Method Article

機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

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生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。

Abstract

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機能的相補性アッセイ（FCA）が広く遺伝子/酵素の機能/役割を解明するために使用されるin vivoアッセイです。この技術は、生化学、遺伝学および他の多くの分野で非常に一般的です。酸、ペプチドグリカンや細菌の緊縮応答は、この原稿で報告されたアミノ酸に関連する生化学的経路の教育を補完する技術の包括的な概観。リジン（L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）およびチロシンとフェニルアラニンの代謝に関与するチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）の代謝に関与しているモデル植物生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの2つのcDNAが強調されている。また、細菌のペプチドグリカン同化経路は、クロスに関与する細菌Verrucomicrobium有棘からUDP-N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）遺伝子を解析して強調表示されていますペプチドグリカンの-linking。細菌の緊縮応答はまた、RSH（R ELA / sのポット時間 omolog）細菌Novosphingobium属におけるハイパームコイド表現型の原因二官能性遺伝子の解析を通じて報告される。FCAの4つの例が提示されています。ビデオは、それらの3、すなわちリジン、ペプチドグリカンと緊縮応答に焦点を当てます。

Introduction

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遺伝子の機能を解明するの文脈で機能的相補性（S）/役割（複数可）は、相同野生型状態を観察可能な表現型を有する特定の変異体を回復するために特定の相同またはオーソロガス遺伝子の能力として定義されますまたはオルソロガス遺伝子変異バックグラウンドにシスまたはトランスで導入されます。この技術は、広く分離し、機能（複数可）は、多くの遺伝子/役割（複数可）を識別するために使用されてきました。 1つの特定の例は、SのURA3変異体を使用して、 カンジダ・アルビカンスからオロチジン-5-リン酸脱炭酸酵素の単離および同定でありますcerevisiaeおよびE.ののpyrF変異体大腸菌 。1著者は、アミノ酸、ペプチドグリカンとその研究プログラムにおける緊縮応答の代謝に関与し、Bでの教育プログラムにこの技術を組み込んだ遺伝子の機能を解明するために、この技術を使用していますiotechnologyおよび分子バイオサイエンス（BMB）ロチェスター工科大学（RIT）でのプログラム。

原則と慣行（BPP）（ハドソン/ Savka）、RITでBMBのプログラムで2つの上部の分割選択科目の研究室ベースのコース：著者らは、植物生化学/病理学（FPBP）（ハドソン）とバイオセパレーションの基礎を教えます。コー​​スで議論されたトピック....

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Protocol

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注：著者は興味を持っている個人のための教育目的のための機能的相補性分析の組み込みを容易にするために、細菌株および組換えプラスミドを提供するために喜んでいます。機能的相補性実験を容易にするために使用したプラスミドは、表1に記載されています。

1.機能補完のためのプラスミドの構築を

  1. 機能的相補性のためのジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）のクローニング。
    1. V.からDAPLオープンリーディングフレーム（ORF）を増幅A.から有棘とのcDNA シロイヌナズナとC. PCRによるラインハーディ 。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4デオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれと、鋳型DNAの0.5 ngのとのPfxの1単位を含めますDNAポリメラーゼ。
      注：工場Aから3 DAPLオルソログの組換えクローニングに関連する完全な説明シロイヌナズナ （-dapL 時 ）、細菌Verrucomicrobium有....

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Results

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様々な機能相補分析に使用される菌株は、 表2に記載されています。

機能的相補性解析：L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）

E.大腸菌二重変異体AOH1（ΔDAPD :: Kan2、dapE6）は DAPE遺伝子の変異とDAPD遺伝子の完全な欠失（ 図1）を保有します。このように、変異体​​は、DAPが提供されていない限り、成長することができません。これらの突然変異に、AOH1が栄養要求性であると考えられる。DAPLはPGおよびLys合成（ 図を容易にするために、THDPから直接L、L-ジアミノピメリン酸の合成を触媒としてAOH.......

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Discussion

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ロチェスター工科大学でバイオテクノロジーおよび分子バイオサイエンスのカリキュラムに不可欠なコースの多くは、当然の講義部分に加えて、研究室のコンポーネントを持っています。学年2014-2015ためのカリキュラムは、約60％を占める研究室のコンポーネントが含まれている29そのうち48コースの合計が含まれています。そのようなコースは、植物生化学・病理学（FPBP）、ブレンド講義/実験室のコースとバイオセパレーションの基礎です：原則と実践（BPP）、実験室ベースのコース。

各コースの実験室の成分は、講義資料を強化するように設計されています。例えば、生化学的経路および代謝が重くFPBPとBPPで強調されています。トピックのいくつかは、アミノ酸代謝、ペプチドグリカン生合成、植物二次代謝、とりわけ環境ニッチに細菌の応答が含まれています。著者は、機能complemを統合しています講義およびまたはプレ実験室のプレゼンテーションで議論されている代謝経路の理解を強化する両コースでの実験室での演習としてentation。リジン、PG、Tyrを、Pheおよび細菌の緊縮応答の生化学的経路に関与する遺伝子の機能.......

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Disclosures

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Acknowledgements

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AOHとMASは、サポートのための科学技術のロチェスター研究所の生命科学のトーマスH. Gosnell学校の大学を認めています。この作品は、AOH MCB-1120541に米国国立科学財団（NSF）賞によって部分的にサポートされていました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli変異体Hudson/Savka labまたはCGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
エレクトロポレーターBiorad-USA1652100
エレクトロポレーションキュベットBiorad-USA1652082
温度制御インキュベータージェネリック
リック
ルリア寒天サーモフィッシャーサイエンティフィ22700025
ルリアブロスサーモフィッシャーサイエンティフィ12795084
M9ミディアムシグマアルドリッチ63011
ポテトデキストロースミディアムフィッシャーサイエントフィック DF0013-15-8
カナマイシンΣ-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
チミンΣ-AldrichT0376
クロラムフェニコールΣ-AldrichC0378
チロシンΣ-AldrichT3754
フェンリララニンΣ-AldrichP2126
アスパラギン酸Sigma-AldrichA9256
バリンSigma-AldrichV0500
ロイシンSigma-AldrichL8000
イソロイシンSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
アラビノースSigma-AldrichA3256
テトラシリンSigma-Aldrich87128
Taq DNAポリメラーゼサーモフィッシャーサイエンティフィック10342-020
プラチナpfx DNAポリメラーゼサーモフィッシャーサイエンティフィック11708-013
T4 DNAリガーゼサーモフィッシャーサイエンティフィック15224-041
大腸菌 Dh5-αサーモフィッシャー サイエンティフィ18258012
E. coli Top10サーモフィッシャー サイエンティフィC4040-03
pET100D/トポ ベクターサーモフィッシャー サイエンティフィK100-01
pCR2.1 ベクターサーモフィッシャー サイエンティフィK2030-01
マイクロ遠心分離機 ジェネックックック ック ック ック

References

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  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

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Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

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