ミックスの場所。
   1サンプル：パパイン酵素のバッファー+50μlのの1900μlの
2. すべての50ミリリットルを3分間、300×gで3-4さいの目に切ったラット仔の皮質を含むコニカルチューブをスピン。
3. 上清を吸引除去し、各サンプルチューブに酵素液1950μlを添加し、チューブを反転して穏やかに振とうすることによってペレットをばらばら。
4. 連続チューブの回転で15分間、37℃の組織培養インキュベーター中でインキュベートします。
5. インキュベーションの最後の5分の間に、第二の酵素ミックスA.は、その適当な緩衝液中の酵素を希釈用意。 30μlの合計が追加されます各50mlコニカルサンプルチューブに。
   1サンプル：酵素の緩衝液20μl+10μlの
6. インキュベーションが完了したら、各チューブに第二の酵素ミックスの30μlを添加し、混合するために反転。
7. ピペットコントローラに接続されているガラスパスツールピペットを用いて、機械的に10〜15回ピペッティングすることによって、または組織片のサイズが縮小され、溶液が濁るまで、組織を解離します。連続回転で15分間、37℃の組織培養インキュベーターにサンプルを返します。
8. 1ミリリットルピペットを用いて各組織ホモジネート試料を10〜15回ピペット。
9. 200μlのピペットを用いて各組織ホモジネート試料を15~20回ピペット
10. 連続回転で10分間、37℃の組織培養インキュベーターにすべてのサンプルを返します。
11. 各サンプルに^{（2+ の} Ca 2+およびMgを）10mlのPBSを加え、50メートル上に配置された40ミクロンの細孔のフィルターを通してホモジネートをフィルタリングリットルチューブ。 PBSのさらに1〜2 mlのフィルターを洗浄します。
12. プール1 50ミリリットルにホモジネート試料のすべての円錐管と全体の細胞数を取得します。
13. 細胞計数を行った後、（各サンプルについて1管）15とmlのコニカルチューブに均等にホモジネートを分割します。 300×gで10-12分間遠心分離します。

4.アンチA2B5ビーズアプリケーション、カラム精製、及びめっき

1. カラム緩衝液および抗A2B5マイクロビーズの計算を実行します。毎1×10 ^{6個の細胞}のために7μlの列バッファを追加します。 2μlのすべての1×10 ^{6個の細胞}のためのアンチA2B5マイクロビーズを追加します。
2. 10-12分間、300×gでカラム緩衝液および遠心分離の10ミリリットルの全容量中に細胞を再懸濁することにより、サンプルのすべてを兼ね備えています。
3. 工程4.1で計算された列バッファの適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。ペレットが大きいと緩んでいる場合、唯一の抗を維持するために、列バッファの容量の約半分を追加細胞の再懸濁に適切な濃度で体。
4. 4℃で10分間細胞懸濁液をインキュベートします。
5. 追加（ステップ4.1で計算された）抗A2B5マイクロビーズ、数回転倒し、30〜60分間、4℃でインキュベートします。静かにチューブを10分ごとに数回転倒。より長いインキュベーション時間は、細胞収量を増加させることができるが、非特異的結合を増大させることができます。
6. カラム緩衝液の5倍容量を追加します。細胞を1mlの容量に再懸濁されている場合、カラム緩衝液5 mlを加え、細胞を2ml中に再懸濁されている場合、一方、カラム緩衝液10mlを加えます。
7. 300×gで10分間遠心分離します。
8. 精製のために必要とされるどのように多くのLSの列を決定します。 One LSカラムは15-20×10 ⁶の全細胞のために十分です。
9. 使用されているLSカラムごとにカラムバッファー1,000μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。
10. プライム各カラム緩衝液5mlを添加することにより、カラムをLS。 50ミリリットルコニカルチューブのフロースルーを収集します。コラム府いったんfferは完全に、上部チャンバーを通過した各列に細胞懸濁液を1000μLを適用し、細胞が重力によってを通じて実行することができました。
    注：細胞の密度が高すぎる場合は、列が遅く実行することができます。
11. 細胞懸濁液がカラムを通過した直後に、ゆっくりと未結合の細胞を洗浄し、各カラムにカラムバッファーを3mlを加えます。洗浄が容易に列（すべての30-45秒のための1滴）を介して実行されている場合は、カラム緩衝液3mlでさらに2回洗浄します。
12. 各列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。カラム緩衝液の5ミリリットルを追加し、カラムに同梱されているプラ​​スチック製のプランジャーを使用して速い速度でカラムを介してバッファを突入。急落は、カラムからそれらを解放結合した細胞を除去します。
13. LSカラムの第二ラウンドを通じてサンプルを実行することにより、純度を高めます。最初のパスの間に使用される列の数の三分の一を使用してください。プライムカラム緩衝液の5ミリリットルの列。列バッファが上部チャンバーを通過することを許可します。
14. 細胞懸濁液の体積が非常に大きくなるので、均一に各列に細胞懸濁液を1,000μLを適用し、懸濁液を追加の1,000μlので補充する前にカラムの上部チャンバーを通過することを可能にします。
15. 細胞懸濁液を完全にカラムの第二ラウンドに適用された後、カラム緩衝液3mlで2〜3回洗浄します。
16. 各列を削除し、滅菌15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。カラム緩衝液の5ミリリットルを追加し、カラムに同梱されているプラ​​スチック製のプランジャーを使用してバッファを急落。急落は、カラムからそれらを解放結合した細胞を除去します。
17. 12-15分間、300×gで細胞懸濁液を遠心します。ペレットをコンパクトに表示されます。
18. 予熱したOPC増殖培地（PDGF-AAを20ng / mlのを補充したOPCベースメディア）5〜10 ml中に細胞ペレットを再懸濁します。
19. 血球計数器を用いて細胞を数えます。
20. 細胞をプレー。 OPCの増殖培地で60,000細胞/ mlに細胞を希釈します。各黒に、透明な底の24ウェル、ウェルの側面に沿って細胞のピペット500μlをウェルあたり30,000細胞を得ることができます。 8の字運動を使用して水平方向にプレートを振とうすることにより細胞を混ぜます。 48、96、または384ウェルプレート中でアッセイを行う場合は、それぞれ、ウェルあたり15000、7500、または1500のセルを追加します。これらの番号は、個々のプレートの仕様に応じて調整することができます。
21. 0日目のベースラインコントロール培養のために別々のプレートを準備します。セクション5.7で説明したように分化が0日目に開始されたとき、この制御板は、4％パラホルムアルデヒドで固定されるべきです。
22. 文化のないメディアの変化との3日間、37℃でのOPC増殖培地中の細胞。

4％パラホルムアルデヒドでOPC分化および固定の5誘導

注：oligodendrogenesisに小分子の効果をテストするとき、私たちは日常的にdissolv次いで、-80℃で保存し、0.1％DMSOの最終濃度を得るために直接SATO培地中に希釈することができる1,000倍ストックを調製するためのジメチルスルホキシド（DMSO）の電子薬剤。我々は、（データは示していない）DMSOのこの濃度を用いてOPCの増殖または分化のいずれかに変化が認められませんでした。

1. プリ暖かいOPCのベース媒体を37℃にし、室温に薬物治療ストックを解凍。重複して治療を行う場合は、1.5mlチューブに処置群あたりのメディアの約1.25ミリリットルを準備します。 3つの試料について、たるみを考​​慮するために、2ミリリットル容量の遠心管を使用しています。
2. OPCベースのメ​​ディアに直接治療の株式を希釈することによって、レプリケート井戸の治療マスターミックスを準備します。簡単に言えば渦やそっと治療の均一な分布を確実にするために、各マスターミックスを混ぜます。
3. 陽性対照および陰性対照として適切な車両として45 nmのトリヨードチロニン（T _{3）を準備します。} 10 mMのT ₃の株式を希釈1：OPCベース培地1ml 1,000その後さらに必要に応じてDMSOの最終濃度を低下させる治療マスターミックスに希釈します。
4. 細胞の乾燥を避けるように、時間に培養ウェル一つの処理グループからメディアを吸引除去します。ウェルの側面から、文化に黒色材料を掻き避けるためにガラスパスツールピペットの先端に200μlのピペットチップを使用してください。
5. ゆっくりよく1ミリリットルピペットを使用しての側面に沿って処理マスターミックスの500μlを添加します。
6. 2〜3日ごとに新鮮な処理媒体との完全な培地交換を行って、希望の時間枠のための文化をインキュベートします。私たちは日常的に分化培地で4日後に30％から40％MBP ⁺文化を観察します。
7. 所望の治療期間の終了時に、新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製または室温に凍結ストックを解凍。注意：PFAは非常に有毒であり、ドラフト内で調製しなければなりません。
8. メディアを吸引し、ゆっくりと400を追加1;細胞を固定するための井戸の側にPFAのリットル。室温で20分間プレートをインキュベート。
9. PFAを吸引し、ゆっくりと細胞を洗浄し、ウェルの側に無菌（のCa ²⁺およびMg ^2+）のD-PBSを500μlを追加します。洗浄をさらに2回の合計を繰り返します。最終洗浄を吸引しないでください。
10. 後の処理のために4℃でパラフィルムや店舗でプレートを包み、または次のステップに直接進みます。プレートを数週間保存することができます。

ミエリン塩基性タンパク質の6免疫細胞化学および定量化

注：24ウェルプレート中の液体取り扱い手順を実行する場合、細胞の乾燥を避けるために、高速に動作することをお勧めします。ここでは、マルチチャンネル真空吸引器とマルチチャンネルピペットの使用が推奨されています。

1. 、室温にプレートを持参のウェルを吸引し、0.1％トリトンX-100および5％を含む（のCa ²⁺およびMg ²⁺を含む）のD-PBSを250μlを追加正常ヤギ血清（NGS）。穏やかな軌道に振とうしながら室温で1時間プレートをインキュベートします。
2. 1000ウサギポリクローナル抗アクチン抗体を1：マウスモノクローナル抗MBP抗体1を希釈することによって一次インキュベーション溶液を調製し、5％NGSを含有するD-PBS中の200（のCa ²⁺およびMg ^2+）。あるいは、ウサギポリクローナル抗OLIG2 1：1,000混合膠細胞培養におけるオリゴデンドロサイト特異的な正規化のために使用することができます。ウェルあたり250μLを収容するのに十分な第一の溶液を調製します。
3. 穏やかな軌道に振とうしながら16から18時間、4℃で一晩一次抗体をインキュベートします。
4. 一次インキュベーション溶液を吸引除去し、穏やかな軌道振盪しながら室温で（のCa ²⁺およびMg ^2+）のD-PBSを500μlで細胞を3×10分を洗います。
5. プレートを洗浄し、一方、抗マウス680及び抗ウサギ800抗体1を希釈することにより二次培養液を調製し、D-PBS中の500（のCa ²⁺ およびMg ^{2+）、5％NGS}を含みます。この溶液を調製する際に周囲光の露出を最小限に抑えます。
6. 最終洗浄を吸引し、二次インキュベーション溶液の250μlを添加します。光からプレートを保護し、穏やかな軌道に振とうしながら1時間室温で静置します。
7. 二次インキュベーション溶液を吸引除去し、穏やかな軌道振盪しながら室温で（のCa ²⁺およびMg ^2+）のD-PBSを500μlでウェルを3×10分を洗います。
8. 700 nmおよび800 nmの蛍光発光を検出することができる画像形成システムを用いてプレートをスキャンします。出発点として、MBPのための1.5から3と感度、アクチンのための5.0、およびOLIG2 3.5にフォーカスオフセットを設定します。信号露出オーバーを避けるために、必要に応じて感度値を調整します。
9. 半自動化されたソフトウェアベースの方法を使用してoligodendrogenesisの程度を定量化します。
   1. ソフトウェアを使用して、プレートの分析モードを「24ウェル」に設定し、Tの周りに円を揃えますスキャンされた井戸の彼外周。 「800」に正規化チャネルを設定し、700 nmの（MBP）と800 nmの（OLIG2 /アクチン）チャネルの合計と相対蛍光強度をエクスポートします。
   2. 相対蛍光単位で正規化されたMBP発現を与えるために800 nmでの強度で700 nmでの強度を分割します。反復測定の平均値を計算し、分析のために、必要に応じて日に0 + PDGFコントロールを表現するスケール。

結果

A2B5陽性のOPCは、磁気カラム分離システムを使用して陽性細胞の選択によって単離されます。単離手順の前に、全脳はP5とP7の間にあるラットの子から削除されます。全脳を正常頭蓋骨から取り外されると、嗅球および小脳微細手術用鉗子（ 図1A）を使用して除去されます。大脳皮質組織を単離するために視床下部、視床と中脳を慎重に解剖（ 図1B）によって切除されています。次に、海馬および線条体を折り曲げ手術用鉗子（ - D 図1C）を用いて除去されています。髄膜および血管系が除去されたときに分離工程を効率的に（ 図1E）髄膜および線維芽細胞を排除するが、酵素消化が改善されています。最後に、1ミリメートルのx 1mmの組織ブロックは、 図 （その後の組織解離工程のために用意されていますURE 1F）。

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、ラットのOPCを単離し、実験的な要因に応じて、 試験管 oligodendrogenesis に定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を記載しています。正の選択を使用して、実行可能な、純粋なOPCの高い収率を実験目的のために直接使用されています。この方法は、1週間の時間枠に分離、培養、および分化工程を合理化し、固定された細胞は、好都合には、アッセイ感度を損なうことなく数週間4℃で保存することができます。

スキャナベースの蛍光アッセイの主な利点は、データの収集および分析が大きく、従来のカメラベースの顕微鏡技術に対して促進されることです。顕微鏡がOPC分化のインデューサーを同定するためのハイスループットスクリーニングにおいて首尾よく使用されてきたが、それは目に画像キャプチャシーケンスのプログラミング、データ収集の数時間、数百の分析を必要とするため、データ収集は本質的に遅いです正規化または解析^18,19のための個々の細胞体を区別するための画像ファイル、およびユーザ定義のアルゴリズムousands。さら...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
解剖 材料
PBS Ca2+ および Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm ポリスチレン ペトリ皿	フィッシャーブランド	0857512
光解剖顕微鏡	Motic	SM2-168
解離材料
チューブローテーター	Miltenyi Biotec	130-090-753	解離チューブローテーター
神経組織解離キット (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	酵素解離キット
PBSとCa2+およびMg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm セルストレーナー	Corning	352340
A2B5 カラム精製
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	ビーズ結合 A2B5 抗体
LS カラム	Miltenyi Biotec	130-042-401	磁気選択カラム
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS Ca2+ および Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
ジメチルスルホキシ	ド Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
トリヨードチロニン	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
クレマスチンフマル酸塩	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
クエチアピン半フマル酸塩	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-アセチルシステイン	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
プロゲステロン	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
ポリ-L-リジン	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
プトレシン	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
亜セレン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
ヒドロコルチゾン	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-ビオチン	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
インスリン	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
アポ-トランスフェリン	Sigma-アルドリッチ	T1147	100 μg/ml
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg / ml
微量元素B	コーニング	25-022-CL	1x
B-27 サプリ	ライフテクノロジー	17504044	1x
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	ズ 15140122	1x
DMEM	ライフテクノロジー	ズ11995-065	1x
蓋付き24ウェルブラックVisiplate	Perkin Elmer	1450-605	組織培養グレード
免疫細胞化学および定量
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
マウスモノクローナル抗MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 希釈
ウサギポリクローナル抗アクチン	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 希釈
ウサギポリクローナル抗オリ2	ミリポア	AB9610	1:1,000 希釈
ヤギ抗マウス 680RD	Licor	926-68070	1:500
ヤギ抗ウサギ800CW	Licor	926-32211	1:500 希釈
Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウス	Life Technologies	A11032	1:1,000 希釈
Alexa Fluor 488 ヤギ 抗ウサギ	Life Technologies	A11008	1:1,000 希釈
Prolong Gold 退色剤 DAPI Life	Technologies	P36931
DPBS Ca2+ および Mg2+	>Corning	21-030-CV
Licor オデッセイ CLX 赤外線イメージングシステム	Licor