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方法論記事

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

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DOI:

10.3791/53837

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2016年4月8日

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1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

この記事について

サマリー

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。

要約

免疫組織化学は、タンパク質の発現と組織内での局在を調査するために一般的に使用される臨床および研究ラボの検出技術です。免疫組織化学を用いた発現のスコアリングのために、多くの半定量システムが開発されてきましたが、固有の主観性により、結果の再現性と精度が制限されます。さらに、核転写因子などの空間的に重なり合うバイオマーカーの研究は、現在の免疫組織化学技術では困難です。私たちは、マルチプレックス免疫組織化学とマルチスペクトルイメージングのハイスループット法を使用して、複数のタンパク質を同時に研究するためのシステムを開発し、最適化しました。マルチプレックス免疫組織化学は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合した二次抗体と一次抗体を逐次適用することによって行われます。目的の各タンパク質を検出するために、異なる発色原が使用されます。染色されたスライドは自動スライドスキャナーにロードされ、自動画像取得のためのプロトコルが作成されます。スペクトルライブラリは、スライドのセットをそれぞれに1つの発色剤で染色することによって作成されます。代表的な染色画像のサブセットをマルチスペクトルイメージングソフトウェアにインポートし、画像上に組織コンパートメントを定義することで組織タイプを区別するアルゴリズムを作成します。細胞内コンパートメントは、ヘマトキシリン対比染色を使用し、固有アルゴリズムを調整することによりセグメント化されます。閾値化は、陽性率とタンパク質の共局在を決定するために適用されます。その後、最終的なアルゴリズムが組織のセット全体に適用されます。得られたデータにより、ユーザーは組織タイプ(例:上皮対間質)および細胞内コンパートメント(核対細胞質対原形質膜)に基づいてタンパク質発現を評価できます。共局在解析により、ダブルポジティブ、ダブルネガティブ、およびシングルポジティブの細胞タイプの調査が可能になります。マルチスペクトルイメージングとマルチプレックス免疫組織化学および自動画像取得を組み合わせることで、組織内のバイオマーカーを客観的かつハイスループットで研究することができます。

概要

免疫組織化学（IHC）は、組織内のタンパク質の検出のための標準的な実験室の技術であり、IHCは、まだ広く研究および診断病理学の両方で使用されています。 IHC染色の評価は、結果の解釈に潜在的なバイアスを導入、多くの場合、半定量的です。多くの半定量的アプローチは、最終的な診断1-4に染色強度および染色程度の両方を組み込んだ開発されています。他のシステムは、より良い表現5をローカライズするために、スコアリング強度と細胞内局在を含みます。複数の視聴者からの平均スコアの組み込みは、多くの場合、単一のビューアバイアス6の影響を最小限にするために利用されます。 7染色の程度を評価する際に、これらの努力にもかかわらず、分析中の主観性はまだ特に、残っています。プロトコルの標準化と人間の入力から主観性を最小限に抑えるには、正確で再現性のIHCの結果を作成するための最も重要です。

コンテンツ">組織内のタンパク質の発現を決定するためのIHC以外の他のオプションがあります。そのような免疫ブロット法などの他の技術は、タンパク質の発現を調査するためのゴールドスタンダードとして見ている間に研究環境の中で、免疫組織化学は、伝統的に、タンパク質の局在8を検討するための手段と見られています。組織または細胞コンパートメント特異的な発現を決定することは、このような細胞分画またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション9,10などの高度な技術を組み込むことなく、困難である。組織スライド上の蛍光抗体の使用は、合理的な妥協点を提供していますが、NADPHによるバックグラウンド自己蛍光、リポフスチン、網状繊維、コラーゲン、およびエラスチンは11正確な定量が困難になることができます。

自動計算病理プラットフォームは病理染色12-15のより客観的な定量化のための有望な方向です。組織マイクロアレイを用いてマルチスペクトルイメージングを組み合わせます大きなサンプルサイズのタンパク質発現のハイスループット分析を容易にします。カテゴリ形式16ではなく、連続してデータを戻しながら、実質的に、固有のバイアスおよび分析のために必要な時間の両方を低減しながら、これらの技術を用いて、タンパク質の共局在化、染色不均一性、ならびに組織および細胞内局在の解析が可能です。したがって、この研究の目的は、マルチスペクトル画像化ソフトウェアを使用して、分析を多重免疫組織化学を実施するための有用性と方法論を実証することでした。

このプロトコルは、4つの最適化されたモノクローナル抗体を用いた単一の組織切片スライドのマニュアル、多重免疫組織化学染色のために書かれています。代表的な実験として、核抗ウサギエストロゲン受容体α（ERα）​​およびアンドロゲン受容体（AR）は、膜に結合した抗マウスCD147および膜に結合した抗マウスE-カドヘリンと多重化されています。選択した任意の抗体がsubstitutすることができます本明細書に記載された抗体について編が、抗体の各組合せは、別々の最適化を必要とします。すべての抗体のための前処理は同じでなければなりません。 ARとCD147抗体は、カクテルとして個別に、その後、最適化されなければなりません。各抗体は、ビオチンを含まないポリマー系と4ユニークな色原体のいずれかを使用して検出されます。

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プロトコル

注：プロトコルは、本明細書に組織マイクロアレイ（TMA）の染色および分析について説明し、以前12,17,18説明。 4μmの厚さのTMA部分は、標準的なミクロトームを使用して、パラフィンブロックから得ました。

注：4色原体と対比のためのスペクトルライブラリは、画像定量化のために作成する必要があります。これを行うために、各個々の抗体のための最適化されたプロトコルは、1スライドあたりの抗体、マイナス最終的な対比で実行する必要があります。第五のスライドは、スペクトルライブラリを作成するために必要な5画像を生成するためにヘマトキシリン​​で染色されるべきです。

1.マルチプレックス免疫組織化学

  1. 20分間60℃のオーブンで焼くスライド。化学ヒュームフードを使用して、100％キシレンでスライドを浸します。キシレンの2の変更を繰り返します。 5分間100％エタノールでスライドを浸します。新鮮な100％エタノールで繰り返します。
  2. 3分間95％エタノールでスライドを浸します。新鮮で繰り返し95％エタノール。 3分間70％エタノールでスライドを浸します。 3分間蒸留水でスライドを浸します。新鮮な蒸留水で繰り返します。スライドから水を排出するために垂直方向にスライドをタップします。 5分間、すぐに使用できる内因性ペルオキシダーゼブロッカーの200μLを適用します。
  3. スライドからペルオキシダーゼブロッカーを排出し、45ミリリットルですぐに使用できる検索緩衝液（pH 7.0未満）を浸します。圧力鍋に入れスライドコンテナおよび起動プログラムは、4分間124℃に設定してください。圧力鍋を20分間冷却してください。開口部の前に。
  4. 検索バッファのコンテナを削除し、さらに10分を冷却することができます。 10分間蒸留水でスライドを洗浄します。スライドから水を排出し、慎重に疎水性バリアペンでスライド上の組織の輪郭を描きます。
  5. 湿ったガーゼを含む蓋（インキュベーションチャンバー）を有する平坦なコンセントにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）.Transferスライドの200μLを加えます。
  6. 50メートルを希釈することによって、トゥイーン20（TBST）で1×Tris緩衝生理食塩水1リットルを準備20Xトリスのlは1％のTween-20と950ミリリットルの蒸留水を含む緩衝生理食塩水。
  7. スライドからPBSを排出し、1×TBST200μlのを適用します。 2分間インキュベート。スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。すぐに使用できるユニバーサルタンパク質ブロック、閉鎖室の200μLを適用し、7分間インキュベートします。
  8. タンパク質ブロックを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。抗体希釈液の239.4μlに抗体の0.6μLを添加することにより、400：抗ERα抗体1を希釈します。スライドさせる希釈した抗体と閉鎖室の200μLを適用します。
  9. 2時間室温でスライドをインキュベートします。スライドから抗体を排出し、TBSTで5分間浸漬し、続いてTBSTですすいでください。
  10. スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。すぐに使用できるヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼポリマー及び閉鎖室の200μLを適用します。 30分間インキュベートします。室温で。 5分間TBSTのコンテナ内のTBSTと場所のスライドで洗い流してスライド。
  11. 250μlのDAB基質緩衝液にDAB色素原の8μLを加え、よく混合することにより、色素原茶色の西洋ワサビペルオキシダーゼ3,3'-ジアミノベンジジン（HRP-DAB）を準備します。
  12. スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返し、6分間茶色のHRP-DAB色原体を200μlを適用します。徹底的に蒸留水の容器に蒸留水と場所のスライドとスライドをすすぎます。
  13. 第2の緩衝試薬150μlで最初の溶出​​試薬50μlのを組み合わせることにより、変性溶液を混ぜます。スライドから水を排出し、3分間スライドに希釈した変性溶液を適用します。室温で。デカントし、TBSTで試薬を変性すすぎます。 5分間TBSTでスライドを浸します。
  14. 抗体希釈液の203μlの抗AR抗体の4.2μlのと抗CD147抗体の2.8μLを希釈することにより、AR / CD147抗体カクテルを準備します。スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーへの戻りスライドとAR / CD147 Cの200μLを適用スライドにocktail。閉鎖室と室温で1時間インキュベートします。 TBSTでスライドを洗浄し、5分間TBSTに浸します。
  15. TBST、インキュベーションチャンバーへの戻りスライドを排出し、すぐに使用ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼポリマーの200μLを適用します。閉じる室と30分間インキュベートするスライド。室温で。 TBSTでスライドを洗浄し、5分間TBSTに浸します。
  16. 250μlの赤い色素原バッファに赤い色素原の3.2μLを添加することにより、色素原赤アルカリホスファターゼを準備し、よく混ぜます。
  17. スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。スライド、閉鎖室に希釈赤アルカリホスファターゼ色素原200μlのを適用し、7分間インキュベートします。
  18. 色原体を排出し、蒸留水で完全にスライドをすすぎます。 5分間蒸留水の容器にスライドを置きます。 、スライドから水を排出し、TBSTで洗浄し、インキュベーションチャンバーに戻ります。スライドとCLOSに200μlのヤギ抗マウスHRPポリマーを適用しますE室。 30分間インキュベートします。室温で。
  19. スライドからポリマーを排出し、TBSTで洗い流してください。 5分間TBSTに入れスライド。バッファの250μlに安定化試薬の3.2μLを添加することにより、紫色のHRP-リンク色素原200μlのを準備し、よく混ぜます。紫色の色素原の3.2μlを添加して、よく混ぜ、過酸化水素試薬の後、3.2μlを、よく混ぜます。
  20. TBSTを切るスライドとスライドさせ、7分間インキュベートする準備紫色の色素原200μlのを適用します。室温で。 5分間蒸留水の容器内の蒸留水と場所のスライドとスライドを洗浄します。
  21. 第2の緩衝試薬150μlで最初の溶出​​試薬の50μLを混合することにより、変性溶液を混ぜます。スライドから水を排出し、3分間スライドに希釈した変性溶液を適用します。室温で。
  22. TBSTで試薬をオフ変性すすぎます。 5分間TBSTのコンテナ内のスライドを置きます。抗E-カドヘリン抗体を希釈1：200 218.9μlの抗体希釈液に1.1μlの抗体を添加することもできます。スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返し、スライドにE-カドヘリンの200μLを適用します。閉鎖室と30分間インキュベートします。室温で。
  23. 5分間TBSTのコンテナ内のTBSTと場所のスライドで洗い流してスライド。インキュベーションチャンバーにスライドを戻す、スライドからTBSTを排出し、200μlのヤギ抗マウスHRPポリマーを適用します。室温で30分間インキュベートします。 5分間TBSTのコンテナ内のTBSTと場所のスライドで洗い流してスライド。
  24. 250μlのバッファーに色素原の8μLを添加することにより、黒HRP-リンク色原体を準備します。 2分間スライドし、開発する200μlの色原体を適用します。蒸留水で十分にスライドをすすぎ、蒸留水の容器に浸します。
  25. 蒸留水200μlに40μlのヘマトキシリン​​を追加することにより、ヘマトキシリン​​を希釈します。スライドから水を排出し、30秒間スライドするように希釈されたヘマトキシリン​​の200μLを適用します。リンススライド完全に2分間水道水、30秒間蒸留水ですすぎます。 15-30分間60℃のオーブンに入れスライド。
  26. 、30秒間、新たに調製した100％キシレンでスライドを浸し過剰キシレンを拭き取り、永久封入メディアの一滴を追加します。第1.5カバーガラスでカバースリップ。

2.自動画像取得と解析

  1. 自動スライドスキャナーに染色スライドをロードします。直径、分離、およびTMAコアの数に基づいて、製造業者の取扱説明書に従って自動スキャンプロトコルを作成します。
  2. 個々の色素原、ヘマトキシリン​​染色スライドで染色した対照スライドからスペクトルライブラリを構築するためのマルチスペクトルイメージングソフトウェアを開きます。制御スライドから取得した画像キューブを開き、光学的にその色素原を定義する4 5に陽性に染色された領域を選択します。完全なスペクトルライブラリrepresentiまで他の制御スライドから画像キューブで繰り返しすべての色素原ngをすることは作成され、スペクトルライブラリを保存されています。
  3. マルチスペクトルイメージングソフトウェア内の新しいプロジェクトを開始します。画像フォーマットオプションとサンプルフォーマットのための "明"のための "マルチスペクトル（.im3）」を選択します。 「スコア」、「表現型」、「フィーチャーの検索」、「セグメント組織」と「エクスポート」：まず、必要なオプションを選択して、プロジェクトを構成します。この時点で、画像の解像度は、所望であれば、分析時間を促進するために変更することができます。

3.組織セグメンテーション

  1. 以前に作成したスペクトルライブラリをインポートして、分析に含まれるすべての色原体を選択します。
  2. 「画像を開くキューブ」オプションを選択することによって、トレーニングデータセットに含まれるオープン画像キューブ。学習精度を確保するために、分析される画像の総数の少なくとも18％を選択します。セグメンテーション精度を高めるために、すべての疾患状態を表す画像を選択します。画像のこの部分は私sが画像のトレーニングセットと呼ばれます。
  3. スポイトツールを選択し、白である一つの画像内の領域を選択することで、トレーニングセットにおけるホワイトバランス画像。
  4. 組織のセグメンテーションに移動し、「アドバンス」ボタンを選択します。 （ すなわち 「組織」と「非組織」）分析すべき組織の種類を選択するために「組織カテゴリ」パネルを使用します。より正確なタンパク質組織局在化のために、複数の組織の種類（ すなわち 、「上皮」、「間質」と「非組織」）を使用することができます。
  5. アルゴリズムを作成し、訓練画像内の細胞のグループの周りに描画することにより、組織カテゴリの定義を開始。 1つの組織のカテゴリが終了したら、他の組織のカテゴリについて繰り返します。その組織のカテゴリ型の特徴である画像内の細胞のグループを選択してください。
  6. 画像のトレーニングセット内の全ての画像について、このプロセスを繰り返します。
  7. コンポーネントを選択（クロモゲン）はTRAIに含まれます「組織セグメンタ」のためのNing。明視野免疫組織画像の解析を行う場合、すべてのコンポーネントが正常にトレーニング中に含まれています。このステップの間にバイアスを回避するために、トレーニングセットで豊富なネガティブ染色画像を含みます。
  8. 組織のセグメント化を訓練するための適切な「パターン・スケール」を選択します。 20X倍率で、大きなパターンの規模は、一般的に適切です。高い倍率で細かいアーキテクチャを持つ組織で作業している場合は、より小さなパターンのスケールがより適切です。
  9. 組織のセグメント化の訓練を開始するために「電車組織セグメンタ」ボタンを選択します。適切に分類されているトレーニング領域内の画素の割合を反映した精度を表示するポップアップボックスを確認します。
    注：ソフトウェアが継続的に手動で停止するまで、アルゴリズムの精度を改善しようとします。我々は以前に97％の訓練精度12で画像の結果の18％でそのトレーニングを実証しました。
  10. 組織のセグメント化が訓練された後、適切なセグメント解像度を選択します。セグメントの分解能は、より少ない時間とより多くの時間を必要とする高分解能を必要と粗い分解能で、セグメントの画像に必要な時間に相当します。
  11. セグメント「セグメントイメージ」をクリックして、画像の全体のトレーニングセット。すべてのトレーニング画像にアルゴリズムを適用するためのソフトウェアの十分な時間を許可します。終了したら、現在の学習アルゴリズムを持つ任意の誤分類の組織を見つけるために、トレーニングセットを確認します。
  12. 、組織のセグメンテーションプロセスを微調整する追加、編集、または組織のトレーニング領域を削除します。ピクセルが別のものに1つの組織のカテゴリの端に拡張する場合、「トリムエッジ」オプションを使用します。ピクセルの小グループが誤って分類されている場合、最小セグメントサイズにしきい値を調整します。
  13. 編集は、選択「セグメント画像」終了すると、これは、組織のセグメンテーションのための新しいアルゴリズムを作成するために、組織のセグメント化を再訓練します。以前のアルゴリズム自動的に保存され、必要な場合に戻すことができます。
  14. ときに組織分割アルゴリズムの結果に自信を持って、「アドバンス」ボタンを選択することによって、細胞のセグメンテーションに進みます。

4.セルセグメンテーション

  1. 選択した細胞内区画は、細胞分割に含まれます。 「核」はすでに「細胞質」または「膜」を選択するように選択されていることを確認。
    注：膜特異的タンパク質マーカーがIHCに含まれていたとき、「膜」のセグメンテーションは、このようなE-カドヘリンのように、選択すべきです。
  2. 「核」タブ内には、いくつかのオプションがあります。核セグメンテーションのための適切な設定を選択することによって開始する（ステップ4.3参照）。個々のまたは全ての組織のカテゴリはセグメンテーションに含まれるかどうかを選択します。
  3. 核分割のためのアプローチを選択
    1. 良い得るための簡略化された方法のためのアプローチ対比「ピクセルベース（しきい値）」を選択画像処理の設定について多くを知らなくても結果。
      注：これは、多くの場合、良い第一選択肢となります。アプローチ、「ピクセルベース（しきい値）」を選択した場合は信頼性の高い核対比染色がある場合に、一貫した核対比の不足がある場合は、「ベースのオブジェクト」を使用する必要がありながら、より適切です。
    2. 信頼性の高い核対比がある場合、「ピクセルベース（しきい値）」アプローチを選択します。
      注：このアプローチは、純粋にピクセルベースです。このアプローチはまた、IHC染色について陽性染色組織のカテゴリ内の全ての画素を検出するなどの単純な閾値に満足することができる他の画像解析のニーズのために使用することができます。
    3. 核の対比が核オブジェクトの一貫性と特異的染色を提供していない場合はオブジェクトベースのアプローチを選択して、より高度な形態計測に基づくアプローチは、核を検出するために必要とされています。
    4. 「原子力セグメンテーションのためのコンポーネント」、「NUCLを選択耳のサイズ」、および「クリーンアップ」は、ユーザがさらに核セグメンテーションの設定を定義したい場合。
  4. 細胞質形状パラメータを選択します
    1. 細胞質セグメンテーションに移動するには、「アドバンス」ボタンを選択します。
      注：から選択する細胞質セグメンテーション内のいくつかのオプションがあります。 「核への内部の距離」と呼ばれるオプションは、ピクセルベースです。これは、核の外側と細胞質の内側との間の距離を反映しています。この値を大きくすると、核シグナルが細胞質区画に渡って横断する確率を減少させます。
    2. 次に、「核への外側の距離」を選択します。
      注：これはまたピクセルベースです。核への外側の距離は、核の外側とセルの外部との間の距離を反映しています。この値は、必要に応じて、膜の信号を含めるか除外するために十分な大きさまたは小さく設定することができます。
    3. 次に、「最小サイズ」を選択します。
      注：最小サイズ、PIXEベースLは、分析に含まれる最小の細胞質サンプルサイズを反映しています。細胞質のサイズは、細胞が密に一緒にパックされている場合など、特定のセル内の小さい場合には、この細胞質セグメントを分析から除外されています。
    4. 次のオプション、「プライマリ」、「セカンダリ」と「コンポーネント」を選択し、二次的なオプションとして「第三紀」を選択します。
      注：ここに1つは、特定の細胞質マーカーを選択することができます。特定の細胞質IHCマーカーが使用されている場合、核セグメンテーションと同様に、このコンポーネントは、最小閾値を見つけることによって、細胞質を定義するために使用することができます。これは、細胞質を定義するのに役立つが、許容精度のためには必要ではありません。
    5. 3タブ付きのオプションの最後に移動すると、「膜」です。ここでは、ユーザは、タンパク質マーカーを有する膜コンパートメントを画定します。使用する各膜の特定のマーカーのための「プライマリ」、「セカンダリ」、および/または「第三紀」を選択します。 「フルスケールOを調整します細胞膜上の各マーカーについての最小しきい値または正のを見つけるD」。
    6. 「膜」タブの下に継続し、オプション「最大セルサイズ」を選択します。
      注：これは、細胞の最大サイズを指定する、ピクセル単位で、メンブレン値までの距離です。 12の値は、20X倍率で撮影された画像のために、通常適切です。
    7. すべてのオプションを選択した後、「セグメントイメージ」または「セグメントすべて」を選択してください。画像に設定を適用し、「個別」または「ギャラリー」モードでそれらを観察します。
      注：画像のトレーニングセット内のセルの分割結果に満足するまで、必要に応じて設定およびしきい値を調整し、再セグメント。

細胞の表現型5.

注：正確な細胞分割は、正確な細胞表現型を得るために必要な、と表現型の特徴は、トレーニング可能です。

  1. 「追加＆使用＃34; 「表現型」リストに表現型を追加するためのボタン。ユーザーは、表現型の色を選択することができます。
  2. 細胞に表現型を割り当てるために、「編集表現型」をクリックします。ユーザーが表現型を選択し、上に移動することができ、ドロップダウンメニューを表示するために特定のセルをクリックします。続行するために、各表現型の少なくとも5（5）細胞を同定します。各表現型の25以上のセルを選択することは、最適な結果を達成するために必要とされます。

6.得点IHCと共局在

  1. 「IHCスコアまたはIF」のステップに移動するには、「アドバンス」を選択します。スコアに「組織カテゴリ」を選択します。
    注：のみ1つの組織のカテゴリは、特定の分析の間に得点することができますが、別の組織カテゴリの採点結果が所望される場合、分析は異なる設定で、後に繰り返すことができます。
  2. 所望の「スコアリング」タイプを選択します。
    注：陽性は、目的のコンポーネントのための（正と負）は、2つのビンを作成し、二重陽性の共局在の分析のために使用されます。他のオプションは4ビン、10ビン、および50-ビンの選択のマーカーの分析が含まれます。
  3. スコアリング解析に使用される「コンパートメント」のセルを選択します。
  4. 一次核コンポーネントの最小しきい値を見つけると同様に、「ビューコンポーネントデータ」を選択し、目的の成分（複数可）のための陽性細胞についての染色の適切な光学密度の最小しきい値を見つけるために、訓練画像の上にカーソルを移動します。
  5. 強く染色された細胞が除外される場合は、適切なレベルに閾値maxを下げます。それ以外の場合は、分析のためのしきい値最大値を選択するために、オートボタンを使用します。
  6. しきい値の値を検証するために得点するためにトレーニング画像を選択してください。
    注記：特定のビン内の細胞の割合が返され、目視検査または手動計数によって比較することができます。完了したら、「エクスポート」のステップに進むために「アドバンス」を選択します。
7。アルゴリズムとバッチ分析を適用します

  1. トレーニングセットのデータをエクスポートすることにより、組織のセグメンテーション、セル分割、およびスコアリング値を使用して作成アルゴリズムをテストします。エクスポートディレクトリのための新しいフォルダを作成するために、画面の指示に従ってください。画像を選択し、テーブルが作成され、分析に含まれます。 「みんなのエクスポート」を選択して分析を行います。
  2. テーブルは、タブ区切りのテキストフ​​ァイルにエクスポートされ、ほとんどのデータ解析プログラムで開くことができます。
  3. 分析が完了すると、設定の精度を評価するためにハイとローの両方の染色画像のためのセル分割・スコアリングデータを表示します。
  4. 設定が完了したら、バッチ分析を介して画像のセット全体への画像のトレーニングセットから作成されたアルゴリズムを適用します。 「バッチ分析」タブをクリックし、オープンされたアルゴリズムは、アクティブなプロジェクトからコピーされます。
  5. 新しいエクスポートディレクトリを選択し、その画像やTABLを選択ESは、分析に含まれるべきです。入力ファイルのオプションでは、「画像を追加」し、バッチ分析に含まれるべきすべての画像を選択]を選択します。
  6. 「ファイル名を指定して実行」オプションを選択して分析を行います。トレーニングセットの分析と同様に、このステップは、特定の設定及び分析に含まれる画像の数に応じて、時間の可変量を必要とします。
  7. 完了すると、「レビュー/マージ」タブに進みます。バッチ分析からエクスポートディレクトリにバッチディレクトリのデフォルトは、必要に応じて変更することができます。選択して「すべて含む」と分析のための要約データとデータシートを作成するために「マージ」を選択します。

エクスポートされたデータの8解析

  1. データ解析ソフトウェアでエクスポートしたテーブルを開き、削除するか、そのような各コンポーネントの最小値と最大値などの解析に無関係なデータ列を、非表示にします。分析に使用される主なデータは、平均光学濃度cでありますすべてのコンポーネントのためのolumn。
  2. レビューは、分析から除外されるべきサンプルまたはTMAコアを決定するためにセグメンテーションマップと原画像を輸出しました。組織のパーセント値は、除外基準に最も頻繁に使用される、<5％の任意のカットオフを用いて、サンプルが含まれるべきかどうかを決定するかに役立ちます。
  3. 無関係なデータやサンプルを含む行はデータ分析から除外されるように削除します。
  4. 病状の変化や病気12,18-21の臨床病理学的特性との関係を調査するために、タンパク質の定量データを使用してください。

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結果

図1において、訓練は、非組織コンパートメントと共に、上皮および間質の部分に分割画像に前立腺組織上で行われます。上皮細胞膜マーカーE-カドヘリンを使用することにより、細胞分割は、 図2に示した核、細胞質、膜部分を分離するために行きました。

1つの実験において、我々は、 図3に示すように、AR、ERα、E-カドヘリン、およびCD147の発現と局在化を調査するために、多重化IHCを使用する。これらの技術を使用して、我々は両方のERαの核発現について陽性の細胞を識別することができると図3Aの緑色の矢印で示すように、比色信号をオーバーラップにもかかわらず- AR（3C 図3B）。私たちは、広報の異なる状態の中の二重陽性間質細胞の割合の著しい違いを発見しました...

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ディスカッション

タンパク質の発現を評価するための伝統的な免疫組織化学の使用は、分析22,23の主観的、半定量的な方法によって制限されます。アドバンス・プラットフォームは、バイオマーカーの発現と局在のハイスループット分析のために作成されています。組織および細胞内区画の両方の詳細なセグメンテーションは、ユーザーが関心のある他のマーカーとバイオマーカーの発現、局在化、および共局在を研究することができます。以前の研究では、我々は同じ細胞区画18,20,21に局在するタンパク質を研究するために使用される場合は特に、IHCの有用性とマルチスペクトル画像を実証しました。組織マイクロアレイ24と組み合わせると、これらの技術は、病理学者によって手動分析によって許容されるよりも、タンパク質発現のより速く、より客観的な定量化を可能にします。

タンパク質定量のための免疫組織化学を用いた1つの問題はsubjecによる結果の非再現性であります分析と技術および試薬に固有の差異の的性質。タンパク質の発現を測定するためにマルチスペクトル画像のようなプラットフォームを...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

著者は、その設備とサービスの利用のために、病理検査医学のUW省によってサポートされている部分とUWCCCグラントP30のCA014520で、病理検査室にウィスコンシントランスレーショナルリサーチの取り組みの大学に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キシレンフィッシャーケミカルX3F1GALNFPA評価:健康– 2、火災– 3、反応性– 0
エチルアルコール-200プルーフフィッシャーサイエンティフィック4355223NFPA評価:健康– 0、火災– 3、反応性– 0トリ
スベースフィッシャーサイエンティフィックBP152-500NFPA評価:健康– 2、火災– 0、反応性– 0
トリスヒドロキシメチルアミノメタンHClフィッシャーサイエンティフィックBP153-1NFPA 評価: 健康 – 2, 火災 – 0 , 反応性 – 0
Tween 20Chem-Impex1512NFPA 評価: 健康 – 0, 火災 – 1 , 反応性 – 0
リン酸緩衝生理食塩水フィッシャーサイエンティフィックBP2944-100NFPA評価:健康–1、火事–0、反応性–0
PeroxidazedBiocare MedicalPX968皮膚や目との接触を避けてください。皮膚の炎症や目の損傷を引き起こす可能性があります。
エストロゲン受容体αサーモフィッシャーサイエンティフィック-ラボビジョンRM9101危険物として分類されていない
アンドロゲン受容体SCBTsc-816危険物として分類されていない
CD147バイオデザインP87535M危険物として分類されていない
E-カドヘリンダコM3612危険物として分類されていない
ルノワールレッドアンディボディ希釈剤バイオケア医療用PD904トリスベースの抗体と連携するように特別に設計されています
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002鍋バリア
ペン-イムノエッジの使用に通常注意してください Vector LabsH-4000
変性キット-溶出ステップバイオケア メディカルDNS001H危険な
マッハ2 ヤギ抗ウサギHRPポリマーバイオケア医療RHRP520危険な
マッハ2として分類されていない ヤギ抗ウサギAPポリマーバイオケアメディカルRALP525
マッハ2ヤギ抗マウスHRPポリマーとして分類されていませんバイオケアメディカルM3M530危険な
ベタゾイドDABクロモゲンキットバイオケアメディカルBDB20041.DABは発がん性が疑われる物質であることが知られています.
2.DABコンポーネントを強い光や直射日光にさらさないでください.
3.適切な個人用保護具と衣類を着用してください.
4.DABは皮膚の感作を引き起こす可能性があります。皮膚や目との接触を避けてください.
5.廃棄に関するすべての連邦、州、および地方の環境を観察し
ワープレッドクロモゲンキットバイオケアメディカルWR806。皮膚の炎症や目の損傷を引き起こす可能性のある酸。 
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807飲み込むと有害
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807可燃性液体。熱、炎、火花から遠ざけてください。摂取または吸収により有害。皮膚や目との接触を避け、吸入を避けてください。
キャットヘマトキシリンバイオケアメディカルCATHEパープル ソリューション   a  マイルド  酢酸  アシッド  (お酢)  匂い。 5月  be
 イライラさせる に  スキン  または  目。 避ける  お問い合わせ   スキン  および  目。 避ける  摂取。
XYLマウントメディアリチャード・アレン8312-4NFPA評価:健康 – 2、火災 – 3、反応性 – 0
1.5 カバースリップ フィッシャーブランド22266858シャープエッジ
インキュベーション(湿度)チャンバー廃止廃止廃止 複数のベンダーが利用可能
対流式オーブンStabil- ThermC-4008-Q
背景パニッシャーブロッキング試薬バイオケアメディカルBP974本製品は危険物に分類されていません。 
inFormソフトウェアPerkinElmerCLS135781原稿で使用される主要なマルチスペクトルイメージングソフトウェア
ニュアンスソフトウェアPerkinElmerニュアンスEXソフトウェア 原稿Vectra顕微鏡およびスライドスキャナー内のスペクトルライブラリを作成するために使用されるソフトウェア
PerkinElmerVECTRAIM3イメージキューブを取得するための自動スライドスキャナーおよび顕微鏡
圧力 危険なとして分類されていません ます 腐食性

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