トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Summary

DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。

Abstract

クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復配列(CRISPR)/Cas9技術を持つベクターによって生成された標的DNA変異は、機能ゲノミクス研究に有用であることが証明されています。ほとんどのクローニング戦略は簡単に実行できますが、一般的には複数のステップを使用し、最終的なコンストラクトを生成するのに数日かかる場合があります。ここで紹介する方法は、DNAアセンブリに基づいており、1回のクローニング反応で完全に機能するCRISPRベクターを作製できます。ベクトル構築もプールできるため、プロセスの効率と有用性がさらに向上します。この方法の改良版は、複数の遺伝子標的を持つCRISPRベクターを作成するために使用されます。その後、CRISPRベクターをトマトの毛根に変換して、標的DNA修飾を持つトランスジェニック材料を生成します。毛深い根は、技術的に生成が簡単で、大規模な生産に適しているため、ベクターの機能をテストするのに便利なシステムです。ここで紹介する方法は、さまざまなCRISPRベクターの生成に使用でき、幅広い植物種に使用できるため、幅広い用途があります。

Introduction

CRISPR / Cas9で標的DNAの変更を生成する能力は、機能的ゲノム研究のための大きな可能性を秘めています。 CRISPR / Cas9システムの2つのコンポーネントがあります。 ブドウ球菌化膿連鎖球菌と、標的DNA部位（複数可^）1にCas9を指示およそ100-ntのガイドRNA（gRNA）分子に由来Cas9ヌクレアーゼ、。標的認識は、最初にによって与えられる〜ターゲティングベクター^2,3の高スループット生産を可能にするgRNA、20-NT。操作することができるほとんどの生物は、既にCRISPR / Cas9技術^4,5とされています。

植物では、例えば、CaMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターは、一般にCas9ヌクレアーゼ⁶の発現を駆動するために使用されます。 gRNAsはgRNAの最初の塩基を制限するRNAポリメラーゼIII U6またはU3プロモーターを用いて表現しているのいずれかG、効率的な転写のためのU3のためのU6、またはA、のために。しかし、RNAポリメラーゼIIのプロムこれらの制限のないotersも^、7,8を使用されています。

異なるgRNAsは異なる効率を有するDNAの突然変異を誘発し、最初に全植物の形質転換に投資するか、大規模な表現型の画面を設定する前に、CRISPRベクトルを検証するために重要であり得ます。植物におけるCRISPRコンストラクトの一過性発現は、例えば、アグロインフィルトレーションを使用して、一般的なアプローチでは非実用的変異の検出が困難と表現型のアッセイを行うこと、安定した植物体⁶と比較して、DNA修飾の低い周波数になります。いわゆる毛状根は、安定した植物についてヶ月とは対照的に独立した、安定に形質転換された材料の多くは、数週間以内に発生させることができるので便利で、代替システムです。 CRISPRベクターは、毛状根^9,10においてDNA突然変異を誘発するのに非常に効果的です。

DNAアセンブリ方法は、効率的overlを含むDNA断片を連結しますappingは^11を終了します。いくつかのDNAの組み立て方法の主な利点は、組み立てられた製品へのssDNA（ すなわち 、オリゴ）を組み込む能力です。 gRNAsのみ〜20ヌクレオチド長であり、新たなターゲットが合成オリゴを用いて作製することができるので、これらのDNAアセンブリ方法は、CRISPRクローニングに適しています。ここに記載されたプロトコルが正常に大豆^10、ポプラ¹²で使用され、現在はトマトされたCRISPRベクトルのP201シリーズに基づいています。提示クローニング手順は、現在のクローニング法¹⁰の上にいくつかの利点を提供しています。すなわち、完全に機能的なベクターは、1日に単一クローニング反応で生成することができます。ベクター構築はさらに手をオン還元時間と材料費、並行して複数のCRISPRベクトルを生成するためにプールすることができます。我々はまた、標的遺伝子の欠失を有するトランスジェニック材料を製造するための効率的な方法として、トマト毛状根を生成するためのプロトコルを提示します。毛状根を有効に使用されていますCRISPRベクトルを食べ、その後の実験のための材料を提供します。

Protocol

1.ガイドRNAの設計とベクター構築

1. 目的の遺伝子のための標的配列を同定します。このステップ^13,14に適したオンラインCRISPRターゲット発見の様々なプログラムがあります。
   注：ここでは、GN ₂₀ GGの標的モチーフを使用していますが、他の設計は、使用するアプリケーションまたはベクターシステムに応じて適切であり得ます。
2. DNAの組み立てに必要とされる5 'および3' 20-ntの配列が隣接標的モチーフのGN ₁₉の部分を含むようにデザイン60-merのgRNAオリゴ。最終的な60マーモチーフはある：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3」。
   注：標準、脱塩したプライマーは正常に動作します。
3. アセンブリのための4つのDNA（ 図1）を準備します。 DNA配列のための補足ファイルを参照してください。
   1. 2時間37℃で1×緩衝液4中の制限酵素のSpeIとCas9 ¹⁰プラスミド：p201N5μgの- 1ダイジェスト。ダイジェスト列は、浄化します製造元の指示にccording。 〜10 mMトリス - 塩酸15μlのを中に再懸濁し、UV分光光度法により定量化します。
   2. 第2時間、25℃で1×緩衝液3.1に制限酵素SWA Iで消化を行います。完全な消化を確認するために、0.8％アガロースゲル上でngの200から100を確認してください。
      注：正しく消化されたプラスミドは、14313塩基対で単一のバンドを持っています。注：酵素や脱リン酸化の熱不活性化は必要ありません。消化されたプラスミドは、-20℃で保存することができます。
   3. PCRは、それぞれ、プライマーSWA I_MtU6F / MtU6RとScaffoldF / Speを I_ScaffoldRを使用してのpUC gRNAシャトル¹⁰プラスミドからのMedicago truncatula（MT）U6プロモーターと足場のDNAを増幅します。 PCR条件と高忠実度ポリメラーゼ使用：3分間95℃。 （15秒、30秒、72℃20秒間、98℃、60℃）を31サイクル;そして5分間72℃。
      1. PCR PRの〜3μlのアリコートを可視化増幅を確認するために1％アガロースゲル上でoducts。 MtU6アンプリコンは377 bpであり、足場のアンプリコンは106 bpです。 -20℃でUV分光光度法およびストアによって定量化、製造者の指示に従って、残りのPCR産物をカラム精製します。
   4. 実験室グレードの水中で100μMのgRNAオリゴの管全体を再懸濁します。バッファー（1x）2.1の500μlに100μMオリゴの1μLを加えます。よく混ぜます。複数のオリゴをプールする場合は、バッファー（1x）2.1管に各100μMのオリゴの1μlを添加します。希釈されたオリゴは、-20℃で保存することができます。
4. 加熱蓋を使用して、50℃で保持するためのサーマルサイクラーをプログラムします。 MtU6プロモーターの線形化ベクター100ng（0.011ピコモル）、50 ngの（0.2ピコモル）、12 ngの足場の（0.2ピコモル）、希gRNAオリゴ（複数可）の1μL（0.2ピコモル）、および水の体積にコンバイン5μlの。 、2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの5μLを加え、よく混ぜるとスピンダウン。 60分間反応をインキュベート50°Cサーマルサイクラー。その後、氷上で反応を置きます。
   注：反応容量は低いDNA収量を収容するように増加させることができます。
5. コンピテントE.への反応の2μLを変換します50 mgのLを^-1カナマイシン（菅_50）を補充したLB上の標準的な技術やプレートを使用して大腸菌細胞。 37℃で一晩平板培養細胞を成長させます。 -20℃で、残りのDNA集合反応を保存します。
6. プライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。 5：水1で、残りのDNAアセンブリ反応のアリコートを希釈します。無挿入制御などCas9プラスミド：陽性コロニー画面の制御と円形p201N 1ngのよう1μLを使用してください。
   1. PCR条件で増幅します。 3分間95°C; 31サイクル（30秒95℃、30秒間58℃、30秒間72°C）。そして5分間72℃。 1％アガロースゲル上でPCR産物を可視化します。正しい挿入は725 bpおよびベクトルウィットでバンドを持っていることを確認してくださいハウトインサート（ 例えば 、切断されていないベクトル）310-bpのバンドを持っています。
7. 37℃で一晩LB菅₅₀液体培養で陽性コロニーを成長させ、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。サンガーシーケンスはStUbi3P218Rプライマーとプラスミドとエラーがクローニング中に導入されなかった確実にするためにMtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを揃えます。
8. エコ RVおよびSTY Iでプラスミドの〜1μgのを消化することによってダイジェスト診断を実行します0.8％アガロースゲル上で可視化します。 （塩基対で）断片は、以下のとおりです。4192、2001、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、および174。
9. 複数gRNAsでベクターを構築するためにDNAのアセンブリを使用してください。
   1. 2 gRNAカセットを有するベクターを構築するために、PCRは、それぞれの各1 ngのからUNS1_MtU6F / Speを I_ScaffoldRプ ​​ライマーを用いてプライマーSWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldRと第2の位置gRNAで最初の位置gRNAを増幅します1.8 - 手順1.1で構築したプラスミド。ステップ1.3.3でPCR条件を使用してください。増幅を確認するために1％アガロースゲル上でPCR産物の〜3μlのアリコートを視覚化します。アンプリコンは〜500bpです。
   2. 合わせて、200μlの管に未精製のPCR産物のほぼ等量を混合（典型的には3 - 各4μlの）。アセンブリのために、PCR産物を組み合わせた1μlを添加、SWA IおよびSpeの50 ngのは、私がp201N直線化：2.5μlのと2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの2.5μlにCas9、実験室グレードの水を。 15分間50℃でサーマルサイクラーでインキュベートします。
      注：DNA組立マニュアル2のための15分間のインキュベーションをお勧めします - 3断片を。
   3. コンピテントE.に2μlの- 1を変換しますLBカン₅₀上の大腸菌細胞とプレート。 37℃で一晩播種した細胞を成長させます。 -20℃で残りの反応を保存します。
   4. ステップ1.6と同様の条件でプライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。正しいClonesは1200 bpのアンプリコンを持つことになります。 LB館で陽性コロニー₅₀の液体培養物を、一晩増殖し、プラスミドを精製します。
   5. プライマーStUbi3P218R（最初の位置gRNAをカバー）とp201R（第2位置gRNAをカバー）とサンガーシーケンスプラスミド。 MtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを合わせます。 エコ RVおよびSTYと診断ダイジェスト私は（塩基対で）以下の断片になります：4192、2476、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、174太字の断片は、第二gRNAが含まれています。
10. すべての品質管理の期待に応えた後、 アグロバクテリウム・リゾゲネス株ARqua1 ¹⁵にプラスミドを形質転換します。 2.4 kVの、25μF、および200Ω：設定で1ミリメートルのキュベット内のエレクトロ細胞とエレクトロポレーションの50μlに、プラスミドプレップの1μlを添加します。 SOCの〜500μlの中で細胞を回収し、2時間28℃で振とうします。 LB菅₅₀とグラム上のプレート2日間28℃で行。 1.3.3と同じプライマー及びPCR条件を用いたコロニー画面を実行します。陽性クローンからグリセロールストックを作ります。

2.毛状根形質転換

1. 一定に混合しながら、15分間、20％の家庭用漂白剤でのトマトの種子を滅菌します。層流フード中で、漂白剤を除去し、無菌実験室グレードの水で3回洗浄します。
2. ½MS培地（2.22グラムのL ^-1 MS塩+ガンボーグビタミン、10グラムのL ^-1スクロース、3グラムL ^-1ジェランガム、pHは5.8）を含むGA-7ボックス内のプレート30の種子。光にGA-7ボックスを移動した後、暗所で〜2日間発芽。光の中で〜4日分以上の苗を育てます。
3. 変換前の日、ストリークアウトA.固体LBカン₅₀の文化をリゾゲネス 、一晩28℃で成長します。
4. 変態の日、層流フード内で無菌の材料組み立てる：12ミリリットル培養管を、50mlコニカルチューブ1/2 MS液体（無ゲラングラムUM）、200μMのアセトシリンゴン、濾紙、ペトリ皿、ピンセットやメス、ピペット及びピペットチップ。 1/2 MS 50mlにアセトシリンゴンの25μlを添加して、各培養チューブに〜6ミリリットルを注ぎます。
5. A.をこすりするために曲がった200μlのチップを使用します½MS液体の6ミリリットル中にプレートを再懸濁からリゾゲネス細胞 。ボルテックスチューブは完全に細胞を再懸濁します。各ベクターからの細胞を再懸濁した後、600 nMでの固定波長で細胞を1mlの光学密度（OD）を測定します。 ODが0.2と0.4の間であることを確認します。希釈又は、必要に応じて複数のセルを追加します。各構築物について、この手順を繰り返します。
6. 滅菌ろ紙でペトリ皿にの1/2 MS液体〜2ミリリットルを追加します。湿らせたろ紙上の苗木と場所から消費税子葉。一旦全ての子葉は、2つの切断端部を有する子葉片で、その結果、子葉のオフ遠位〜1cmにカットし、収集されました。 A.に外植片を追加します。 リゾゲネス溶液は、混合し、20分間インキュベート時折反転しています。
   注意：構造物あたり約12の外植片が日常的に使用され、多くの80として外植片をA. 6mlに接種されているもののリゾゲネスソリューション 。
7. A.間、 リゾゲネスのインキュベーション、1あたりの構築物は、形質転換、ペトリ皿にろ紙を追加します。また、乾燥する層流フードで、½MS固形培地、抗生物質なしを設定します。
8. A.から子葉をスクープ乾燥ろ紙上の滅菌ピンセットと場所とリゾゲネスソリューション 。次の変換処理中に、組織が乾燥しないようにペトリ蓋でカバーしています。 MS培地を1/2にろ紙と転送、背軸側を上にブロット子葉、。外科手術用テープでプレートをラップし、2日間室温で暗所での共同開拓。
9. 共培養した後、子葉を転送し、背軸側を上に、残油の成長を防止するために、300 mgのLを添加したMS培地^-1チカルシリン/クラブラン酸（ティム_300を 、1/2にUALのA.リゾゲネス ）とカン_50（植物選択用）および外科テープで包みます。 16時間の光周期で、室温で蛍光灯の下での培養を維持します。
10. 長さは2週間の根2cm以上滅菌ピンセットやメスを使用して、子葉から切り出し、MSカン₅₀ティム₃₀₀メディアを1/2に転送されます- 〜1.5後。単一のプレートに10〜15の根を転送します。マーク・マーカーと根の先端の位置、外科手術用テープでラップし、培養室で維持します。
11. 一週間後、形質転換された根は、選択培地上で成長が見られます。好適なDNA抽出法を用いて、DNA抽出のための形質転換根のサブサンプルを収穫。注：子葉を持つプレートは2のために保つことができる - もつれた混乱に成長し、単離することが困難である根を指した後3週ごとの収穫、。非収穫根組織を無期限に維持することができます。種々のアッセイは、単離されたDNA試料に対して実施することができますDNA変異の頻度及び種類を決定することです。いくつかのこのようなアッセイの結果を以下に記載します。

Results

DNAアセンブリとCRISPRベクター構築は、一般的に独立したクローンの数十〜数百を生成します。 PCRによるコロニーのスクリーニングは簡単なトラブルシューティングのために有用である（ 図2A）の正確なクローンを識別し、インサートを有するとせずに、プラスミドを区別することができます。一般的に、クローンのすべては、インサートを含み、ユーザが完全にコロニースクリーニングのステップをスキップすることを選ぶことができます。診断消化物（ 図2B）およびサンガー配列決定は、品質管理のために使用されます。エラーが発生した場合、それらは通常、重複するDNA領域において観測される、すなわち 、5 'MtU6プロモーターの端、gRNA、または3'骨格配列の終わり。複数gRNAオリゴは、単一の反応にプールされている場合は、gRNAsは、サンガー配列決定によって決定されます。個々 gRNAsの取り込みを均一に分布され、gRNAsのほとんどは、単一の変換（ 図2Cから単離するこ...

Discussion

DNAアセンブリは重複するDNA配列を再結合するために使用されるため、このクローニング法はあらゆるCRISPRベクター構築に適用できます。ほとんどのCRISPRクローニングスキームは、gRNAの遺伝子合成、IIS型制限酵素^17,18、またはオーバーラップ伸長PCR^{のいずれかを使用します19}。これらの技術にはそれぞれ固有の長所と短所がありますが、通常は複数の実践的なクローン作成ステップが必要です。ここで紹介するクローニング法の主な利点は、プロセス全体が1時間の1回の反応で行われ、gRNAオリゴをプールしてクローニング手順をさらに合理化できることです。さらに、DNA集合メカニズムは制限酵素とは無関係であるため、この方法は事実上すべてのDNA配列と互換性があります。便利なことに、不変のDNA成分(線形化ベクター、MtU6プロモーター、および足場)のマスターミックスを作成し、後で組み立てるために-20°Cで保存することができます。

GN₂₀GG gRNAターゲットモチーフを使用していますが、使用できる代替gRNAターゲット...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder®(HiFi DNAアセンブリミックス)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	p201H:Cas9 プラスミド (59176) も、報告されたオーバーラップおよび酵素に適合します。
pUC gRNA シャトル	Addgene	47024
SwaI	ニューイングランド バイオラボ	R0604S
SpeI	ニューイングランド バイオラボ	R0133S
ザイモ クリーン コンセントレータ-5 カラム精製	ザイモ リサーチ	D4003
NEB バッファー 2.1	ニュー イングランド バイオラボ	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	ニューイングランドバイオラボ	R3195S
StyI-HF®	ニューイングランドバイオラボ	R3500S
MS塩+ Gamborgビタミン	植物技術研究所	M404
フィタゲル&貿易;(ジェランガム)	シグマAldrich	P8169
GA-7ボックス	シグマAldrich	V8505
マイクロポア™外科用テープ	3M	1535-0
Timentin®(チカルシリン/クラブラン酸)	各種	0029-6571-26
プライマー 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATTAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
足場F	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG		に第2の結合部位があるため、サンガーシーケンシングには使用できません
。	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
太字のシーケンスは、線形化されたp201N:Cas9との20-ntのオーバーラップを示しています。