トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Summary

DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。

Abstract

クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復配列(CRISPR)/Cas9技術を持つベクターによって生成された標的DNA変異は、機能ゲノミクス研究に有用であることが証明されています。ほとんどのクローニング戦略は簡単に実行できますが、一般的には複数のステップを使用し、最終的なコンストラクトを生成するのに数日かかる場合があります。ここで紹介する方法は、DNAアセンブリに基づいており、1回のクローニング反応で完全に機能するCRISPRベクターを作製できます。ベクトル構築もプールできるため、プロセスの効率と有用性がさらに向上します。この方法の改良版は、複数の遺伝子標的を持つCRISPRベクターを作成するために使用されます。その後、CRISPRベクターをトマトの毛根に変換して、標的DNA修飾を持つトランスジェニック材料を生成します。毛深い根は、技術的に生成が簡単で、大規模な生産に適しているため、ベクターの機能をテストするのに便利なシステムです。ここで紹介する方法は、さまざまなCRISPRベクターの生成に使用でき、幅広い植物種に使用できるため、幅広い用途があります。

Introduction

CRISPR / Cas9で標的DNAの変更を生成する能力は、機能的ゲノム研究のための大きな可能性を秘めています。 CRISPR / Cas9システムの2つのコンポーネントがあります。 ブドウ球菌化膿連鎖球菌と、標的DNA部位（複数可^）1にCas9を指示およそ100-ntのガイドRNA（gRNA）分子に由来Cas9ヌクレアーゼ、。標的認識は、最初にによって与えられる〜ターゲティングベクター^2,3の高スループット生産を可能にするgRNA、20-NT。操作することができるほとんどの生物は、既にCRISPR / Cas9技術^4,5とされています。

植物では、例えば、CaMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターは、一般にCas9ヌクレアーゼ⁶の発現を駆動するために使用されます。 gRNAsはgRNAの最初の塩基を制限するRNAポリメラーゼIII U6またはU3プロモーターを用いて表現しているのいずれかG、効率的な転写のためのU3のためのU6、またはA、のために。しかし、RNAポリメラーゼIIのプロムこれらの制限のないotersも^、7,8を使用されています。

異なるgRNAsは異なる効率を有するDNAの突然変異を誘発し、最初に全植物の形質転換に投資するか、大規模な表現型の画面を設定する前に、CRI....

Protocol

1.ガイドRNAの設計とベクター構築

1. 目的の遺伝子のための標的配列を同定します。このステップ^13,14に適したオンラインCRISPRターゲット発見の様々なプログラムがあります。
   注：ここでは、GN ₂₀ GGの標的モチーフを使用していますが、他の設計は、使用するアプリケーションまたはベクターシステムに応じて適切であり得ます。
2. DNAの組み立てに必要とされる5 'および3' 20-ntの配列が隣接標的モチーフのGN ₁₉の部分を含むようにデザイン60-merのgRNAオリゴ。最終的な60マーモチーフはある：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3」。
   注：標準、脱塩したプライマーは正常に動作します。
3. アセンブリのための4つのDNA（ 図1）を準備します。 DNA配列のための補足ファイルを参照してください。
   1. 2時間37℃で1×緩衝液4中の制限酵素のSpeIとCas9 ¹⁰プラスミド：p201N5μgの- 1ダイジェスト。ダイジェスト列は、浄化します製造元の指示にccording。 〜10 mMトリス - 塩酸15μlのを中に再懸濁し、UV分光光度法により定....

Results

DNAアセンブリとCRISPRベクター構築は、一般的に独立したクローンの数十〜数百を生成します。 PCRによるコロニーのスクリーニングは簡単なトラブルシューティングのために有用である（ 図2A）の正確なクローンを識別し、インサートを有するとせずに、プラスミドを区別することができます。一般的に、クローンのすべては、インサートを含み、ユーザが完全にコロニースクリーニングのステップをスキップすることを選ぶことができます。診断消化物（ 図2B）およびサンガー配列決定は、品質管理のために使用されます。エラーが発生した場合、それらは通常、重複するDNA領域において観測される、すなわち 、5 'MtU6プロモーターの端、gRNA、または3'骨格配列の終わり。複数gRNAオリゴは、単一の反応にプールされている場合は、gRNAsは、サンガー配列決定によって決定されます。個々 gRNAsの取り込みを均一に分布され、gRNAsのほとんどは、単一の変換（ 図2Cから単離するこ.......

Discussion

DNAアセンブリは重複するDNA配列を再結合するために使用されるため、このクローニング法はあらゆるCRISPRベクター構築に適用できます。ほとんどのCRISPRクローニングスキームは、gRNAの遺伝子合成、IIS型制限酵素^17,18、またはオーバーラップ伸長PCR^{のいずれかを使用します19}。これらの技術にはそれぞれ固有の長所と短所がありますが、通常は複数の実践的なクローン作成ステップが必要です。ここで紹介するクローニング法の主な利点は、プロセス全体が1時間の1回の反応で行われ、gRNAオリゴをプールしてクローニング手順をさらに合理化できることです。さらに、DNA集合メカニズムは制限酵素とは無関係であるため、この方法は事実上すべてのDNA配列と互換性があります。便利なことに、不変のDNA成分(線形化ベクター、MtU6プロモーター、および足場)のマスターミックスを作成し、後で組み立てるために-20°Cで保存することができます。

GN₂₀GG gRNAターゲットモチーフを使用していますが、使用できる代替gRNAターゲット.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder®(HiFi DNAアセンブリミックス)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	p201H:Cas9 プラスミド (59176) も、報告されたオーバーラップおよび酵素に適合します。
pUC gRNA シャトル	Addgene	47024
SwaI	ニューイングランド バイオラボ	R0604S
SpeI	ニューイングランド バイオラボ	R0133S
ザイモ クリーン コンセントレータ-5 カラム精製	ザイモ リサーチ	D4003
NEB バッファー 2.1	ニュー イングランド バイオラボ	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	ニューイングランドバイオラボ	R3195S
StyI-HF®	ニューイングランドバイオラボ	R3500S
MS塩+ Gamborgビタミン	植物技術研究所	M404
フィタゲル&貿易;(ジェランガム)	シグマAldrich	P8169
GA-7ボックス	シグマAldrich	V8505
マイクロポア™外科用テープ	3M	1535-0
Timentin®(チカルシリン/クラブラン酸)	各種	0029-6571-26
プライマー 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATTAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
足場F	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG		に第2の結合部位があるため、サンガーシーケンシングには使用できません
。	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
太字のシーケンスは、線形化されたp201N:Cas9との20-ntのオーバーラップを示しています。