私たちは、分裂酵母の性的なライフサイクルの長期顕微鏡検査のための再現可能な基本的な方法を提供します。説明されているわずかな調整で、提示されたプロトコルは、生殖プロセスのさまざまなステップに研究の焦点を当てることができます。
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この記事について
サマリー
要約
分裂酵母Schizosaccharomyces pombeは、有糸分裂細胞周期の進行の調節、細胞分裂のメカニズム、細胞極性を研究する上で非常に貴重なモデルシステムとなっています。さらに、その有性生殖に関する古典的な実験は、DNA組換えと減数分裂の現在の理解にとって極めて重要な結果をもたらしました。分裂酵母の交配に関する最近の解析では、外因性刺激応答メカニズム、分極した細胞増殖、細胞間融合について興味深い疑問が提起されています。これらのトピックを詳細に研究するために、性的ライフサイクル全体の顕微鏡観察のための簡単なプロトコルを開発しました。ここで説明する方法は、特定の交配段階を研究するために簡単に調整できます。簡単に言うと、窒素が豊富な培地で指数関数的な段階まで増殖した後、細胞培養物は、調査される性的ライフサイクルの段階に適した期間、窒素を欠いた培地に移されます。その後、細胞は、イメージングのために、簡単に構築できるカスタムのアガロースパッドチャンバーにマウントされます。このアプローチにより、交配の開始から胞子の最終的な形成まで細胞を監視できます。
概要
2セル間の遺伝子交換が有性生殖で中央イベントですが、それは細胞の分化を促進する一連のイベントに依存して、相手の選択を可能にする、細胞 - 細胞融合を行い、ゲノムの安定性を維持します。したがって、性的ライフサイクルが発達スイッチに関する生物学的な質問の数を研究するためのモデル系としての地位を提示し、分裂酵母、これらの現象を研究するための性周期を探るなど 、外因性の刺激、形質膜融合、染色体分離、に対する応答はのメリットをもたらしますモデル系の強力な遺伝学、十分に確立された高スループットのアプローチと洗練された顕微鏡。分裂酵母でのセックスは、異なる交配型のP-細胞およびM-セル間の異イベントです。 2つの細胞型は、示差分泌P-の生産のためのものと、M-フェロモン、フェロモン受容体MAP3とMam2だけでなく、フェロモンプロテア含む遺伝子1,2の数を表しますSES Sxa1とSxa2。このような一般的に使用されるH90株とホモタリック株は、交配単一ゲノム内の型と細胞の両方のための遺伝情報を運ぶ（参考文献3に概説されている）有糸分裂のライフサイクルを通じて交配型スイッチングの複雑なパターンを受けます。まれまたは決して交配型を切り替えない異体性の分裂酵母の複数の分離株は、一般に、H + N（P型）と時間 -S（M型）株最も顕著に、4を
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プロトコル
分裂酵母有性生殖の顕微鏡分析
1.メディアの準備
- グルコース：を10g / L、KH 2 PO 4：1 G / L、NaClを0.1グラム/ L、 硫酸マグネシウム・7H 2 O 0.2グラム/最小胞子形成培地（MSL-N）15は、以下の成分を混合することによって調製しますL.追加微量元素（10,000倍）：100μL/ L、ビタミン（1,000倍）：1ミリリットル/ L、および0.1 MのCaCl 2 ミリリットル/ L。室温（RT）で0.22μmの細孔サイズのフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
- パントテン酸：1グラム/ L、ニコチン酸：10グラム/ L、イノシトール：10グラム/ L、ビオチン：10 mg / Lで、次のビタミン（1,000倍）の株式を使用してください。 4℃で0.22μmの細孔サイズのフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
- ホウ酸：5グラム/ L、のMnSO 4：4グラム/ L、のZnSO 4・7H 2 O：4グラム/ L、のFeCl 2・6H 2 O：2グラム/ L以下の微量元素（10,000倍）の株式を使用してください、....
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結果
窒素源を除去すると分裂酵母の成長と交配ダイナミクス
窒素飢餓が分裂酵母における有性生殖の開始のための前提条件であるように、野生型ホモタリックH90株を、 図1に概説したプロトコルに従って、窒素欠乏培地に窒素リッチからのシフト（ 図2）上にモニターした。簡単に説明すると、細胞最終OD 600 = 1.5になるまで洗浄し、MSL-N液体培地に再懸濁し、回収し、MSL + N培地で対数期（OD 600 = 0.5）にO / Nを成長させました。細胞の2時間毎のアリコートは、カルコフロール染色および画像化した（ 図2A - D）。
カルコフロア染色（ 図2A）、窒素リッチ培地中で〜の細胞の.......
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ディスカッション
環境条件、特に栄養利用は、強く分裂酵母の生理機能に影響を与えます。窒素飢餓は、有性生殖へのコミットメントのために必要であると最初に分裂細胞周期の進行（参考文献21および図2）での印象的な変化をもたらします。指数関数的に増加する人口からの窒素除去の際に、部門のセルサイズは急速に（ 図2C）減少し、細胞の大部分は、新たに生まれた指数関数的に増殖した細胞（参考文献21および図2D）の長さよりも短い有糸分裂の進行を逮捕します。反対の交配型の細胞が有糸分裂の進行を逮捕ように、彼らはパートナーを交配従事し、接合体と胞子形成（ 図2B、2E、2F）を形成するために進んでください。野生型細胞の二次元単層の場合には、H90細胞の60以上％がパートナーと係合する、ほ ぼすべての細胞融合（ 図2Gを受けます）。接合効率は異体性の菌株の混合物で若干低いと細胞の密度およびそれらの相対的な位置（
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
AVはEMBO長期ポスドクフェローシップによってサポートされていました。マーティンラボでの研究は、SGMにERCの起動許可（GeometryCellCycle）とスイス国立科学財団の助成金（31003A_155944）によって運営されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グルコース | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| パントテン酸 | AppliChem | A2088,0025 | |
| ニコチン酸 | AppliChem | A0963,0100 | |
| イノシトール | AppliChem | A1716,0100 | |
| ビオチン | AppliChem | A0967,0250 | |
| ホウ酸 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | シグマ-アルドリッチ | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| 酸化モリブデン (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| クエン酸 | AppliChem | A2344,0500 | |
| アガロー | プロメガ | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | メルク | 1.01217.1000 | |
| L-ロイシン | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| アデニン半硫酸塩、ミニ 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| ウラシル | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| ラノリン | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| ワセリン | Reactolab | 92045-74-4 | |
| パラフィン | Reactolab | 7005600 |
参考文献
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O.
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再版と許可
