単離および脳実質細動脈のカニューレ挿入

サマリー

この原稿は、マウスからの脳内細動脈(実質細動脈、貫通細動脈、前毛細動脈を含む血管のグループ)を単離するためのシンプルで再現性のあるプロトコルを説明しています。これは、圧力筋造影、免疫蛍光、生化学、および分子研究に使用されます。

要約

実質細動脈、貫通細動脈および前毛細血管細動脈を含む脳実質細動脈（PAは）、脳実質に軟膜動脈および細動脈やダイビングから分岐高抵抗血管です。個々のPAは実質および内に含まれるニューロンの離散的な円筒形の領土を灌流。これらの細動脈は、局所的に脳の血流の両方グローバル（脳血管自動調節）と（機能性充血）の調節において中心選手です。 PAは神経血管ユニット、脳内の代謝活性への局所血流量と一致し、また、ニューロン、介在ニューロン、アストロサイトを含む構造の一部です。 PAを介した灌流は、直接フィードPAの拡張によって引き起こされる局所灌流の増強に、その特定の地域内のニューロンとニューロンの代謝リードの増加の活動にリンクされています。 PAの調節は、より良好に特徴づけとは異なります軟膜動脈。圧力誘起血管収縮は、PAの中で大きくなり、血管拡張メカニズムが異なります。また、PAは血管周囲神経から外因性の神経支配を受けていない - 神経支配は、アストロサイトのエンドフィートとの接触を介して自然の中で、固有かつ間接的です。このように、軟膜動脈を用いた研究によって蓄積された収縮の調節に関するデータは直接PAの機能を理解するには変換されません。さらに、それは、高血圧や糖尿病などの病理学的状態は、PAの構造と反応性をどのように影響するか未定のまま。この知識のギャップは、部分的にPAの分離とカニュレーションに関連する技術的な問題の結果です。この原稿では、げっ歯類のPAの単離およびカニューレ挿入するためのプロトコルを提示します。さらに、我々は、アゴニスト誘導性の収縮および筋原性反応を含む、これらの細動脈、で行うことができる実験の例を示しています。この原稿の焦点は、PAカニューレ挿入および圧力筋運動記録法、孤立したPAにあるが、Sはまた、生化学的、生物物理学的、分子、およびイメージング研究のために使用することができます。

概要

脳循環を一意中枢ニューロン、エネルギー貯蔵を制限され、酸素圧力と必要な栄養素の供給の変化に結果的に非常に敏感であるた細胞の代謝要求をサポートするように構成されています。特定のタスクが実行されるときに、特定の神経細胞の亜集団がアクティブになると、血管系は、地元の低酸素や栄養素¹の枯渇を防ぐために、灌流の高度に局在化の増加を促進します。これは、アクティブニューロン、アストロサイト、および大脳動脈²から成る、 神経血管カップリングとして知られている機能性充血の一形態であり、そして神経血管ユニットの適切な動作に依存しています。脳実質動脈は、血管、実質を取り囲む貫通し、前毛細血管細動脈の基は、この反応のために集中的に重要であり、神経血管カップリング^3を調査するために、個別に研究するために、次に重要です。

<脳内の異なるニューロン集団を潅流 - （70μmの内径20）高抵抗血管のpクラス= "jove_contentは">実質細動脈は小さいです。表面の軟膜動脈から分岐、実質細動脈は地下微小循環（ 図1）を供給するために、ほぼ^90ᵒ角度で脳実質に浸透します。これらの細動脈は、彼らが毛細血管を保護する最も遠位の平滑筋を含む血管があるように、適切な灌流圧を維持する上で重要な役割を果たしています。表面軟膜の循環とは対照的に、実質細動脈は、担保の枝と吻合を欠き、その結果、脳循環⁴の「....

プロトコル

1.カニューレと商工会議所の準備

1. きれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーを挿入（外径：1.2ミリメートル;内径：0.69ミリメートル、長さ10mm）白金フィラメント（直径：100ミクロン）でピペットプラーの溝に。
2. 適切な設定を使用して、マイクロピペットプラーを使用して、長い、細い先端（ 図2）とのカニューレを生成するために、キャピラリを引き出します。使用される設定は次のとおりです。熱 - 700、プル - 100、速度 - 50、時間 - 10。
3. 圧力ミオグラフ室のホルダーにカニューレを挿入します。適切にカニューレを合わせます。
4. 慎重に所望の直径に解剖顕微鏡下でピンセットを使用して、カニューレの先端を破ります。ここでは、10μmの先端部（ 図2）とのカニューレを示します。
5. 1.8 mMののCa ^2+を含む人工脳脊髄液（aCSFの）との両方のカニューレを埋めます。 1％ウシ血清を補充し^た Ca ²⁺フリーのaCSFのでチャンバーを埋めますアルブミン（BSA）+ 10μMジルチアゼム（すべてのソリューションは、実験の開始前に、新たに調製されるべきです）。チャンバの大きさに応じて、5〜20 mlのaCSFの量を変化させます。カニュレーションを開始する準備ができるまで^4ᵒCで室内に保管し....

結果

図5Aは、製剤の完全性を評価するために、60mMのKClをaCSFのにマウスPASの代表的な収縮を示します。 60のKClの存在下で30％ - PAは15の間に収縮する必要があります。狭窄が15％未満である場合は、PAを破棄し、それは細動脈の単離およびカニューレ挿入プロセス中に損傷されたことを示唆しているように、別のものにカニューレを挿入。

図5Bは、superfusing浴にトロンボキサン濃度の増加にPA狭窄₂アナログU-46619（1μM〜10ピコモル）を示しています。くびれは、各濃度とのインキュベーション後に管腔直径の減少として観察されました。 PAは、10分間の各濃度で平衡化させました。これらのデータは、直径の変化（ΔDiameter）として、またはチャンを正規のKCl％の血管収縮、として分析し、提示することができます60 mMのKClに対する最大収.......

ディスカッション

脳実質細動脈は、異なるニューロン集団を灌流少数の吻合や支店を持つ高抵抗細動脈です。これらの専門の血管は、星状細胞媒介血管拡張^1を介して脳血管自動調節し、神経血管カップリングの中心的プレーヤーです。脳血管疾患におけるこれらの特殊な血管の重要性は、ミラー博士フィッシャーの先駆的な仕事は、高血圧患者の死後 ¹⁶の脳内にラクナ梗塞の領土内で実質細動脈に構造的変化を説明する際、約50年前から知られています。機能障害に結合されたこれらの変化は、深部白質の低灌流、血管関連痴呆¹⁷の開発のための主要な危険因子を引き起こす可能性があります。実質細動脈は、大規模な頭蓋内および軟膜動脈だけでなく、表面の細動脈、こうして蓄積されたDからの機能的に区別されます脳血管ツリーのこれらのメンバーを使用してATA簡単実質微小循環に外挿することはないかもしれません。適切な脳の恒常性を維持する上で、その明確な重要性にもかかわらず、これらの細動脈の生理学および機能的応答に焦点を当てた研究は、主に単離および操作に関連した技術的な問題に、近年までは希少となっています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人工脳脊髄液
NaCl	フィッシャーサイエンティフィック	S-640
KCl	フィッシャーサイエンティフィック	P217
MgCl 無水	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
>Stereo Microscope	Olympus	SZX7
スーパーファイン フォーセプス	ファイン サイエンス ツール	11252-00
バンナス スプリング シザース	ファイン サイエンス ツール	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWRサイエンティフィック	5-000-1050
0.2 μm 滅菌シリンジフィルター	VWR Scientific	28145-477
マイクロピペット プーラー	サッター機器	P-97
ホウケイ酸ガラス O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	サッター機器	B120-69-10
ダークグリーン ナイロン糸	リビングシステム 機器	THR-G
リニアアライメント シングルベッセルチャンバー	リビングシステム計装	CH-1-LIN
圧力サーボコントローラ ペリスタルティックポンプ付き	リビングシステム計装	PS-200
ビデオ寸法計	リビングシステム計装	VDA-10
LabScribe 3 記録・分析ソフトウェア付き 4チャンネルレコーダー	リビングシステム計装	DAQ-IWORX-404
ヒーティングユニット	ワーナーインスツルメンツ	64-0102
自動温度コントローラー	ワーナーインスツルメンツ	TC-324B