多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

Summary

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。

Abstract

免疫組織化学は、タンパク質の発現と組織内での局在を調査するために一般的に使用される臨床および研究ラボの検出技術です。免疫組織化学を用いた発現のスコアリングのために、多くの半定量システムが開発されてきましたが、固有の主観性により、結果の再現性と精度が制限されます。さらに、核転写因子などの空間的に重なり合うバイオマーカーの研究は、現在の免疫組織化学技術では困難です。私たちは、マルチプレックス免疫組織化学とマルチスペクトルイメージングのハイスループット法を使用して、複数のタンパク質を同時に研究するためのシステムを開発し、最適化しました。マルチプレックス免疫組織化学は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合した二次抗体と一次抗体を逐次適用することによって行われます。目的の各タンパク質を検出するために、異なる発色原が使用されます。染色されたスライドは自動スライドスキャナーにロードされ、自動画像取得のためのプロトコルが作成されます。スペクトルライブラリは、スライドのセットをそれぞれに1つの発色剤で染色することによって作成されます。代表的な染色画像のサブセットをマルチスペクトルイメージングソフトウェアにインポートし、画像上に組織コンパートメントを定義することで組織タイプを区別するアルゴリズムを作成します。細胞内コンパートメントは、ヘマトキシリン対比染色を使用し、固有アルゴリズムを調整することによりセグメント化されます。閾値化は、陽性率とタンパク質の共局在を決定するために適用されます。その後、最終的なアルゴリズムが組織のセット全体に適用されます。得られたデータにより、ユーザーは組織タイプ(例:上皮対間質)および細胞内コンパートメント(核対細胞質対原形質膜)に基づいてタンパク質発現を評価できます。共局在解析により、ダブルポジティブ、ダブルネガティブ、およびシングルポジティブの細胞タイプの調査が可能になります。マルチスペクトルイメージングとマルチプレックス免疫組織化学および自動画像取得を組み合わせることで、組織内のバイオマーカーを客観的かつハイスループットで研究することができます。

Introduction

免疫組織化学（IHC）は、組織内のタンパク質の検出のための標準的な実験室の技術であり、IHCは、まだ広く研究および診断病理学の両方で使用されています。 IHC染色の評価は、結果の解釈に潜在的なバイアスを導入、多くの場合、半定量的です。多くの半定量的アプローチは、最終的な診断^1-4に染色強度および染色程度の両方を組み込んだ開発されています。他のシステムは、より良い表現^5をローカライズするために、スコアリング強度と細胞内局在を含みます。複数の視聴者からの平均スコアの組み込みは、多くの場合、単一のビューアバイアス⁶の影響を最小限にするために利用されます。 ^7染色の程度を評価する際に、これらの努力にもかかわらず、分析中の主観性はまだ特に、残っています。プロトコルの標準化と人間の入力から主観性を最小限に抑えるには、正確で再現性のIHCの結果を作成するための最も重要です。

コンテンツ">組織内のタンパク質の発現を決定するためのIHC以外の他のオプションがあります。そのような免疫ブロット法などの他の技術は、タンパク質の発現を調査するためのゴールドスタンダードとして見ている間に研究環境の中で、免疫組織化学は、伝統的に、タンパク質の局在^8を検討するための手段と見られています。組織または細胞コンパートメント特異的な発現を決定することは、このような細胞分画またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション^9,10

Protocol

注：プロトコルは、本明細書に組織マイクロアレイ（TMA）の染色および分析について説明し、以前^12,17,18説明。 4μmの厚さのTMA部分は、標準的なミクロトームを使用して、パラフィンブロックから得ました。

注：4色原体と対比のためのスペクトルライブラリは、画像定量化のために作成する必要があります。これを行うために、各個々の抗体のための最適化されたプロトコルは、1スライドあたりの抗体、マイナス最終的な対比で実行する必要があります。第五のスライドは、スペクトルライブラリを作成するために必要な5画像を生成するためにヘマトキシリン​​で染色されるべきです。

1.マルチプレックス免疫組織化学

1. 20分間60℃のオーブンで焼くスライド。化学ヒュームフードを使用して、100％キシレンでスライドを浸します。キシレンの2の変更を繰り返します。 5分間100％エタノールでスライドを浸します。新鮮な100％エタノールで繰り返します。
2. 3分間95％エタノールでスライドを浸します。新鮮で繰り返し95％エタノール。 3分間70％エタノールでスライドを浸します。 3分間蒸留水でスライドを浸します。新鮮な蒸留水で繰り返します。スライドから水を排出するために垂直方向にスライドをタップします。 5分間、すぐに使用できる内因性ペルオキシダーゼブロッカーの200μLを適用します。
3. スライドからペルオキシダーゼブロッカーを排出し、45ミリリットルですぐに使用でき....

Results

図1において、訓練は、非組織コンパートメントと共に、上皮および間質の部分に分割画像に前立腺組織上で行われます。上皮細胞膜マーカーE-カドヘリンを使用することにより、細胞分割は、 図2に示した核、細胞質、膜部分を分離するために行きました。

1つの実験において、我々は、 図3に示すように、AR、ERα、E-カドヘリン、およびCD147の発現と局在化を調査するために、多重化IHCを使用する。これらの技術を使用して、我々は両方のERαの核発現について陽性の細胞を識別することができると図3Aの緑色の矢印で示すように、比色信号をオーバーラップにもかかわらず- AR（3C 図3B）。私たちは、広報の異なる状態の中の二重陽性間質細胞の割合の著しい違いを発見しました.......

Discussion

タンパク質の発現を評価するための伝統的な免疫組織化学の使用は、分析^22,23の主観的、半定量的な方法によって制限されます。アドバンス・プラットフォームは、バイオマーカーの発現と局在のハイスループット分析のために作成されています。組織および細胞内区画の両方の詳細なセグメンテーションは、ユーザーが関心のある他のマーカーとバイオマーカーの発現、局在化、および共局在を研究することができます。以前の研究では、我々は同じ細胞区画^18,20,21に局在するタンパク質を研究するために使用される場合は特に、IHCの有用性とマルチスペクトル画像を実証しました。組織マイクロアレイ²⁴と組み合わせると、これらの技術は、病理学者によって手動分析によって許容されるよりも、タンパク質発現のより速く、より客観的な定量化を可能にします。

タンパク質定量のための免疫組織化学を用いた1つの問題はsubjecによる結果の非再現性であります分析と技術および試薬に固有の差異の的性質。タンパク質の発現を測定するためにマルチスペクトル画像のようなプラットフォームを.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
キシレン	フィッシャーケミカル	X3F1GAL	NFPA評価:健康– 2、火災– 3、反応性– 0
エチルアルコール-200プルーフ	フィッシャーサイエンティフィック	4355223	NFPA評価:健康– 0、火災– 3、反応性– 0トリ
スベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500	NFPA評価:健康– 2、火災– 0、反応性– 0
トリスヒドロキシメチルアミノメタンHCl	フィッシャーサイエンティフィック	BP153-1	NFPA 評価: 健康 – 2, 火災 – 0 , 反応性 – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	NFPA 評価: 健康 – 0, 火災 – 1 , 反応性 – 0
リン酸緩衝生理食塩水	フィッシャーサイエンティフィック	BP2944-100	NFPA評価:健康–1、火事–0、反応性–0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	皮膚や目との接触を避けてください。皮膚の炎症や目の損傷を引き起こす可能性があります。
エストロゲン受容体α	サーモフィッシャーサイエンティフィック-ラボビジョン	RM9101	危険物として分類されていない
アンドロゲン受容体	SCBT	sc-816	危険物として分類されていない
CD147	バイオデザイン	P87535M	危険物として分類されていない
E-カドヘリン	ダコ	M3612	危険物として分類されていない
ルノワールレッドアンディボディ希釈剤	バイオケア医療用	PD904	トリスベースの抗体と連携するように特別に設計されています
DeCloaking Chamber	Biocare Medical	Model DC2002	鍋バリア
ペン-イムノエッジの使用に通常注意してください	Vector Labs	H-4000
変性キット-溶出ステップ	バイオケア メディカル	DNS001H	危険な
マッハ2 ヤギ抗ウサギHRPポリマー	バイオケア医療	RHRP520	危険な
マッハ2として分類されていない ヤギ抗ウサギAPポリマー	バイオケアメディカル	RALP525
マッハ2ヤギ抗マウスHRPポリマー	として分類されていませんバイオケアメディカル	M3M530	危険な
ベタゾイドDABクロモゲンキット	バイオケアメディカル	BDB2004	1.DABは発がん性が疑われる物質であることが知られています. 2.DABコンポーネントを強い光や直射日光にさらさないでください. 3.適切な個人用保護具と衣類を着用してください. 4.DABは皮膚の感作を引き起こす可能性があります。皮膚や目との接触を避けてください. 5.廃棄に関するすべての連邦、州、および地方の環境を観察し
ワープレッドクロモゲンキット	バイオケアメディカル	WR806	。皮膚の炎症や目の損傷を引き起こす可能性のある酸。
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	飲み込むと有害
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	可燃性液体。熱、炎、火花から遠ざけてください。摂取または吸収により有害。皮膚や目との接触を避け、吸入を避けてください。
キャットヘマトキシリン	バイオケアメディカル	CATHE	パープル ソリューション   a  マイルド  酢酸  アシッド  (お酢)  匂い。 5月  be  イライラさせる に  スキン  または  目。 避ける  お問い合わせ   スキン  および  目。 避ける  摂取。
XYLマウントメディア	リチャード・アレン	8312-4	NFPA評価:健康 – 2、火災 – 3、反応性 – 0
1.5 カバース	リップ フィッシャーブランド	22266858	シャープエッジ
インキュベーション(湿度)チャンバー	廃止	廃止	廃止 複数のベンダーが利用可能
対流式オーブン	Stabil- Therm	C-4008-Q
背景パニッシャーブロッキング試薬	バイオケアメディカル	BP974	本製品は危険物に分類されていません。
inFormソフトウェア	PerkinElmer	CLS135781	原稿で使用される主要なマルチスペクトルイメージングソフトウェア
ニュアンスソフトウェア	PerkinElmer	ニュアンスEX	ソフトウェア 原稿Vectra顕微鏡およびスライドスキャナー内のスペクトルライブラリを作成するために使用されるソフトウェア
	PerkinElmer	VECTRA	IM3イメージキューブを取得するための自動スライドスキャナーおよび顕微鏡