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方法論記事

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、

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⸱

DOI:

10.3791/53864

⸱

2016年4月17日

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

この記事について

サマリー

聴覚器官は聴覚を媒介します。ここでは、発育中のニワトリ聴覚器官における聴覚前駆細胞の増殖と分化を研究するために最適化された、修正されたin ovoマイクロエレクトロポレーション法を紹介します。

要約

ニワトリ胚は、遺伝子機能の操作は、 卵で比較的容易に行うことができるように胚発生を研究するための理想的なモデル系です。内耳の聴覚感覚器官は聞くする当社の能力にとって重要です。これは、メカノ形質導入有毛細胞（HCS）と周囲のグリア細胞様細胞（SCS）をサポートで構成されて専門性の高い感覚上皮を収容します。聴覚器官の構造的な違いにもかかわらず、聴覚器官の発達を制御する分子メカニズムは、進化的に哺乳類と鳥類の間で保存されている、卵 、エレクトロポレーションでは 、E1での初期段階に大部分が限定されている- 。E3。原因E5での聴覚器官の相対的な開発後期に、E3過去オボエレクトロポレーション中による聴覚器官の操作が原因後の段階でのニワトリ胚の高度な発展には困難です。ここに提示された方法は、で目的の遺伝子を標的化するための過渡的遺伝子導入法でありますステージE4 - オボマイクロエレクトロポレーションで経由して開発鶏の聴覚感覚器官でE4.5。この方法は、従来のプラスミドDNAベースの発現ベクターでgain-及び喪失機能のために適用可能であり、で全胚にEDU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）を加えることによって卵細胞増殖アッセイにおいて組み合わせることが可能でエレクトロポレーションの時間。緑色または赤色蛍光タンパク質（GFPまたはRFP）発現プラスミドの使用は、実験者がすぐにエレクトロポレーションが正常に開発内耳の聴覚部分を対象とするかどうかを決定することを可能にします。この方法の論文では、GFPエレクトロポレーション標本の代表的な例が示されています。エレクトロポレーション後96時間および聴覚器官のプロ感覚の領域にGFPの標的化RNA in situハイブリダイゼーションによって確認された-胚は18を収穫しました。メソッド紙はまた、細胞prolifを分析するチミジンアナログEDUの使用のために最適化されたプロトコルを提供しますeration。免疫標識を結合し、EDUのクリック化学EDU基づく細胞増殖アッセイの例が提供されます。

概要

哺乳類や鳥類の聴覚感覚器官との間の形態や細胞パターニングの違いにもかかわらず、感覚HCの開発を担当した分子の要因と経路は、進化的に1-3で保存していると考えられています。聴覚のHCとその周辺のSCを収容する基底乳頭は、内耳の耳胞のoutpocketingとして開発しています。初期のHCとSC前駆細胞のプールには、耳プラコード/耳のカップ神経感覚有能なドメイン（NSD）内に指定されています。フェイト・マッピングデータは、神経や感覚系統がリンクされていることの証拠を提供し、マウスやニワトリの4,5で耳のカップや耳胞の前-腹側領域に位置NSDから生じます。まず、神経芽細胞は、最終的には聴覚と前庭神経節に分割聴覚・前庭神経節の神経細胞を生じさせるためにNSDから剥離し。これらのニューロンは、脳幹における内耳および核の感覚のHCを支配します。細胞番目NSDに残るでメカノ伝達感覚のHCおよびその関連のSCからなる、聴覚感覚器官を含む様々な感覚パッチを生じると考えられています。

ひよことマウスの両方で、聴覚器官感覚前駆細胞周期の出口とHCの分化は、対向する勾配で発生します。ひよこでは、聴覚前駆細胞周期の出口が〜E5の周りに始まり、頂点にベースから進行し、中心部から周辺部6へ。 1日後、HC分化が頂点に始まり、ベース7に進みます。複雑な手術を必要とする、他のモデル系に子宮内で胚を操作するとは対照的に、機能的なメカニズムが卵内で比較的容易に調べることができるように鶏における内耳の開発を研究することは、多くの技術的な利点を提供します。ここで説明する方法は、推定basilaに目的の遺伝子を標的とするために、卵のマイクロエレクトロポレーションに使用しています特にE4で耳胞で前方 - 腹側R乳頭エリア。

卵内エレクトロポレーションは十分に確立され、一般的に8月14日に使用されている技術です。エレクトロポレーション技術の原理は、ヌクレオチド（ 例えば、プラスミドDNA、合成DNA、またはRNAオリゴヌクレオチド）、負に帯電しているという事実に基づいています。 DNAは、目的の組織に注入されます。電流が組織を横切って配置されると、電流は、細胞壁に過渡毛穴を開き、負に帯電したDNAは、正極（陽極）に向かって流れるように、DNAの取り込みを可能にします。機能獲得型実験のために、目的の遺伝子は、一般的に緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）のために適切な発現カセットを含む発現プラスミドにサブクローニングします。機能喪失実験のために、プラスミドベースのドミナントネガティブリプレッサー構築物またはRNAi、またはモルホリノ構築物は、cはommonly 15,16を使用していました。ベースのプラスミド、典型的には、マイクロRNA（miRNAの）機能のmiRNAスポンジ構造を、抑制するために、17を使用することができます。 卵マイクロエレクトロポレーション法で容易に全胚にEDUを添加することによって卵細胞増殖アッセイ中で組み合わせることができ、ここで説明する方法は、聴覚器官に増殖および分化を制御する分子機構を調査することを可能にします。

エレクトロポレーションおよびEDUの添加は、一日の聴覚器官における細胞周期の出口の開始前である耳胞でE4で行われます。聴覚器官の分析は、典型的には18行う - E5（感覚前駆細胞周期の出口の開始）、E6（HC分化の開始）、及び（HC分化中）E7でエレクトロポレーション後96時間に、以降〜E9（HC分化の終わり）まで。遺伝子導入のこのエレクトロポレーション法は、約3〜4日間持続する一過性であるbecauSEは、目的の遺伝子がゲノムに統合されませんが、この方法は、このようなTol2の媒介遺伝子導入11として、ゲノムに統合する能力を持っている適当なプラスミドDNAベースの発現ベクターでの使用にも適用可能です。この方法堅牢なGFPまたはRFP発現と、蝸牛に〜4日間持続する信号は、フェード、その時点の後、まだ聴覚器官の複雑な発達を研究するための十分な時間窓を提供します。 卵内遺伝子導入法ではこれは新規であり、特に聴覚器官にHCの開発に注力調査のために最適であるE4で推定聴覚器官を、ターゲットとすることができます。それは、11,12またはin vitroでの脳底乳頭の外植片培養18の使用に比べ、はるかに年下の発達段階をエレクトロポレーションの代替方法、に優れた付加です。

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プロトコル

卵と未孵化胚の世話をし、倫理的かつ人道的に扱われます。未孵化胚の使用のためのすべてのプロトコルは、医学、ボルチモア、メリーランド州のジョンズ・ホプキンス大学で動物実験委員会によって承認されました。

1.卵と発現構築物の作製

  1. 卵：
    1. 37℃で、その両側に平らに横たわっ（ ガルスガルス ）4ダース受精鶏卵- 3をインキュベートします。
      1. インキュベーションの24時間後、卵のラウンドバックエンドから注射器で卵白の3 CCを引き出し、明確なテープで穴を塞ぎます。これは、卵19の上にアクセスするためのウィンドウを切断する際に胚がシェルに付着することなく、胚へのアクセスを容易にするためにできるように、胚および卵殻との間に空気室を作成します。
      2. インキュベーション時間の117時間で、ハンバーガーとハミルトン20発達段階に応じて胚を上演E4（HH24-25）で（ 図1Dを参照してください）。
  2. 発現は、構築します：
    1. 試薬を用いてプラスミドDNAと市販の調製キットの製造業者によって提供されるプロトコルを準備します。準備の最終段階で、1.5ミリリットルチューブにキットで提供500μlのTE（トリスEDTA）バッファーにDNAを溶出します。
    2. エタノールを試験管に3 M酢酸ナトリウムを50μl、100％エタノール1mlを添加することにより、それを濃縮するDNAを沈殿させます。 -20°CO / Nでチューブを置きます。
    3. 遠心機で4℃で14,000rpmで30分間チューブ。上清を除去し、室温で10分間、ペレットを空気乾燥させます。 〜4μgの/μlの濃度が得られるはずです15μlのTE緩衝液中のペレットを、溶解させます。
      注：ここで使用されるコントロール発現構築物は、ニワトリβアクチンプロモーターによって駆動されたPME-IRES-GFP 10、またはPCI-H2B-IRES-RFPですCMVプロモーターによって駆動される> 10、アップ。

OVOマイクロエレクトロポレーションではとOVO細胞増殖アッセイ2.チキン

  1. 発現構築物およびマイクロエレクトロポレーションのOVOマイクロインジェクションには ：
    1. 2.5×2.5ミリメートルボックスプラチナ暖房フィラメントのため、以下の最適化されたパラメータを用いて、マイクロピペットプラーを使用して、細い針にガラスキャピラリーチューブを引い：圧力= 500、ヒート= 600°C、プル= 64、ベロシティ= 105、およびTime = 150ミリ秒（ 表1参照）。
    2. （ 図1A参照）左目と顕微鏡に隣接する右利きマイクロマニピュレーターステージを設定します。右利きのマイクロマニピュレーターは、ガラスキャピラリー針を保持し、左ききのマイクロマニピュレーターは、電極（ 図1A）を保持します。
    3. 切断することにより、マイクロインジェクション用細かく引っ張らガラスキャピラリー針を準備鉗子で針の先端を顕微鏡下での作業中。
    4. 顕微鏡下での作業中に、0.1％ファストグリーンで着色のプラスミドDNA 2.5μlのマイクロマニピュレーターを用いて手で手動で針を埋めます。
    5. （ 図1A参照）、金型/卵保持装置内にその側に横たわって卵を置きます。はさみ19（ 図1A）を使用して、卵の上に丸い窓をカットします。
    6. 顕微鏡下で働いているが、慎重にピンセットを用いて胚を重ねる2膜を開きます。
    7. 顕微鏡下で働いているが、手動マイクロマニピュレーターを用いて、マイクロエレクト​​ロポレーションにより右手を使用して、マイクロインジェクションにより右耳の小胞内腔へのプラスミドDNAの約〜0.5μLを提供します。
      1. 同時に左手holdinを使用しながら、これを行うには、右側のマイクロマニピュレーター（ 図1B-D）とDNAと右耳の小胞の内腔をマイクロ注入胚の頭部がステージE4でディップので、胚の頭部を安定するためのGA鉗子。これは耳の小胞が破損しますので、耳の小胞の内腔を越えてマイクロ注入しないでください。
      2. すぐにマイクロインジェクションした後、顕微鏡下での作業中に、正（アノード）白金電極の前方腹右耳のベシクルと並列に負の2ミリメートルの電極（陰極）に2ミリメートルを配置するために左側のマイクロマニピュレーターを使用1ミリメートル離れた（ 図1 Cを参照）。 100ミリ秒の持続時間と200ミリ秒間隔で12 Vで4パルスを配信します。左耳の小胞は、内部未処理のコントロールとして機能します。
        注：1×PBSに浸した綿棒でエレクトロポレーションの間に電極を清掃してください。
  2. OVO細胞増殖アッセイでは ：
    1. すぐにエレクトロポレーション後に手動で全体に50μlのEDUの溶液を滴下することにより0.25 mg / mlで1×PBS中EDUの50μlを添加しますピペットを用いて卵内の胚。テープで卵を密封し、18インキュベーターに戻す - 96時間。
    2. 慎重にテープを除去し、18の後に耳の小胞内に蛍光GFPまたはRFP信号のための胚を確認- （ 図1 EE 'を参照）は、標準的な蛍光顕微鏡を用いて24時間。蛍光シグナルが存在する場合、（ ''図1 FPを参照）、この時点で分析のために胚を収穫するか、テープで再密封し、収穫のためのインキュベーターに戻し、後の段階で分析します。
      注： - 7時間エレクトロポレーションの10後のPME-IRES-GFP構築物でGFPシグナルの発現は6明らかです。

RNA in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学のための3胚の収穫と組織処理

  1. 鉗子を使用して胚を収穫。冷たい1×PBS中で胚を洗浄します。その首によって頭部を切断することによって、胚の頭部を削除します鉗子を使用して、4℃で4％パラホルムアルデヒドO / Nに頭を置きます。頭の中の4％パラホルムアルデヒドの浸透を可能にするために鉗子を使用して脳を穿刺。
  2. 4℃で（1×PBS中）を、30％スクロースO / Nでヘッドを脱水。
  3. ドライアイスとメチルブタン（2-メチルブタン）のスラリー中で急速凍結により凍結保護媒体中に頭をマウントします。また、急速に液体窒素で凍結保護媒体中に頭を凍結します。 -80℃で取り付けられたヘッドを保管してください。
  4. 厚さ12μmの組織切片に頭を凍結切片とsuperfrosted顕微鏡用スライドガラス上にすべての内耳を含む組織切片を収集します。
  5. 以前4,21に記載されているように 、in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学で標準RNAを実行して、キットの製造業者によって提供されたプロトコル以下EDU細胞増殖を分析。
    注：髪の細胞は、ウサギポリクローナルα-MyosinVIIa（MYO7A）ANを用いて同定することができますtibody（1：1,000、プロテウスBiosciences社）および蛍光標識二次抗体（1：250、ヤギ抗ウサギのAlexaFluor 488; Invitrogen社）。

4.イメージキャプチャと処理

  1. デジタルイメージング機器を入れて撮影します。 （倍率5倍から40倍までの範囲）を、標準的な広視野顕微鏡を用いて、標準的な蛍光顕微鏡及びその場での結果と画像免疫組織化学の結果。
  2. 画像処理ソフトウェアを用いて画像を処理します。

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結果

緑色蛍光タンパク質（GFP）発現カセットは〜得、100ミリ秒のパルス持続時間と200ミリ秒の間隔で12 Vおよび4パルスの最適化されたパラメータを使用して開発鶏脳底乳頭（BP）に標的にされたからなるこの方法紙プラスミドDNAでBPに標的化プラスミドDNAの50％の胚の生存率および効率。 （;白矢印、図1のE-E '）とGFP発現が時間経過にわたって追跡することができる胚の開発にネイティブGFP発現の蛍光イメージングは、エレクトロポレーションのこの方法が優先BPを生じる耳胞の前方-腹側面を、ターゲットに示しましたおよそ〜4日まで（ 図1 EH）。 in situハイブリダイゼーション（ISH） で RNAをエレクトロポレーションが成功開発内耳の聴覚部分を標的とするかどうかを決定するために使用しました。 GFPは、聴覚によって取り込まれたかどうかを決定するために、感覚前駆体は、ISH実験は、隣接BP切片上で実施しました。開発BP感覚前駆細胞内でそのSox2の...

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ディスカッション

オボマイクロエレクトロポレーションでのここで説明する方法が開発聴覚器官への遺伝子導入用に最適化されています。それは、典型的には、遺伝子の機能/発現を操作するために使用されるプラスミドDNAに基づく発現ベクターと互換性があります。 E4でのエレクトロポレーションのタイミングは、聴覚器官にHCの開発に注力調査に最適です。最も重要なステップは、針で深すぎる行くと耳胞に損傷を与えることなく、耳の小胞内腔へのDNAのマイクロ注入された耳胞の前腹ドメインによるにDNAを標的とする、（ 図1A-Dを参照してください）具体的に推定聴覚を標的とするために- （4μgの/μlの〜3.5）これらは、エレクトロポレーションパラメータを最適化し、プラスミドDNAの濃度を最適化されている（ 図1C参照）に応じて電極を配置し、12 Vで4パルスの最適化されたエレクトロポレーションパラメータを提供E4での臓器。当初私たちが始めたOUTには蛍光シグナルが得られない6 V、でエレクトロポレーションを行います。電圧は、増分12 Vが最適...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、発現プラスミドのためにその場プローブ 、感覚生物学イメージング施設と聴覚とバランスのためのセンターのためのジョンズホプキンス大学センターで博士ドリスK.呉に感謝します。この作品は、LEにNIDCDグラントT32 DC000023によってサポートされていました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
滅菌済み 1x PBS pH 7.4gibco10010-023
Fast Green FCF PowderSigmaF7252-5G
EdU PowderInvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging KitInvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator BTXハーバード装置
バナナからマイクログラバーケーブルキットBTXハーバード装置45-0216
右利き&左利き用マイクロマニピュレーターワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社 M3301R &M3301L
12mm磁気保持装置ステージ2基、7インチ縦ポストWorld Precision Instruments Inc. M10
金属鋼ベースプレート12x24インチWorld Precision Instruments Inc. 5479
卵用はさみ長さ12cmの湾曲した、12mmの極細刃。スプリングシザーズワールド精密機器株式会社 14120
針を引っ張るためのMicropippetteプーラーSutterInstrument Co.P-97
2.5x2.5 mmボックスプラチナヒーティングフィラメントサッターインストゥルメント株式会社
ガラス毛細管/針/繊維なし/ホウ素1 mmFHC27-30-0
ハミルトンガラスシリンジ100 μlハミルトン80601 モデル 710LT
鉱物油 (重) ハミルトン ガラス シリンジフィッシャー サイエンティフィO122-1
ポリエチレン チューブ ガラス シリンジとガラス キャピラリー ニードル/非毒性ベクトン ディキンソン アンド カンパニー (BD)427420 イントラメディック クレイ アダムス ブランド
3 cc 使い捨てシリンジベクトン ディキンソン アンド カンパニー (BD)309657
使い捨て21ゲージ針ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー(BD)305122
2mmプラチナ電極1組ブルドッグバイオ / ネパジェネCUY611P3-2
電極ホルダーブルドッグバイオ / ネパジェネCUY580
デュモン細鉗子5番ファインサイエンスツール(FST)
卵を封じるためのマット仕上げの目に見えないテープオフィスデポ520-928
綿ッシャーサイエンティフィック23-400-101
滅菌フィルターのヒント
ック 棒フィ

参考文献

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