タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

サマリー

細胞内レベルでは、シグナル伝達イベントは発生的および環境的な手がかりによって動的に調節されます。ここでは、タバコの一過性発現システムを使用して、動的なタンパク質間相互作用を監視し、植物細胞におけるシグナル伝達の空間的構成を明らかにするプロトコルについて説明します。

要約

生きた細胞内での動的なシグナル伝達イベントの可視化が課題でした。我々は、植物細胞内でのシグナル伝達の空間的な分布を監視するタンパク質 - タンパク質相互作用を試験から、タバコ表皮細胞における生体分子蛍光相補性（BIFC）アッセイを確立した一過性発現系を拡大しました。このプロトコルでは、我々は相互作用し、 シロイヌナズナ MAPKKK YODAとMAPK6との間のシグナリングは、原形質膜で起こることを示すためにBIFCアッセイを使用しました。足場タンパク質のBASLを共発現させた場合、YODA-MAPKの相互作用は、再分配と空間的にCFP-BASLとの共偏します。この修​​正されたタバコの発現システムは、ローカリゼーションおよび動的な変更（4日未満）と蛍光タンパク質の色（少なくとも3）の倍数に対応することができるシグナル伝達の迅速な検査を可能にします。我々はまた、タンパク質の分布（非対称の空間的局在性、または「分極」を定量化する詳細な方法を提示し;）タバコ細胞インチこの高度なタバコ発現系は、生植物細胞の動的シグナリング事象の迅速な試験のために広く使用される可能性を有しています。

概要

タンパク質は、予測不可能な細胞環境で発生するほぼすべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たして複雑な階層型ネットワークとフォーム複合体内で相互作用します。しかし、成長の応答に対する植物の開発から、だけですぐにも効率的に細胞内レベルでこれらのダイナミックシグナル伝達事象を認識し、モニターすることができない便利なツールの欠如がありました。

タバコ葉表皮における一過性タンパク質発現システムは、生細胞内で蛍光タンパク質を可視化するための利点を訴えています。このシステムは、翻訳後タンパク質修飾とタンパク質の局在の迅速な検査を可能にする半in vivoでの条件を提供します。補完YFP信号を検査することによって、二分子蛍光相補性（BIFC）アッセイは、植物細胞内でのタンパク質 - タンパク質相互作用の可能性を通知します。他の方法に比べて、 例えば、酵母2ハイブリッド（Y2H）と共同-immunoprecipitation（共同IP）、BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用は、細胞内レベルで発生する可能性があるコンパートメントを可視化する強力な手段を提供します。

非対称細胞分裂（ACD）は、組織/器官の形成のための新たな細胞型の生成中に細胞集団を幹維持するので、真核多細胞を促進するために不可欠な機構である。 シロイヌナズナ気孔発生は、植物にACDを研究するためのモデルシステムとして用いられてきました。前駆細胞、メリステモイド母細胞は、二つの異なる娘細胞を生成するために非対称的に分割し、メリステモイドは（ガード細胞のペアに終了する前に、細胞様の分裂幹受ける）と気孔系統の地上セル（SLGC）は（分裂と分化することができます舗装細胞）、それぞれ（ 図1）。気孔ACDでは、気孔系統における非対称の新規タンパク質のブレイキング（BASL）は分割非対称性を駆動するためにpremitotically偏光されて、どの株式会社リュド物理的な非対称性および細胞運命非対称性^1。 MAPKKK YODAとのMAPK、MPK3と6から成るMAPKカスケードは、気孔分割パターニングと運命の採用^2,3、4,5のための中心です。

最近、Zhang ら 。 ACD ⁶気孔シロイヌナズナのYDA-MAPKシグナル伝達経路への極性タンパク質BASLをリンクされています。標準的なYODA-MAPK経路は、MPK3 / 6を通じて、BASLをリン酸化し、その偏光を活性化させます。足場としてリン酸化BASL機能やタンパク質複合体を形成し、細胞表層⁶でシグナリングを集中するYODA（YDA）とMPK3 / 6を募集しています。 MAPKコンポーネントとBASLとYDA-MAPK経路の間に正のフィードバックループの偏光は、植物細胞中のタンパク質の偏光のための新規メカニズムを表します。局所的に濃縮されたMAPKシグナル伝達は密接に気孔ACD ^6（ 図1）における細胞運命の分化にリンクされると仮定されています。 kの一つこのモデルをサポートEY実験データがBASL ⁶の発現により誘導されたMAPKの空間的な再分配を実証したタバコアッセイから来ました。

MAPK分子は、しばしば、細胞の内部にどこでも発見されたため、MAPKシグナル伝達が起こる場合、一般的には、監視することは容易ではありません。本研究では、シグナリングリレーが発生する場所を示唆するために、上流キナーゼおよび下流のものとの間の相互作用を可視化するために、分割YFPシステムを利用しました。我々はさらに、どのように補完YFPが空間的に共同によって変調することができるかどうかを可視化する（タンパク質 - タンパク質相互作用を示唆する）、分割YFPペアと第3のタンパク質を（CFPタグ付き）を共発現することによりBIFCシステムの使用を拡張しましたCFPタンパク質を発現しました。そうすることによって、我々はタバコ表皮の細胞表層で偏パターニングに均一な分布からYDAとMPK6、間の相互作用の空間的な再編成を誘導されたCFP-BASLの共発現を示しましたら細胞。このシステムは、したがって、細胞は、内部または外部刺激（ 例えば、他のタンパク質の同時発現、化学的応用、病原体攻撃または環境の変化などによりチャレンジされたときの条件の下で、植物細胞中で動的シグナル伝達事象を監視するために開発される可能性があります。 ）。

プロトコル

1.プラスミド構築

1. 以前に^1,6に記載^{されている}ような技術をクローニングすることによって構築物を生成します。
   1. 最初BASLのコード配列を増幅するために適切なプライマーを用いた高忠実度DNAポリメラーゼを使用し、YDAとMPK6とエントリーベクターにそれらをサブクローン。 ⁷での詳細なプロトコルを検索します。
   2. MPK6とYDAのドミナントネガティブバージョン（DNmpk6 ⁸とDNyda ^4、それぞれ）を生成するには、テンプレートとしてMPK6とYDAのエントリープラスミドを使用して、部位特異的突然変異誘発法⁹により、点変異を導入します。
2. タバコ一過性アッセイのための構築物を構築するには、pH35CG ¹⁰にBASLを統合するために、標準的なLR（attL部位のx attRの組換え）の反応^（7における詳細な手順を）行い、pXNGWとpXCGWにDNydaとDNmpk6はそれぞれ^{、11ベクトル} 。
   1. 酵素消化と配列決定によって得られたプラスミドを確認してください。一度です3日- uccessful、GV3101 ^12株と2 28℃で選択プレート上で生育するアグロバクテリウム・ツメファシエンスにバイナリー構築物を形質転換します。

アグロバクテリウム浸潤液の調製

1. 構築pH35CG、pXNGWとpXCGW用を100μg/ mlのルリア-ベルターニ（LB）適切な抗生物質を含む培地10mlに、いくつかの新たに形質転換されたアグロバクテリウムのコロニーを接種する（ゲンタマイシンを25μg/ mlで、リファマイシンを25μg/ mlで、スペクチノマイシン、同じ濃度P19のためのカナマイシンを50μg/ mlのゲンタマイシン及びリファマイシン（トランスジェニックサイレンシングに対してタンパク質を発現する^）13の。
2. 約16時間、200回転の速度で28℃のシェーカーでアグロバクテリウム培養液を成長した後、OD _600（1.5達する見込み- 1.8）を測定する（ 図2A-B）を 。 10分間、2500×gでの文化をスピンダウン。再懸濁し、WAMgCl ₂ 10mMの（浸透液）で細胞ペレットをshに。
3. 最終OD ₆₀₀ = 0.5（ 図 2C-D）に到達するために、再度の文化をスピンダウンし、浸透液の適切な量の再懸濁ペレット。 3時間 - 植物を浸潤する前に、1、室温での細胞の混合物を残します。この工程は、細胞の恒常性を維持するのに役立ちます。

3.タバコ工場、リーフ・インジェクション

1. 葉注射のために（16時間光/ 8時間暗のサイクルで23°C）標準植物成長チャンバー内で5週齢の^14から4成長タバコ植物（ ベンサミアナタバコ）を 、使用してください。
   注：この段階では、タバコ植物は、典型的には6葉（2大、2培地、および2小）を有します。 2中型の葉は葉の注入（二つの小さなものは、多くの場合、あまりにも若いうち二つの大きなものは、あまりにも古いです）のために最も最適です。
2. 浸潤の日の前に、水tobac共同植物は土壌を飽和させます。
3. 3時間 - 浸潤の日に、1のために暗闇の中で植物をプレインキュベートします。このステップでは、葉の表皮細胞内に浸透するとき大幅にアグロバクテリウムを容易にする、表皮内の気孔が広く開くことができます。
4. 日付で標識された色のテープを使用して、潜入する葉にフラグを設定。マーク黒の太いシャーピーで浸潤する分野（オプション;浸透した領域が感染された後に表示されています。）。
5. アグロバクテリウムの再懸濁液の等しい体積を取り、穏やかに旋回（ 図2E）によって100×15ミリメートルペトリ皿にそれらを混ぜます。注：私たちのケースでは、我々はDNmpk-cYFPのCFP-BASLの1ミリリットル、DNyda-nYFPの1ミリリットルと1ミリリットルでのp19の1ミリリットルを混合しました。
6. 浸潤の過程では、浸潤混合物で3ミリリットルの無針注射器を埋める（1〜2ミリリットル）およびタバコの葉の下側（背軸）（ 図2F）に押し込みます。浸潤が、それは便利ですプッシュする一方の手を使用すると、他の手は優しく（押圧力に抗して、向軸）上側をサポートします。
   注：浸潤混合物が正常に注入されると、感染した領域は表皮に容易に認識になります。しかし、浸潤が原因で、過酷な注入（組織損傷）又は不十分なプッシュ（無液体の浸透）に失敗することがあります。各試験のために、我々は、（異なる植物からの）は、2つの独立した葉の中の少なくとも2回の注射を示唆しています。
7. バック成長チャンバ内に感染した植物を置きます。一般的に、タンパク質発現は、浸潤、次の48時間後に検出可能です。

4.共焦点イメージング

1. （ - 4ディスク/領域を製造することができる通常3）（ 図2G）48時間後の浸潤では、注入された領域からリーフディスクを切除するために穴パンチャーを使用します。静かにスライド（上向きの背軸側）にリーフディスクを転送し、水滴でそれらをマウントするためにピンセットを使用してください。あまりにもHAR押す避けてくださいカバースリップ上のdが絞ら/損傷を受けた細胞は、共焦点顕微鏡（ 図2H）の下でうまく表示されませんので。
2. 共焦点イメージングの前に、発現レベルを確認するために、エピ蛍光化合物顕微鏡に搭載されたサンプルをスキャンします。注意：私たちの経験に基づいて、中間の発現レベルを示す細胞が最高の共焦点顕微鏡下で表現されます。
3. 共焦点顕微鏡上の40X（NA 1.3）レンズを開始します。蛍光タンパク質の培地レベルを発現する細胞が中心に残るように任意の位置にスライドを調整します。それぞれ540 nmの、 - 500 nmおよび514 nmの/ 520 - CFPとYFPの励起/発光スペクトルは、458nmで/ 480です。
4. レーザー強度と最もバランスのとれた蛍光強度/ノイズ比のためのスマートゲインを調整後、画像をプレビューする「ライブ」ボタンを有効にします。結像品質を改善するために、走査画素および/またはフレーム/ライン平均値を増加させます。最後に、REAに焦点調節ノブを調整chの中央値は焦点面とは、画像を撮影するために、「取得」をクリックします。
   注：CFPとYFPの画像は、それぞれ、「順次」走査モードのオプションをオンまたはオフチェックすることにより、連続的にまたは同時に捕捉することができます。
5. Z投影が「XYZ」の撮影モードを選択し、セルの詳細なビューのために所望される場合、走査範囲の深さを定義する（10 - は15μm）にし、標的細胞の上から下へ画像を収集。 .TIFFファイルとして選択し、「名前の変更」に画像ファイルを右クリックして、ライカのソフトウェアで得られた画像をコンパイルし、輸出画像。
6. 画像30 - 定量分析のための40の細胞。

5.画像処理および定量分析

1. 画像を処理し、定量を行うためにフィジーソフトウェア（http://fiji.sc/Fiji）を使用します。
   1. 蛍光強度のグラフをプロットします。
      1. より良いCFP / YFPの発現があるかどうかを視覚化するために、均一に分布し、細胞周囲に沿ってCFPとYFPの信号強度を示すためにフィジーを使用しています。これを達成するために、最初のイメージを起動するには「ファイル」と「開く」を選択し、フィジーを起動します。ツールメニューの「行」をクリックし、右クリックして「セグメント化された行」を選択します。関心領域を決定し、CFPまたはYFP信号（ 図3A-C）をトレースする細胞周辺に沿って線を引きます。
         注：フィジーは、セグメント化された線に沿って、絶対蛍光強度値を測定します。
      2. セグメント化された線に沿ってCFP / YFPのレベルを表す位置と強度値でグラフを生成するには、ドロップダウンメニュー「分析」と「プロット・プロファイル」を選択します。必要であれば、同等の強度のグラフを生成するために、Excelや他のグラフィックソフトに（メニュー「コピー」を選択することで）強度値を複製します。
   2. 極性の程度を定量化。
      1. 約20 represenを収集3回の反復実験からtative細胞はタバコ細胞でのCFPとYFPの極性度を評価しました。 （Lとして定義される）低い蛍光強度を超える（Hとして定義される）高い蛍光強度の比に基づいて、極性度を計算します。注：定量方法は、図3で説明されています。
         1. HとLの値を測定するには、「測定」をドロップダウンメニューから「分析」して、[選択]をクリックし、（上記の）細胞周辺での関心領域に沿ってセグメント化された線を引きます。 「結果」ウィンドウがポップアップ表示された場合、値が定量化を行うために「平均」を使用します。
         2. CFPとYFPの比較的均一な発現を示す細胞から、 例えば 、CFP-BASL（ 図3A）またはYFPがDNyda-nYFPとDNmpk6-cYFP（ 図3B）の共発現から補完、測定することにより、HとLの値を取得2はランダムに同じ長さで、周辺のセグメントを選択しました。
         <李>は、この場合には、蛍光タンパク質の明白な極性蓄積を示す細胞から、CFP-BASL、DNyda-nYFPとDNmpk6-cYFP（ 図3C）、の共発現は、濃縮された蛍光信号と周辺領域からH値を収集しますおよび低/無蛍光の蓄積と地域からLsを。
         3. 20細胞を一緒正規分布のための試験からのH / Lの結果の比率をプール。 （正規分布の場合） スチューデントのt検定によりp値または（非正規分布の場合）コルモゴロフ-スミルノフ（KS）テストを計算します。

結果

過活動MAPKシグナル伝達によって誘導される細胞死を防止するために、YDA（DNyda）及びMPK6（DNmpk6）のキナーゼ不活性バージョンは、タバコ細胞における共発現アッセイに使用しました。 BIFCによって明らかになったDNydaとDNmpk6の間の相互作用も、CFP-BASL自体はいずれも、不均一な分布パターン（ 図3A-B）を生成しました。 CFP-BASLがDNyda-DNmpk6の相互作用ペアに導入したときただし、CFPとYFP信号の両方を高度に分極方法（ 図3C）に再分配されました。この再分配はBASLが空間的に植物細胞におけるMAPKシグナル伝達経路を再編成するYDAとMPK6と相互作用することを示唆しています。リン酸欠乏のバージョンが弱い活動^6を示した一方で、非常に強い極性生成BASLのリン酸化模倣バージョン：BASLのリン酸化状態は、MAPKシグナル伝達の極性度の差動影響を与えます。これらのデータは、当社の作業モデルをサポート BASLと細胞極性^6を<...

ディスカッション

一般的な使用およびシグナル伝達のためのタバコ一過性発現系の可能な修正：蛍光タンパク質の過剰発現（FP）が正常に植物細胞内でタンパク質の細胞内局在の高速検査に使用されてきたタバコの表皮中のタンパク質をタグ付き。しかし、 植物体中のタンパク質複合体の動的シグナリング分布を研究することは、複雑な細胞内のコンテキスト、一過性のタンパク質-タンパク質相互作用およびシグナル伝達イベントに挑戦し話題です。この課題に対処するために、我々はMAPKシグナル伝達事象を調べるためにBIFCシステムを利用しました。共発現YDA-nYFPとMPK6-cYFPすることにより、回収されたYFP信号は、MAPKシグナル伝達リレーの活性化は、原形質膜で発生する可能性があることを示しました。

これは、蛍光シロイヌナズナでYDAとMPK6をタグ付けし、 生体内でのシグナリングダイナミックMAPKを検討することを共発現することが理想的です。しかし、GEトランスジェニック植物をneratingは、複数の構築物が所望される場合は特に、時...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Phusion DNAポリメラーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL 部位特異的変異誘発キット	アジレントテクノロジー	200521
LBブロス	アムレスコ	J106-2KG
バクト寒天	アムレスコ	J673-1KG
ゲンタマイシン	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm スライド	VWR	16004-382
24 x 50 mm カバーガラス	VWR	48393-241
レーザー走査型共焦点顕微鏡	ライカ	TCS SP5 II LAS	AF Lite software
40X 対物レンズ	Leica	HCX APOの計画	HCX プランAPO、NA 1.30
遠心分離機	Thermo Scientific	SORVALL 6 +
穴あけ器	ステープル
50mlファルコンチューブ	Genesee Scientific	21-108
No. 5鉗子	Canemco &マリバック	205EQA-Spec