コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング S。ベネズエラライフサイクル

放線菌は休眠、unigenomic胞子^1-3に多細胞、栄養捕捉菌糸体から形態的分化を含む複雑な発達サイクルを特徴とする土壌中に生息する細菌です。

有利な増殖条件下で、典型的なストレプトミセス胞子は、一つまたは二つの生殖管（ 図1）を押し出すことによって発芽し始めます。これらの管は、先端延長によって細長く、栄養菌糸として知られる分岐した菌糸のネットワークへと成長します。極性成長と菌糸の分岐が不可欠なタンパク質DivIVAによって指示されます。このコイルドコイルタンパク質は伸びる先端^4-7で新しい細胞エンベロープ材料の挿入のために重要であるpolarisomeを、と呼ばれる大きな細胞質複合体の一部です。栄養成長の間に、菌糸のフィラメントは、いわゆるクロス壁⁸の不定期の形成による区分化になります。これらのクロス壁の形成は、再帖のFtsZ、ほとんどの細菌⁹における細胞分裂に不可欠であるチューブリンのような細胞骨格タンパク質。 ストレプトマイセスでは、しかし、これらの植物の交差壁が収縮し、細胞-細胞分離につながらない、したがって、菌糸塊が相互接続された合胞体区画のネットワークとして残ります。十分に理解されていない栄養制限及び他の信号に応答して、特殊な気菌糸は栄養菌糸体から脱却し、空気³に成長します。これらの構造の勃起が長いマルチゲノム気菌糸が等しいサイズのunigenomic prespore区画の数十に分けになっている間、開発の生殖期を、開始します。この大規模な細胞分裂事象は、単一胞子形成菌糸^2,10内の複数のFtsZリングの同期収縮によって駆動されます。形態学的分化は休眠、厚肉、着色された胞子の放出によって完成されます。

ストレプトマイライフサイクルの重要な発生事象は十分^1,3を特徴とします。しかし、まだ何の不足などタンパク質の局在ダイナミクス、染色体移動および発生の制御、細胞分裂などの分化を支える細胞内プロセスへの洞察を提供するために、蛍光タイムラプス顕微鏡を用いる細胞生物学的研究があります。 ストレプト開発のライブセルイメージングが原因ライフサイクルの複雑さと、生物の生理学的特性の挑戦でした。栄養成長と胞子形成隔形成の初期段階でのこれまでの研究では、酸素透過イメージングチャンバーを採用し、または顕微鏡ステージ^11-15上のストレプトミセスセリカラーのアガロースサポート成長しています。これらの方法は、しかしながら、多くの要因によって制限されます。一部のシステムでは、唯一の細胞増殖ANの短期的なイメージングを可能にします細胞の前にDの蛍光タンパク質は、不十分な酸素供給に苦しむかによる菌糸の開発の3次元パターンに焦点面の外に成長します。長期的なイメージングが可能である場合には、アガロースパッド上で細胞を培養すると、細胞が代替増殖またはストレス条件に曝露することができないため、実験の柔軟性を制限し、アガロースパッドにおける媒体からのバックグラウンド蛍光が大幅に弱い蛍光を監視する能力を制限します信号。

ここでは、優れた精度と感度との完全なストレプトマイライフサイクルの生細胞イメージングのためのプロトコルについて説明します。蛍光広視野顕微鏡（図2）に接続されたマイクロ流体デバイスにストレプトミセスを成長させることにより、私たちは今までの30時間の時間をかけて発芽、栄養成長と胞子形成隔壁形成をモニターすることができます。これは非常に新しいモデル生物ストレプトミセスの使用によって促進されますベネズエラは、それは、液体培養でほぼ完全に胞子形成し、それによって、古典的なモデル種S.の限界を克服するため、固形培地^16-20にのみ胞子形成コエリカラー 、。栄養成長と胞子形成を視覚化するために、我々を共発現は、蛍光細胞極性マーカーDivIVAと重要な細胞分裂タンパク質のFtsZのバージョンをタグ付け。

我々が正常マイコバクテリア、 大腸菌 、 コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌および酵母^21-25のために使用された市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システムは、単一の焦点面に細胞を捕捉し、異なるリザーバからの培養培地の連続的なかん流を制御することができます。詳細なプロトコルでは、我々はSを露出させるためにこの機能を活用します胞子形成を促進するための栄養ダウンシフトに栄養菌糸体をベネズエラ 。

プロトコルデスクライブ全体ストレプトマイライフサイクルの生細胞イメージングのためのものであるが、特定の発達段階は特に重要である場合、代替メディア条件や顕微鏡の設定を選択することができます。

図2： 回路図は、実験的な作業の流れを描きました 。プロトコルで説明した3つの主要なステップが示されています。まず、胞子及び使用済み培地は、静止期培養物から調製されます。第二に、新鮮な胞子はマイクロ流体システム及びSにロードされていますベネズエラは、最適な成長温度を維持するために、インキュベーションチャンバーを完全に自動化された倒立顕微鏡を使用して発達ライフサイクル全体を通して結像されます。第三に、得られたタイムラプスシリーズを分析し、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して処理されます。

フレッシュSの1の単離ベネズエラ胞子および使用済培養液の調製

1. divIVA-mCherryをPが _のFtsZ -ひずみSV60 [attBで _φBT1 :: pSS209（Pの _divIVAの10μlの胞子を、60μlのR2の微量元素溶液（TE）を補充した30ミリリットルマルトース酵母エキス、麦芽エキスを接種する（MYM）培地、 -ftsZ-ypet）]。一貫性のある成長と細胞の胞子形成のために、バッフル付きフラスコまたは十分な通気を可能にするために、スプリングが含まれているフラスコを使用します。
2. 30℃で35-40時間、および250 rpmのための培養細胞。
3. 液体マウントされ、位相差顕微鏡により細胞を調べます。この時点で、菌糸体断片および胞子が表示されます。
4. 菌糸体と、より大きな細胞断片をペレット化するために1分間400×gで卓上遠心機で遠心1ミリリットルの細胞。
5. 約300μlの上清の共同を転送新しい1.5 mlチューブに胞子の懸濁液をntaining、氷上に保ちます。ステップ1.7の残りの培養液を保管してください。
6. 胞子をMYM-TE 1:20希釈（最終濃度：0.5〜5×10 ⁷胞子/ ml）を、必要になるまで氷上で維持する（ステップ2.3参照）。
   注： ストレプトミセスに胞子形成を誘発する正確な条件は、胞子形成培養物から任意の未知の細胞外シグナルを含む、使用済みMYM-TE媒体を使用して、理解されていないが、胞子形成を刺激します。
7. 胞子および菌糸体断片の自由であるMYM-TE費やし得るために、残りの培養液の10ミリリットルを濾過滅菌します。滅菌0.22μmのシリンジフィルターを使用して、転送は、滅菌15mlチューブにMYM-TEを過ごしました。
8. 同様の成長条件を使用して、追加の実験を行うことになっている場合は4℃で数日のために準備を過ごしたMYM-TEを保管してください。

マイクロ流体デバイスの作製

注：各マイクロ流体ナンプラーをteが行わなければ、4つの独立した実験まで可能になります。実験を設定する際に、未使用のフローチャンバーの汚染を避けるために、滅菌溶液と労働条件を使用しています。

1. マイクロ流体プレートから出荷溶液を除去し、滅菌MYM-TEでウェルをすすぎます。
2. 6へのウェル2にMYM-TE費やしウェル1および300μLを入口に300μlのMYM-TEを追加します。
3. 負荷40μlをレーン「A」のセルローディングウェル8のステップ1.6から胞子を希釈し、指示を製造に係るプレートにマニホールドを密封します。
4. ウェルあたり2分間6 psiで5に入口ウェル1からの媒体を流すことによって、マイクロ流体制御ソフトウェアを起動し、適切なプレートタイプを選択し、プライム流路と培養室にフロープログラムを設定します。
5. 発芽および細胞の栄養成長を可能にするために、6時間、入口ウェル1からMYM-TEを流れる：マイクロ流体制御ソフトウェアでは、実験のためのフロープロトコルを作成します。スイッチその後、実験の残りの時間のためだけでなく、2〜5からの使用済みMYM-TEの灌流に。実験中（約9μlの培地/時間に相当）6 psiで流れ圧力を一定に保ちます。ステップ3.5の後にフロープログラムを起動します。

顕微鏡とタイムラプスプロトコルの3セットアップ

注：このメソッドは、sCMOSカメラ、メタルハライドランプ、ハードウェアのオートフォーカス、96ウェルプレート用ステージホルダーと環境チャンバを装備した完全電動および自動化倒立広視野顕微鏡に実装されました。

1. 実験を開始した後、オートフォーカスの問題を防止するために、予め30℃に環境チャンバをあらかじめ温め。必要な時間は、使用環​​境室、顕微鏡や暖房システムに依存します。実験前の夜システムを加熱するために開始します。
2. 顕微鏡と顕微鏡検査の自動化と制御softwaをオンにします再。このような100X、1.46 NA油DICの目標として最適な信号の収集と空間分解能、高開口数（NA）油浸対物レンズを使用してください。蛍光黄色と​​赤の蛍光タンパク質融合体の微分干渉コントラスト（DIC）画像と画像を取得するために、適切なフィルタおよび二色性ミラーを選択します。
3. 客観的にイマージョンオイルの滴を置き、画像取得時のセルにフォーカスを改善するために、マイクロ流体板上に撮像窓の下に液浸流体を追加します。慎重に倒立顕微鏡のステージ上にシールマイクロ流体デバイス（ステップ2.5）をマウントします。プレートがしっかりとステージホルダーに配置され、実験の過程にわたってシフトしないことを確認してください。
4. オリエンテーションのために埋め込まれた位置マーカーを使用して焦点にマイクロ流体培養室の撮像窓を持参してください。に対応し、トラップサイズ5を有する第一のフローチャンバー（ラベル「A」）の一番左の部分に焦点を合わせます0.7ミクロンのトラップの高さ。
5. マイクロフルイディクス・ソフトウェアでは、入口ウェル8からロードセル15秒4 psiで。撮像窓全体にステージを移動させることにより、培養チャンバー内の細胞密度を確認してください。何の胞子がトラップされなかった場合は、セルの負荷ステップを繰り返すまたは代わりに所望の細胞密度が達成されるまで（2048 X 2048ピクセルの撮像窓あたり1-10胞子）負荷圧力および/または時間を増加させます。培養室の過負荷を避けます。
   私たちは通常、 ストレプトミセスを撮像するためのトラップサイズ5を使用しますが、我々はまた、4と3は、セルロードプロセスを最適化する上で追加の提案を供給業者のマニュアルを参照してくださいサイズトラップとの良好な結果を得た：注意してください。
6. ステップ2.5からの制御ソフトウェアのフロープログラムを起動し、マイクロ流体板は、画像取得を開始する前に、顕微鏡ステージで1時間熱平衡化することができます。
7. 顕微鏡制御ソフトウェアでは、ミューを取るために多次元の取得を設定時間をかけて複数のステージ位置でltiple画像：
   1. 自動保存の場合：画像ファイルの自動保存のためのディレクトリを指定します。
   2. イルミネーションの設定については、事前に各特定の構築物のための最適な照明設定を決定します。 DIC 150ミリ秒、YFP 250ミリ秒、RFP 100ミリ秒：概説実験のために、以下の露光時間を使用します。
   3. 時系列の場合：シーケンス内の所望の時点で画像を取得する時系列を設定します。 S.のライフサイクルを撮像しますベネズエラ 、24時間かけて40分の時間間隔を選択します。
   4. ステージの位置やオートフォーカスの場合：対象の各撮影位置の舞台と店舗ステージ位置を移動させることにより、培養室をスキャンします。シングルステージの位置は、光退色最小限に抑え、phototoxicity.Typicallyは12ポジションまで使用するのに十分に離れて配置されていることを確認してください。遅い焦点ドリフトを補正するために、各時点でオートフォーカスのルーチンを実行します。顕微鏡制御ソフトウェアで利用可能な場合、「ハードウェアのオートフォーカスにより局所的な表面更新」へのオートフォーカス方式を設定します。選択されたステージ位置のZ座標が確認されると、ハードウェアのオートフォーカスを有効にします。
8. 顕微鏡制御ソフトウェアのタイムラプス実験を開始します。
9. すべてのステージの位置は、後のポイントで焦点に残っていることを確認してください。数時間かけて実行してタイムラプス実験のために、私たちは時折、オートフォーカスを使用していても、ステージのドリフトを観察します。ステージ位置をリフォーカスする必要がある場合は、適切な時点で実験を停止し、フォーカスを調整し、定義された撮影時間間隔（ステップ3.7.3）内で実験を再起動します。時系列を連結する方法については、ステップ4.3を参照してください。
10. 24-30時間後に画像取得を停止するか、関心領域内の菌糸が胞子に分化したとき（DICイメージシリーズを参照してください）​​。ソフトウェアでフロープログラムを停止し、マイクロ流体デバイスを分解。
11. 短期STOの中古マイクロ流体板を準備激怒。に残っているMYM-TEを削除し、6によく1からMYM-TEを費やし、空の廃棄物ウェル7とセルの負荷も8無菌条件下で、レーン「A」の再充填使用ウェルおよび未使用レーンのウェル（ "B"滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でプレート上の「D」）。 4℃で乾燥し、ストアからそれを防ぐためにパラフィルムでプレートを密封します。

フィジーのソフトウェアを使用したタイムラプスムービーの4世代

注：我々は、さまざまな商用フリーソフトウェアパッケージはZenBlue、をMetamorph、ICY、イメージプロ（ImagePro）またはImageJを含むタイムラプス顕微鏡画像を処理するために利用可能であることに注意してください。ここでは、ImageJのに基づいてオープンソースの画像処理プログラムであるフィジー、に焦点を当て、かつ、既に有用なプリインストールされているプラ​​グインの数を提供します。

1. フィジーがインストールされているコンピュータへのあなたのタイムラプス実験から転送イメージングデータ。
2. プログラムを起動して、＆用いた撮像ファイルをインポート＃34;ファイル]> [インポート]> [バイオフォーマット」。かでは単にフィジーにイメージングファイルをドラッグして「バイオフォーマットインポートオプション各照明チャンネルに別々の画像スタックを取得するために分割チャンネル ""、ボックスにチェックを入れ、「（DIC 、RFP、YFP）。
3. オプション：（DIC、RFP、YFPチャンネルごとに、起因するリフォーカス（ステップ3.9）に、画像取得中の破損に起因する個別の時系列をマージし、それぞれの画像スタックを開き、実行する「イメージ>スタック>ツール>を連結する」ために）。
4. 画像スタックをスクロールすることにより、時系列データの品質を評価します。時間をかけてフォーカスに滞在菌糸、ショーの菌糸の成長を探し、最終的に胞子（DICスタック）を形成します。それぞれ、栄養または胞子形成菌糸（YFPスタック）内の単一の環または複数、梯子状の構造を形成する菌糸先端にDivIVA-mCherryを（RFPスタック）とのFtsZ-YPetの予想細胞内局在を調べます。
5. 下流processiのための関心領域を分離画像のngの。タイムラプス顕微鏡は、多くの場合、フィジーでの処理が遅くなることがあり、大きなファイルを生成します。したがって、特定し、関心領域（ROI）を分離し、画像スタックのこの小型版で、さらに画像処理ステップを実行するようにすることをお勧めします。
   1. メニューで「長方形選択」ツールを選択し、開発菌糸が画像シリーズ全体のROIで囲まれているようにDICの画像スタック内の長方形のROIを描きます。
   2. 「Ctrlキー」+「Shiftキー」+「D」とROI-スタックを複製します。
   3. YFPの画像スタックの名前バーをクリックして選択し、「編集>選択>選択を復元する」YFPスタック内の同じ位置決幅にスタック元DICから前の長方形の選択範囲を復元し、「Ctrlキー」でROIを複製するには、メニューに+「Shiftキー」+「D」。
   4. RFPスタックこのプロセスを繰り返します。
6. 3画像スタックトンに画像を合わせますO時間をかけてxy平面内のステージのドリフトを除去します。 DICスタック内の最後のフレームにスクロールして、メニューから「プラグイン>登録> StackReg> Ri​​gedBody」を選択します。 RFPとYFPの画像スタックに対して、この手順を繰り返します。必要であれば、ステップ4.5.1-4.5.3を繰り返すことでROIをトリミング。
7. オプション： ">プロセスコントラストを高める」「明るさとコントラストツールを調整する」（「Ctrlキー」+「Shiftキー」+「C」）または選択で各画像スタックのために、手動で明るさとコントラストを調整して、メニューからと「ノーマライズ」を適用しますスタック内のすべての画像へのコマンド。後者のコマンドは、ピクセル値を変更し、従って下流の画像解析に影響を及ぼし得ることに留意すべきです。
8. オプション：「コンバイン>画像>スタック>ツール」プラグインを使用して、水平または垂直（4.11を参照して、RGBファイル形式に変換）個々のスタックを結合します。
9. スケールバー（「分析>ツール>スケールバー」）と時間スタンパを追加（＆＃34;画像>スタック>タイムスタンパ」）。
10. 「.TIFF」形式の画像シーケンスとして修正された画像スタックを保存します。映画を生成するには、「.AVI」として保存します。 「バイオ・フォーマット>バイオフォーマット輸出」プラグインを使用して、QuickTime形式で別の方法として、輸出画像シリーズと「.MOV」ファイルの種類を選択します。
11. 、単一のフレームから画像を取得し、目的のフレームを選択し、画像の "Ctrl" + "Shiftキー」+「D」を複製します。 「RGB」または「8ビット」の下の ">画像> RGBカラーまたは8ビットを入力」と「.TIFF」として画像を保存するために、得られた画像の種類を変更します。
    注：フィジーは、さらに注釈を付けるための追加機能が多数用意されていますまたはプロセスのタイムラプスシリーズ。詳細情報（http://fiji.sc/Fiji）のためのフィジーオンラインサポートにアクセスしてください。

全体Sの成功した生細胞イメージングベネズエラのライフサイクルは、発芽、栄養生長および胞子形成（ 図3、映画1）の主要な発達段階を含む連続時系列が得られます。ライフサイクルを通して進行の可視化は、さらにDivIVA-mCherryをとのFtsZ-YPetの別個の細胞内局在性によって強化されています。発芽し、栄養成長の間に、DivIVA-mCherryを排他的に新たに分岐点（ 図4A）を形成する成長菌糸のヒントやマークに蓄積します。これらの結果は、DivIVA 12,26の以前に報告された細胞内の位置決めと一致しています。対照的に、のFtsZ-YPetは成長菌糸体（ 図4B）で不規則な間隔で単環様構造を形成します。これらの構造はinterconnの形成をもたらす、非収縮栄養クロス壁の合成のための足場を提供しますected菌糸のコンパートメント8。胞子形成菌糸に菌糸の成長、細胞分化が極性DivIVA-mCherryを病巣の消失によって見えるようになり、極性成長の逮捕とのFtsZ-YPet蛍光の同時増加（ 図4C）。菌糸を胞子形成では、のFtsZ-YPetの局在パターンは劇的に変化します。第一螺旋のFtsZ-YPetフィラメントは菌糸に沿って転倒し、その後、突然、ほぼ同期イベントでは、これらのヘリックスは規則的な間隔のFtsZ-YPetリングのはしごに合体します。ここに記載された実験条件下では、これらの均等に分散のFtsZ-YPetはしごは約2時間持続します。最後に、胞子形成セプタムは、微分干渉コントラスト（DIC）画像（ 図4D）で識別可能になり、最終的に新しい胞子が放出されます。

提供フィジーのソフトウェアを用いて画像処理を記述し、その後のプロトコル取得されたタイムラプスシリーズ（動画1）から公開の映画を生産する方法のTEPバイステップで解説。

図3：Sの代表的なタイムラプス蛍光顕微鏡シリーズからのスナップショットイメージ ベネズエラ 産蛍光標識のFtsZ（緑）、DivIVA（レッド）マージされた画像の選択されたフレームがある示され（上部パネル：RFP-YFP-DIC、下のパネル：DIC）。発芽、栄養成長と胞子形成を含むストレプトミセスのライフサイクルを可視化します。画像はムービー1時間から採取した時間である：分。スケールバー=5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図4： ストレプトマイライフ サイクル の成功タイムラプスシリーズの代表的な結果 DivIVA-mCherryをの（A）ローカライズ。 RFPとDICチャネルのマ​​ージされた画像とムービーの1から2以降の時点のスナップショットが示されています。 DivIVA-mCherryを、新しい菌糸のブランチサイト（充填された矢印の頭）をマークし、極性成長（オープン矢印ヘッド）を指示するために菌糸の先端に局在します。スケールバー=10μmの（B）のFtsZ-YPetローカリゼーション栄養成長（矢じり）の間。 FtsZ-YPetは（DIC、下のパネル）を収縮しない単一のリング状の構造（上パネル）を形成します。胞子形成隔壁形成時の（C）のFtsZ-YPet（緑）の局在。 （：分時間）DivIVA-mCherryを病巣は、下記に示す経過時間と、赤で示されています。スケールバー：5μmです。 （D）（C）からの胞子形成菌糸のDIC画像を対応する形を示します最終的には胞子の連鎖（右画像）に成熟可視胞子形成隔壁（左画像）とprespore区画のエーション。時間は時間である：分。スケールバー=5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ムービー1： ライフサイクル ベネズエラストレプトミセス のタイムラプス蛍光顕微鏡シリーズ映画がマージされたRFP-YFP画像（左）と対応する微分干渉コントラスト（DIC）画像（右）から構成されています。 DivIVA-mCherryを、緑色、赤色とのFtsZ-YPetに示されています。単一のフレーム間の時間間隔は40分です。スケールバー=10μmである。 THIを表示するには、こちらをクリックしてください。Sムービー。

著者らは開示するものは何もない。