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方法論記事

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

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DOI:

10.3791/53833

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2016年5月4日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

この記事について

サマリー

アルカリ彗星アッセイは、真核細胞のDNA鎖切断を測定します。エンドヌクレアーゼIIIまたはヒト8-オキソグアニン-DNA-N-グリコシラーゼ消化ステップを追加することで、アッセイは酸化的DNA損傷を効率的に検出できます。これらのアッセイを使用してラット肝臓のDNA損傷を検出する方法について説明します。

要約

修復されていないDNA損傷は遺伝的不安定性を引き起こし、それが癌の発症を促進する可能性があります。したがって、潜在的なDNA損傷物質を特定することは、公衆衛生を保護するために重要です。鎖が切断されるときにDNA損傷を検出するin vivoアルカリコメットアッセイは、その応答が化学物質のin vivo吸収、組織分布、代謝および排泄(ADME)、およびDNA修復プロセスを反映するため、生体異物の遺伝毒性ハザードの評価に特に関連性があります。他のin vivo DNA損傷アッセイと比較して、このアッセイは迅速で、感度が高く、視覚的で安価であり、特定の修復酵素を使用して酸化的DNA損傷を鎖切断に変換することにより、アッセイは効率的かつ比較的アーチファクトのない方法で酸化的DNA損傷を測定できます。コメットアッセイによるDNA損傷の測定は、急性および亜慢性の毒性研究デザインを使用して行うことができ、コメットアッセイを他の毒性学的評価と統合することにより、アッセイは動物資源を最大限に活用することにより、動物福祉の要件に対処します。アッセイのもう一つの大きな利点は、少量の細胞しか必要とせず、細胞が増殖する細胞集団に由来する必要がないことです。アッセイは、臨床的または職業的に曝露された個人から得られたさまざまなヒトサンプルを使用して実行することもできます。

概要

アルカリ性コメットアッセイは、単一細胞レベルでDNA鎖切断を測定します。単一細胞の懸濁液を、顕微鏡スライド上のアガロース中に埋め込まれており、細胞がDNAのスーパーコイルループを含む核様体を形成するために溶解しました。陽極に向かって移動するDNAの解放された鎖と、鎖の切断を含むDNAループ内の超らせんの損失のpH> 13の結果で電気泳動、蛍光顕微鏡で観察することができる彗星のような構造を作成します。断片化されたDNAは、DNAの破壊1を定量するために使用することができるフラグメントの大きさ、および全強度（頭部および尾部）に比べコメットテールの相対的な蛍光に基づく「テール」に彗星の「ヘッド」から移行します、2。アッセイは、単純な敏感な、汎用性の高い、迅速、かつ1比較的安価です。 DNA損傷物質によって引き起こされる断片化したDNAの検出は、細胞内のDNA損傷を定量化するためのアッセイを使用するか、またはから核を分離されているがindivi潜在的に遺伝毒性物質（複数可）で処置した動物のデュアル組織。 、その利点に、in vivoでのコメットアッセイは、現在の調和国際会議（ICH）3および欧州食品安全機関（EFSAにおける製品安全性評価を行うために（in vivoの小核試験と対になる）は、第2のin vivo遺伝毒性アッセイとして推奨されます）4規制ガイドライン。私たちの研究室では、食品成分、医薬品、およびナノ材料5-10により誘発される生体内のDNA損傷を評価するためのアッセイを採用しています。ラット肝臓は、このプロトコルの例として使用されるが、コメットアッセイは、実験動物の他の組織/器官限り、組織から単離することができる無傷の単一細胞で行うことができます。

DNA損傷の特定のタイプは、基本的なアルカリ性コメットアッセイを変更することなく、DNA鎖切断のように検出することが困難です。酸化的DNA損傷の場合には、ストランドBreaksは、8-オキソグアニン（8-oxoGua）で休憩し、メチルfapy -グアニン11を作成し、人間8-オキソグアニン-DNA-N-グリコシラーゼ1（hOGG1、などの修復酵素で消化することによりDNAに酸化的損傷で作成することができます。また、エンドヌクレアーゼIII（遠藤III）を酸化さピリミジン1で主に切断を生じる。したがって、酵素消化工程の追加アッセイをインビボ 12 に酸化的DNA損傷を測定するための特異的かつ高感度の方法を行う。これらのアッセイを利用して、我々は実証しましたラットとマウス6-8の肝臓におけるラット10の中心部にある毒物誘発性酸化的DNA損傷。

in vitroで敏感で識別される遺伝毒性物質のためのインビボアッセイにおけるフォローアップが3,13をテストとして1）、2）複数の組織における生体異物によって誘発されるDNA損傷のメカニズムを評価する：アルカリコメットアッセイは、遺伝毒性と人間のバイオモニタリングで多くのアプリケーションを持っています14、3）かどうかを調べるため発癌物質は、4）、5）は、ヒトの疾患および職業暴露16を調べ、そしてするDNA損傷の修復15を評価するために、遺伝毒性または作用の非遺伝毒性モード（MOA）7を使用して動作6）のための潜在的なハイスループットスクリーニングアッセイとして臓器特異的な遺伝毒性17。

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プロトコル

倫理文：動物が関与する手順は、毒性学研究のための米国FDA /ナショナルセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

注：ここで説明する研究デザインは、インビボげっ歯類アルカリコメットアッセイ18の彼らの検証のための代替法検証のための日本語センター（JaCVAM）によって開発されたプロトコルに基づいて、さらにOECDガイドラインTG489 19の勧告に基づいて修正されます。

1.準備

  1. スライドの準備
    1. 電子レンジで加熱することにより、リン酸緩衝液中（のCa 2+、Mgを2+遊離およびフェノールレッドを含まない）（w / v）の1％アガロース定期的な溶融を溶解させます。
    2. 55℃の水浴中で溶融し、1％標準アガロース溶液を置き、浴で温度を平衡化。ディップガラス顕微鏡は、任意のexcesを切る、アガロース溶液にスライドアガロースだときれいなスライドの背中を拭いてください。平らな面に縦スライドを置き、スライドを室温で乾燥することができます。乾燥した場所にスライドを保存します。
  2. コメットアッセイ溶液の調製
    1. 0.5％の低融点アガロース溶液を調製します。電子レンジで加熱することにより、リン酸緩衝液中でアガロース低融点（ の Ca 2+はMg 2+、及びフェノールレッドを含まない）に溶解します。彗星スライドの準備中に37-45℃でソリューションをしてください。その後、残りのアガロース溶液を捨てます。
    2. 溶解緩衝液を準備します。エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA二ナトリウム、ミスター372.24グラム/モル）、2.5 M塩化ナトリウム（NaClを、氏58.44グラム/モル）、および10 mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス塩基、ミスター121.14グラム/モル）の100 mM溶液を作ります精製水に、10 N水酸化ナトリウム溶液（NaOHで、氏は40g /モル）でpHを10に調整します。使用の日に、最終concentratを達成するために、溶液にトリトンX100、およびジメチルスルホキシド（DMSO、氏78.13グラム/モル）を添加それぞれ1％、10％、のイオン、そして使用前に少なくとも30分間4-9℃で撹拌しました。
    3. 使用日に新鮮な酵素緩衝液を作ります。 40mMの2- [4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸（HEPES、ミスター238.3グラム/モル）を含む溶液を調製し、100mMの塩化カリウム（KClを、氏74.55グラム/モル）、0.5 mMのEDTA二ナトリウム、および精製水で0.2％ウシ血清アルブミン（BSA、ミスター六万六千四百六十三/モル）。 10 N水酸化カリウム溶液（KOH、56.1グラム/モル）で8.0にpHを調整します。 RTで攪拌し、使用前に完全な溶解を確認します。
    4. 精製水に300mMのNaOHおよび1 mMのEDTA二ナトリウムを含むアルカリ性緩衝液を準備します。使用前に少なくとも30分間4-9℃で撹拌しました。使用前に溶液のpHを測定し、pHが> 13であることを確認してください。
    5. 精製水に0.4 Mトリス塩基の溶液を用意し、塩酸（HCl、氏36.46）でpHを7.5に調整します。 4-10℃でソリューションを保存します。これは、バッファが中和されています。
    6. Fを作ります使用日にバッファをミンチレッシュ。ハンクス液中の20mM EDTA二ナトリウムおよび10％DMSOを含有する溶液（HBSS、のCa 2+はMg 2+、およびフェノールレッドを含まない）を準備します。使用するまで氷上で保管してください。
    7. 染色溶液を調製するには、1でトリス - ホウ酸-EDTA（TBE緩衝液）と核酸蛍光染色原液を希釈：万（v / v）でした。アルミ箔を用いた光からソリューションを保護します。 2-8℃で保存し、24時間で使用しています。

ラット肝臓からの単一細胞懸濁液の調製

  1. 2013年版20：動物の安楽死のためのアメリカの獣医診療ガイドラインで推奨される方法以下のCO 2ガスのラットを安楽死させます。
    1. 2.75でCO 2流量を設定します。安楽死室（ 例えば 、デシケータージャー、通気蓋付きのラットケージ）にラットを入れ、タンクバルブを開くことにより、CO 2をオンにします。まで1.5〜2.5分間待ちラットは無意識になります。その最大設定にCO 2流を増加させます。呼吸が停止した後、安楽死を確実にするために、約1分間チャンバー内でラットを残します。ラットがハートビートを持っていないことを確認するために、触診、およびラットがその手足を撤回しないことを決定するためにつま先をつまんで安楽死を確認します。
  2. 70％エタノールで髪の皮膚を消毒します。腹腔を開き、手術用ハサミで無傷の肝臓を削除します。肝臓を除去した後、手術用ハサミで残りの肝臓から左側葉を取り除きます。まな板の上の左側葉を置き、使い捨て片刃カミソリの刃を使用して2つの隣接する3〜4ミリメートル厚の横断切片を切りました。
  3. （セクションのカールを防止するために）ろ紙上の1つの横断面を配置し、10％中性緩衝ホルマリン（NBF）にセクションを配置します。 ：1以上の組織に10％NBFの比が10であることを確認してください。少なくとも72時間の固定時間の後、PROC組織病理学のために肝臓をESS（以下のセクション7を参照してください）​​。
  4. 6センチメートルペトリ皿に5ミリリットルの氷冷ミンチバッファ（セクション1.2.6）に第2の横肝臓切片を置き、残留血液を除去するために3回すすいでください。
  5. 1ミリリットルの氷冷ミンチ緩衝液を含む新しい2 ml遠心管に肝臓切片を転送します。細胞を放出するために細かいハサミでよくすすぎ、肝臓切片をミンチ。任意の組織塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液株。
  6. 氷の上で単一細胞懸濁液を置き、1時間以内にスライドを作るために使用します。その濃度は約2×10 6細胞/ mlであることを確実にするために（血球計または電子細胞カウンターで、 例えば ）をカウントすることにより、細胞の濃度を確認してください。

コメットスライドの調製

  1. 溶融し、37℃、0.5％の低融点アガロース溶液（セクション1.2.1）の10倍量の単一細胞懸濁液の1ボリュームを混ぜます。すぐに、通常の融点アガロース（セクション1.1）でコーティングしたスライド上に100μLをピペット。すぐに細胞 - アガロース混合物の上にカバースリップを配置。各サンプルの少なくとも8のスライドを作成します。
    注：スライドは盲検法で得点することができるように、全てのスライドは、記録された番号または類似のコードと自分のアイデンティティによって識別されるべきである（以下、6.2.2を参照のこと）。
  2. 30分間、4℃に平らな、クールなスライドを置きます。
  3. ゲルが固化した後、静かにカバースリップを除去し、予め冷却溶解バッファー（セクション1.2.2）にスライドを浸します。光からスライドを保護し、O / N（最大）に1時間（最小）から4℃の溶解緩衝液中でスライドを保ちます。

コメットスライドの4酵素処理

  1. 溶解緩衝液から各組織試料から調製された8スライドの6を削除し、それらを室温で酵素緩衝液（セクション1.2.3）で各5分間、3倍すすぎます。アルカリコメットアッセイワットのために、残りの2つのスライドを使用してくださいithout酵素処理（以下、5.1を参照してください）​​。すすいだ後、組織とスライドを排出し、ブロッティングにより、過剰な液体を除去します。
  2. 1で酵素緩衝液とhOGG1と遠藤III酵素株式を希釈：1,000（v / v）でした。使用するまで氷上に置いてください。
  3. 酵素単独緩衝液200μl（基準スライドとして使用する2スライド）、200μlのhOGG1溶液（2スライド）または200μlの遠藤III溶液（2スライド）：各処置群から調製されたスライドに、以下の溶液を200μlを適用します。
  4. 、湿らせたペーパータオルを敷いたペトリ皿の中にスライドを入れパラフィルムでスライドをカバーし、遠藤III処理およびリファレンススライドとhOGG1処理されたスライドの30分間、37℃で45分間インキュベートします。
  5. インキュベーション後、蒸留水でスライドを洗浄し、以下、5.2で説明したように処理を継続します。

5.巻き戻しと電気泳動

  1. 酵素で処理していないスライドは、溶解緩衝液からスライドを削除、スライドを排出し、残留洗剤および塩を除去するために、5分間の冷中和バッファー（セクション1.2.5）で1回すすいでください。
  2. すべてのスペースを避け、ステップ4.5および水平ゲル電気泳動槽内のランダムに5.1から場所スライド、。液面がちょうどスライドを覆うまで（アガロースの上に泡を回避し、タンクがレベルであることを確認してください）​​たててpH> 13電気泳動バッファー（セクション1.2.4）でタンクを埋めます。 DNAの巻き戻しの開始時に緩衝液のpHと温度を記録します。
  3. スライドはアルカリ責任損傷のDNAと表現の巻き戻しを可能にするために20分間、アルカリ性緩衝液に残ってみましょう。
  4. 電気泳動槽（V / cmの=ボルトが正極と負極の間にCMで距離で割った値）は0.7 V / cmで製造する巻き戻し、プログラム電力供給時。
  5. 巻き戻した後、電源装置上の実行ボタンを押してください。必要な場合は、バッファレベルを上げるか、下げることによって300ミリアンペアの電流を調整。目を保ちますただ、スライドの表面の上の電子バッファレベル。 4℃で20分間電気泳動を行います。電気泳動の開始時と終了時にスライドの配置、バッファーの温度と電流（アンペア）を記録します。
    注：あまりにも多くのバッファは、DNAの移動を妨害する可能性がより低い電圧になります。
  6. 電気泳動後、静かにタンクからスライドを持ち上げ、5分間中和バッファー（セクション1.2.5）に浸漬することにより過剰のアルカリを中和します。スライドを排出し、さらに2回繰り返します。
  7. 5分間の冷100％エタノールに浸漬することによりスライドを修正しました。保存のための乾燥した場所で空気乾燥し、場所にスライドを許可します。

6. DNA染色、彗星の可視化と分析

  1. DNA染色
    1. 段ボールや金属トレイにスライドを置き、各スライドに核酸蛍光染色作業溶液（セクション1.2.7）の200μlを添加し、ガラスカバースリップでカバーしています。からスライドを保護します光は、スライドをスコアリング前に少なくとも30分間染色溶液と接触したままであることを可能にします。一度に20のバッチでスライドを染色します。
    2. 各スライドを読む前に、静かにカバーガラスを乱さないように注意しながら、余分な染色液を離れブロット。
  2. 彗星の可視化とスコアリング
    1. コンピュータのモニタ上の彗星スライドのライブ映像を表示するために蛍光顕微鏡に取り付けたビデオカメラを使用してください。
    2. ランダムに細胞を含有する顕微鏡のフィールドを選択します。マウスを使用して、セルを選択します。マウスの左クリックで「コメットヘッド」の中心をクリックします。
      注：コンピュータソフトウェアは、セルのすべての測定パラメータを計算し、データファイルにデータを追加します。
    3. 現在のフィールド内のすべてのセルをスコア（ステップ6.2.4を参照）、その後、細胞の別のセットを見つけるために、顕微鏡のステージを制御し、画面に表示される映像を使用しています。 6.2.2で説明したように、これらの細胞をスコア。
    4. スライドFスコアロム右は左とまでダウンします。ランダムに約10のフィールドを選択してください。このプロセスの間、視野に表示される任意の適切な彗星の細胞は、バイアスなしで採点されるべきです。
      注：以下のいずれかに該当する場合彗星を獲得しないでください：1）には、スライドのエッジのいずれかに位置しています。 2）2以上の彗星が重複します。 3）尾部の破片があります。 4）ソフトウェアは、頭と尾を区別することはできません。または5）核および/または尾の染色は、スライド上の他の彗星とは大きく異なります。
      注：尾のほぼすべてのそれらのDNAの蛍光を持つ彗星は、しばしば「ハリネズミ」彗星と呼ばれています。ヘッジホッグ彗星が得点されるべきではなく、スライドスコアリング中に検出されたハリネズミの数を記録し、合計彗星の割合として報告されるべきです。
    5. 合計で少なくとも150彗星細胞/サンプルを得るために、器官/組織ごとに2つのスライドを読んで、スライドあたり少なくとも75彗星を分析します。スライドからの細胞の必要な数があることした後ENは、結果は、後のデータ分析のためにスプレッドシートファイルとして保存され、得点しました。

7.組織病理学分析

  1. 21をトリミング組織に続いて10％NBF中に72時間固定、最小の後、日常的に処理し、パラフィンワックスベースの媒体22内のサンプルの左側肝葉を埋め込 ​​みます。セクションのサンプルでは、​​約5ミクロンとガラススライド上に収集します。
  2. ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）を持つセクションを染色：
    1. 染色手順の前に2時間60℃のオーブン中でパラフィン組織切片を有するスライドを加熱します。
    2. 側面を脱パラフィンをキシレンを使用してください。水道水洗浄への段階的エタノール（EtOH）中でスライドを再水和。
    3. 2分40秒のためにヘマトキシリン​​の450ミリリットルでスライドを配置します。水道水すすぎを実行している5分までに、次の4秒間酸（450ミリリットルに2ミリリットルの氷酢酸脱イオン水）でスライドを洗浄します。
    4. スライドさを置きます2分30秒、1分、70％EtOHでリンス用水道水すすぎを実行し、続いて2分間1mlの水酸化アンモニウムを含む450 mlの70％エタノールでエス。
    5. 3分、4 mlの氷酢酸を含む450 mlのエオシンY溶​​液でスライドをインキュベートします。
    6. 傾斜EtOHでスライドを脱水。キシレン（3回各1分）でスライドをオフにして、カバースリップをスライド上に置かれるまで、キシレンにスライドを保持します。
  3. 1（最小限）、2（軽度）、3（中程度）、または4のように重症度のための光学顕微鏡、レコード所見、および悪性度非腫瘍性病変によってスライドを調べます（印）。
    注：;軽度=百分の16から35;中等度= 36から60までパーセント;特定の病変に適用される重症度グレードが病変と肝臓の相対的な割合（最小限= <百分の1から15に基づいており、マークさ= 61- 100％）。

8.データ解析

  1. 動物は、統計的評価のための実験的な単位と考えられています。 DNA損傷は、％DNとして表されます尾部にA。
  2. 基準スライド（無酵素処理）のバックグラウンドDNA鎖切断（SB）の推定値を提供する：酸化的DNA損傷は、次​​のように計算されます。
    注：酵素処理したスライドは、鎖切断の尺度と酸化塩基（SB + OX）を提供します。 DNA損傷の関数としてのテールにおける％DNAのための線形の用量反応を仮定すると、SB + OXからSBの減算は、酸化ピリミジン/変更されたプリン23からのDNA鎖切断の推定を与えます。
  3. 車両制御に処置した動物における応答の対比較のためのダネット検定が続く一方向ANOVAによって、用量の関数として尾の％DNAを分析します。
    注：すべての試験は片側であり、0.05未満のp値は、統計的有意性の基準として設定されています。

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結果

インビボでのアルカリ性コメットアッセイは、酢酸シプロテロン（CPA）5で処理したラットの肝臓における直接および酸化的DNA損傷の両方を測定するための酵素修飾コメットアッセイに関連して行きました。 CPAは、メス24に比べて雄ラットに肝腫瘍を誘発するために必要な5倍高い用量で、性別特異的にラットの肝臓腫瘍を誘発する合成ホルモン薬です。 CPAの5倍、より高い用量は、DNA損傷の有意な増加を誘導するために必要とされている：私たちは、雌雄ラットの肝臓でCPAによって生成され、直接DNA損傷がそのhepatotumorigenicityと同じ性別固有のパターンを有していることがわかりましたメスに比べてオスの肝臓（ 図1）。

私たちは、性別固有のコメットアッセイの結果が15倍高くなっているヒドロキシ基転移酵素（複数可）（HST）の活動によるものであると仮定する成人男...

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ディスカッション

このプロトコルは、単一細胞レベルでのラットの肝臓の両方の直接および酸化的DNA損傷の同時測定を説明します。一般的なプロトコル（ すなわち 、DNA損傷がない試験薬剤によって、しかし動物組織の取り扱いおよび処理によって誘導される）は、単一の細胞または核は最小限の処理によって誘導されるDNA損傷に単離することができる任意の組織にも適用可能です。私たちの研究では、骨髄7,9、胃6、腎臓9、膀胱9、肺9、心臓10、乳腺5、子宮5、精巣5、および血液5から細胞にアルカリコメットアッセイを行いました。これらのアッセイは、多数の器官および実験動物の組織における生体異物誘発性のDNA損傷を研究するための、迅速、単純で安価な方法を提供することができます。また、この方法は、例えば、末梢血には、剥離、アッセイを行うことにより、人間のバイオモニタリング研究のために使用することができます尿管の細胞、または臨床的または職業的に暴露...

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開示事項

どの著者も、競合する利益や相反する利益を持っていません。これらの資料の情報は、FDAによる正式な情報の配布ではなく、FDAの立場や方針を表すものではありません。

謝辞

この作業は米国食品医薬品局(FDA)の支援を受けました。Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. 酢酸シプロテロン処理F344ラットにおける遺伝毒性の性特異的用量反応分析に関するCPA研究の原著論文を認めます。Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
カバースリップ(No.1、24 x 50 mm) フィッシャー12-544-14
顕微鏡スライドフィッシャー12-550-123
ジメチルスルホキシド(DMSO) Fisher67-68-5
EDTA、二ナトリウムFisherBP120-1
リン酸緩衝生理食塩水FisherICN1860454
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
低融点アガロース (LMP)ロンザ50081NuSieve GTG アガロース
ノーマル メルティング アガロース (NMA) フィッシャーBP1356-100
pH試験紙ストリップ(pH 7.5-14)フィッシャーM95873
カリウムクロライドフィッシャー7447-40-7
酸化カリウムフィッシャー1310-58-3
スライドラベル(0.94 x 0.5インチ)フィッシャーNC9822036
塩化ナトリウム(NaCl) フィッシャー7647-14-5
水酸化ナトリウム(NaOH) フィッシャー1310-73-2
SYBR™ゴールド InvitrogenS11494
トリトン X-100 フィッシャー9002-93-1
トリズマベース フィッシャー77-86-1
2.0 ml 微量遠心チューブフィッシャー05-402-6
セルストレーナー (40 & micro;m)フィッシャー22363547
エンドヌクレアーゼIII(Nth) ニューイングランドバイオラボM0268S希釈1:1,000
hOGG1 ニューイングランドバイオラボM0241S希釈1:1,000
水

参考文献

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