唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

サマリー

唾液腺の機能低下は、頭頸部放射線治療の大きな副作用であり、患者の生活の質を低下させます。動物モデルにおける新しい治療法の有効性の実証は、臨床移行前の前提条件です。このプロトコルは、ラット顎下腺のレトロダクト投与と局所照射について説明しています。

要約

放射線のポータル内にある正常な組織は、不注意で損傷を受けます。唾液腺は、頭頸部の放射線治療中にしばしば損傷します。回復不能な細胞損傷は、唾液機能の慢性的な喪失をもたらし、基本的な口腔活動を損ない、口腔感染症や虫歯のリスクを高めます。唾液機能低下とその合併症は、患者の快適さに深刻な影響を与えます。現在の症状管理は効果がなく、症状を緩和するための新しい治療法が必要です。

唾液腺は外分泌腺であり、排泄管を介して分泌物を口の中に排出します。これらのダクトのカニューレ挿入は、腺への直接アクセスを提供します。造影剤の主要な唾液腺へのレトロダクト送達は、画像診断のための日常的な外来患者の手順です。同様の手順を使用して、腺の局所的な治療が可能です。しかし、この手法を小動物を用いた前臨床試験で実施することは、独自の課題を提起します。この研究では、Bruce Baum博士の研究室(NIH)¹で改良された手順であるラット顎下腺への後戻り投与の技術について説明し、局所腺照射の手順を説明します。

概要

健康な組織の担保破壊は、癌治療の有害な副作用の数を占めています。放射線分野でうそをつく大唾液腺の一部または全部は、必然的に破壊されます。従って、骨髄移植の前頭部および頸部癌、子宮頸癌、リンパ腫、または全身照射のための放射線治療を受けている多くの患者は、放射線、唾液腺機能低下^2-6の最も一般的かつ永続的な副作用の一つを被ります。

唾液腺の流体生産腺房細胞は、放射線への急性敏感です。唾液腺の損傷は、唾液機能低下と呼ばれる状態を唾液の流れの大幅な逓減を引き起こします。唾液の流れにおける慢性の減少は、咀嚼、嚥下、スピーチ、そして味が、激しい痛み、粘膜涙、嚥下障害、日和見感染症の病的後遺症などの重要経口活動を阻害し、虫歯が悪化します患者の幸福と機能^2,3。

放射線治療関連の唾液細胞の損失は不可逆的であるため、口腔乾燥症のない矯正治療はありません。人工唾液代用とprosecretory薬で症状を和らげに焦点を当て現在の治療は長期の救済⁶には無効です。改良された放射線送達技術は、症状の重症度を減少させる助けているが、正常組織毒性とその合併症は、がん治療^6,7の制限要因のまま。放射線治療に関連する合併症を予防するための先制措置は、従って、標準になりつつあります。フリーラジカル酸素種を除去ラジオ保護剤、里親細胞再増殖、またはDNA修復を高めるためには、唾液機能低下^8-11を回避するために探索されています。

外分泌唾液腺の分泌物は、主排泄ダクトを介して口の中に排出します。目の口腔内挿管造影剤の注入のための電子排泄ダクトは外来処置として日常的に行われます。同様のアプローチを利用して、唾液腺に直接局所治療¹²の対象とすることができます。別に全身副作用のリスクを減少させるから、retroductal腺点滴は利益を追加しました。乳管ツリーの周りの唾液細胞の単層の配置は、すべての唾液腺上皮細胞をターゲットにすることを可能にし、不要な治療拡散を低減するための障壁として腺行為の繊維状のカプセル化。本質的には、唾液腺は、このような放射線誘発唾液機能低下などの腺苦痛の標的治療のために最適に適しています。

週間の期間のための - （2.5 Gyの/分数/日、5日の週1.8）癌治療のための従来の放射線が少量で提供されています。したがって、実験モデルにおいて長引く放射スキームに対する有効性を示している放射線防護の治療は、より大きな臨床ベアリングを持っています。 COMPRO分別放射線は小動物に記録されたが、放射線源、用量分画、および使用されるプロトコルは^9,10,13変化された後、唾液機能mised。

このレポートでは、患者関連の放射線源と線量分画を用いてラット顎下腺の放射線へのローカライズさretroductal送達のための方法を確立します。

プロトコル

すべての手順はLSU健康、シュリーブポート、動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理と使用のためのNIHガイドラインに従ってありました。

ラット顎下唾液腺の1カニューレ挿入

1. シリンジ-チューブアセンブリの調製
   1. メスでPE10ポリエチレンチューブの10cmの長さをカットします。人差し指と親指の間のチューブの両端を持ちます。穏やかな炎上記チューブの中央部分を熱し、ゆっくり両側を引っ張ることにより、その長さを倍増させる軟化チューブを伸ばします。
   2. 先細端部と各- 2カニューレを取得するために45 ^Oの角度でメスで途中でチューブをカットします。 0.5ccのインスリン注射器の29 Gの針の上にフィットさせることによって、カニューレの非テーパ状の端部を展開します。
   3. カニューレを外し、シリンジに生理食塩水の220μLを描きます。気泡を取り除くために、タップします。 cannulを取り付け針の上に、そして空気を排出し、カニューレを介して、溶液の自由な流れを確保するために、シリンジのプランジャーを押してください。 200μlに音量を調整します。
2. 顎下腺ダクトの口腔内カニューレ挿入
   注：オートクレーブ楽器は手続きの前に、ホットビーズ滅菌器の手順の間に、滅菌します。
   1. スプラーグドーリーラットを計量し、皮下注射器で計算されたケタミンの量（42 mgの/キログラム）/キシラジン（8mg / kg）/アセプロマジン（1.4ミリグラム/キログラム）のミックスを分注します。
   2. 人差し指の間尾と片手の親指の付け根を把握し、それを把握するために身体の上にもう一方の手をスライドさせることにより、動物を拘束。親指と残りの指で胴体を保持しながら、頭部の側面に沿って人差し指と中指を立てます。
   3. 後肢の筋肉組織に麻酔薬を注入します。つま先のピンチと眼瞼反射によって麻酔の深さを確認してください。乾きしばらくのを防ぐために目の潤滑剤を塗布動物は麻酔下です。
   4. 特別に設計されたプラットフォーム（ 図1）に動物を置き、横バーの上側切歯に係合します。下の切歯の周りにゴムバンドをループし、プラットフォームにそれを固定することにより、下顎をプルダウン。
   5. 舌を通して滅菌縫合糸を渡し、口の床を上げるためにそれを持ち上げます。止血鉗子で縫合糸をクランプ、および横方向のバーの上にそれを渡します。
   6. カスタムビルドの頬スプレッダー（ 図1）と頬を展開し、解剖顕微鏡下で、口の床の上に舌下乳頭を探します。
   7. 繊細な鉗子を用いて行うPE10チューブのテーパ状の端部をつかみます。そっと舌下乳頭上の腺管開口部にカニューレの先端を操作します。それは3ねじ込むことによって、カニューレの配置を確認してください - ダクトに5ミリメートルを。それは、任意の障害物なしに通過することを確認してください。
3. 顎下腺Instillation
   1. 首筋に皮下アトロピン（0.5ミリグラム/キログラム）を注入し、唾液分泌の減少のために10分を待ちます。
   2. シアノアクリレート（接着剤）の低下にダクト開口部にカニューレを固定し、乾燥させます。ゆっくり〜50マイクロリットル/分の速度でシリンジプランジャを押して腺（200μL/腺）溶液を植え付けます。
   3. 止血鉗子でチューブをつぶす、と慎重に注射器を取り外します。動物が意識を取り戻すまで60分 - 30用のダクト内チューブを保持します。舌を保持している縫合糸を外します。
   4. 別々のケージに動物を移し、リカバリ中にそれを暖かく保つために加熱ランプを使用しています。それは胸骨横臥を維持するために意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
   5. 動物が完全に歩行した後、食物および水に無制限にアクセスできるビバリウムでそれを収容します。

2.ローカライズ分割照射顎下腺の

1. 前述したように動物を拘束し、後肢でケタミン（33 mgの/キログラム）/キシラジン（6ミリグラム/キログラム）/アセプロマジン（1ミリグラム/キログラム）ミックスの筋肉内投与で麻酔。麻酔の深さを確認し、目に潤滑剤を塗布。
2. 線形加速器卓上に動物仰向けに置き、頭を傾けることによって、その首を拡張します。胸骨の上部に下顎骨の下縁からの領域を包含するように照射野（3センチスリット幅）をコリメートします。
3. 領域の上に1cmの組織等価ボーラスを配置し、放射線源100センチボーラスの頂部との間の距離を調整します。
4. 線形加速器の6 MV光子ビームを用いて動物（2.5 Gyの）を照射します。線量率、視野サイズ、及び放射線源からのボーラスの表面までの距離は、露光時間を決定するであろう。現在のセットアップでは、動物は約1グレイ/分の線量率で照射しました。
5. 露出を繰り返します。 2.5 Gyの/ 8日目の合計日々;間で2日間隔で4日/週。リカバリ中に動物を暖かく保ちます。それは完全に歩行した後に飼育箱に動物を転送します。
6. 腺機能^14を測定するために、8週間照射後刺激顎下腺の唾液を収集します。冷たい4％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水のpHが7.2の心臓灌流によって麻酔下で動物を安楽死させます。組織学的および免疫組織化学^14を分析するための顎下腺を摘出。

結果

低侵襲性唾液腺撮影技術、大唾液腺の局所治療を適応させることが可能です。ラット顎下唾液腺におけるRetroductal投与はウォートンのダクトの口腔内挿管（ 図2）により実行しようとしました。ウォートンの唾液管は、口の階にある舌乳頭に開くが、オリフィスは容易には見えません。カニューレの挿入は、従って、穏やかなプロービングすることによって行いました。カニューレを配置しながら厄介な出血やダクトの穿孔を避けるために、何の力は使用しませんでした。ダクト内のカニューレの滑らかな抵抗無通路は、チューブを穏やかに前後に移動することにより確認しました。

最初の実験の間にカニューレ挿入は（図3）、ヘマトキシリンまたはトリパンブルー溶液を用いて腺を注入し、安楽死させた動物において腺染色を評価することにより確認しました。 GLそしてボリュームが摘出腺における乳管ツリーの染色を可視化することにより確認した埋めま...

ディスカッション

唾液腺は、多くの場合、頭頸部癌、首ノードの選択科目切除、または地域の血液悪性腫瘍に対する放射線治療を受けた患者における組織回復のしきい値を超えた放射線量を受けます。腺の流体を分泌する腺房細胞が最終的に分化しているが、それらは逆説的に放射線に敏感です。分泌機能は、放射線の最初の数週間以内に低下し、慢性低唾液出力の不可逆的な腺の損傷をもたらします。貧しい腺機能とすさまじい口腔乾燥に対抗するために、保存または分泌機能の回復は非常に重要です。小説から保護または放射線損傷を修復する治療法が^1を検討されている^{、8-11、16-20。}

治療の全身投与は、非標的組織における望ましくない影響の固有のリスクを運びます。唾液腺へ向けた配信は、このリスクを減少させます。 Retroductal遺伝子治療は、予防またはに有効です放射線関連唾液腺苦悩^{​​1、9-、11、16,17,20を}改善。しかし、同じ技術を使用して、唾液腺はまた、異所性、タンパク質を発現および分泌するように再設計することができます。唾液腺細胞における基底内分泌分泌経路を利用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Intramedicポリエチレンチューブ(PE10)	ベクトンディクソン	427401
1/2 ccインスリンシリンジU-100	クトンディクソン	309306
人工涙液	ミラー獣医供給	5098-9840-64
ホットビーズ滅菌器	ファインサイエンスツール	18000-45
パーマハンドシルク縫合	エチコン	K833H
グレーフ鉗子	ファインサイエンスツール	11051-10
リンパスSZX16実体顕微鏡	ハント光学とイメージング
6 MV線形加速器	エレクタ
ボーラス - スキンレス	シブコ	MTCB410
ヒートランプ	ブレインツリーサイエンティフィック	HL-1 110V

ベ糸オ