チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

サマリー

聴覚器官は聴覚を媒介します。ここでは、発育中のニワトリ聴覚器官における聴覚前駆細胞の増殖と分化を研究するために最適化された、修正されたin ovoマイクロエレクトロポレーション法を紹介します。

要約

ニワトリ胚は、遺伝子機能の操作は、 卵で比較的容易に行うことができるように胚発生を研究するための理想的なモデル系です。内耳の聴覚感覚器官は聞くする当社の能力にとって重要です。これは、メカノ形質導入有毛細胞（HCS）と周囲のグリア細胞様細胞（SCS）をサポートで構成されて専門性の高い感覚上皮を収容します。聴覚器官の構造的な違いにもかかわらず、聴覚器官の発達を制御する分子メカニズムは、進化的に哺乳類と鳥類の間で保存されている、卵 、エレクトロポレーションでは 、E1での初期段階に大部分が限定されている- 。E3。原因E5での聴覚器官の相対的な開発後期に、E3過去オボエレクトロポレーション中による聴覚器官の操作が原因後の段階でのニワトリ胚の高度な発展には困難です。ここに提示された方法は、で目的の遺伝子を標的化するための過渡的遺伝子導入法でありますステージE4 - オボマイクロエレクトロポレーションで経由して開発鶏の聴覚感覚器官でE4.5。この方法は、従来のプラスミドDNAベースの発現ベクターでgain-及び喪失機能のために適用可能であり、で全胚にEDU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）を加えることによって卵細胞増殖アッセイにおいて組み合わせることが可能でエレクトロポレーションの時間。緑色または赤色蛍光タンパク質（GFPまたはRFP）発現プラスミドの使用は、実験者がすぐにエレクトロポレーションが正常に開発内耳の聴覚部分を対象とするかどうかを決定することを可能にします。この方法の論文では、GFPエレクトロポレーション標本の代表的な例が示されています。エレクトロポレーション後96時間および聴覚器官のプロ感覚の領域にGFPの標的化RNA in situハイブリダイゼーションによって確認された-胚は18を収穫しました。メソッド紙はまた、細胞prolifを分析するチミジンアナログEDUの使用のために最適化されたプロトコルを提供しますeration。免疫標識を結合し、EDUのクリック化学EDU基づく細胞増殖アッセイの例が提供されます。

概要

哺乳類や鳥類の聴覚感覚器官との間の形態や細胞パターニングの違いにもかかわらず、感覚HCの開発を担当した分子の要因と経路は、進化的に^1-3で保存していると考えられています。聴覚のHCとその周辺のSCを収容する基底乳頭は、内耳の耳胞のoutpocketingとして開発しています。初期のHCとSC前駆細胞のプールには、耳プラコード/耳のカップ神経感覚有能なドメイン（NSD）内に指定されています。フェイト・マッピングデータは、神経や感覚系統がリンクされていることの証拠を提供し、マウスやニワトリの^4,5で耳のカップや耳胞の前-腹側領域に位置NSDから生じます。まず、神経芽細胞は、最終的には聴覚と前庭神経節に分割聴覚・前庭神経節の神経細胞を生じさせるためにNSDから剥離し。これらのニューロンは、脳幹における内耳および核の感覚のHCを支配します。細胞番目NSDに残るでメカノ伝達感覚のHCおよびその関連のSCからなる、聴覚感覚器官を含む様々な感覚パッチを生じると考えられています。

ひよことマウスの両方で、聴覚器官感覚前駆細胞周期の出口とHCの分化は、対向する勾配で発生します。ひよこでは、聴覚前駆細胞周期の出口が〜E5の周りに始まり、頂点にベースから進行し、中心部から周辺部⁶へ。 1日後、HC分化が頂点に始まり、ベース⁷に進みます。複雑な手術を必要とする、他のモデル系に子宮内で胚を操作する....

プロトコル

卵と未孵化胚の世話をし、倫理的かつ人道的に扱われます。未孵化胚の使用のためのすべてのプロトコルは、医学、ボルチモア、メリーランド州のジョンズ・ホプキンス大学で動物実験委員会によって承認されました。

1.卵と発現構築物の作製

1. 卵：
   1. 37℃で、その両側に平らに横たわっ（ ガルスガルス ）4ダース受精鶏卵- 3をインキュベートします。
      1. インキュベーションの24時間後、卵のラウンドバックエンドから注射器で卵白の3 CCを引き出し、明確なテープで穴を塞ぎます。これは、卵¹⁹の上にアクセスするためのウィンドウを切断する際に胚がシェルに付着することなく、胚へのアクセスを容易にするためにできるように、胚および卵殻との間に空気室を作成します。
      2. インキュベーション時間の117時間で、ハンバーガーとハミルトン²⁰発達段階に応じて胚を上演E4（HH24-25）で（ 図1Dを参照してください）。
2. 発現は、構築します：
   1. 試薬を用いてプラスミドDNAと市販の調製キットの製造業者によって提供されるプロトコルを準備します。準備の最終段階で、1.5ミリリットルチューブにキットで提供500μlのTE（トリ....

結果

緑色蛍光タンパク質（GFP）発現カセットは〜得、100ミリ秒のパルス持続時間と200ミリ秒の間隔で12 Vおよび4パルスの最適化されたパラメータを使用して開発鶏脳底乳頭（BP）に標的にされたからなるこの方法紙プラスミドDNAでBPに標的化プラスミドDNAの50％の胚の生存率および効率。 （;白矢印、図1のE-E '）とGFP発現が時間経過にわたって追跡することができる胚の開発にネイティブGFP発現の蛍光イメージングは、エレクトロポレーションのこの方法が優先BPを生じる耳胞の前方-腹側面を、ターゲットに示しましたおよそ〜4日まで（ 図1 EH）。 in situハイブリダイゼーション（ISH） で RNAをエレクトロポレーションが成功開発内耳の聴覚部分を標的とするかどうかを決定するために使用しました。 GFPは、聴覚によって取り込まれたかどうかを決定するために、感覚前駆体は、ISH実験は、隣接BP切片上で実施しました。開発BP感覚前駆細胞内でそのSox2の.......

ディスカッション

オボマイクロエレクトロポレーションでのここで説明する方法が開発聴覚器官への遺伝子導入用に最適化されています。それは、典型的には、遺伝子の機能/発現を操作するために使用されるプラスミドDNAに基づく発現ベクターと互換性があります。 E4でのエレクトロポレーションのタイミングは、聴覚器官にHCの開発に注力調査に最適です。最も重要なステップは、針で深すぎる行くと耳胞に損傷を与えることなく、耳の小胞内腔へのDNAのマイクロ注入された耳胞の前腹ドメインによるにDNAを標的とする、（ 図1A-Dを参照してください）具体的に推定聴覚を標的とするために- （4μgの/μlの〜3.5）これらは、エレクトロポレーションパラメータを最適化し、プラスミドDNAの濃度を最適化されている（ 図1C参照）に応じて電極を配置し、12 Vで4パルスの最適化されたエレクトロポレーションパラメータを提供E4での臓器。当初私たちが始めたOUTには蛍光シグナルが得られない6 V、でエレクトロポレーションを行います。電圧は、増分12 Vが最適.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌済み 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTXハーバード装置
バナナからマイクログラバーケーブルキット	BTXハーバード装置	45-0216
右利き&左利き用マイクロマニピュレーター	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社	M3301R &M3301L
12mm磁気保持装置ステージ2基、7インチ縦ポスト	World Precision Instruments Inc.	M10
金属鋼ベースプレート12x24インチ	World Precision Instruments Inc.	5479
卵用はさみ長さ12cmの湾曲した、12mmの極細刃。スプリングシザー	ズワールド精密機器株式会社	14120
針を引っ張るためのMicropippetteプーラーSutter	Instrument Co.	P-97
2.5x2.5 mmボックスプラチナヒーティングフィラメント	サッターインストゥルメント株式会社
ガラス毛細管/針/繊維なし/ホウ素1 mm	FHC	27-30-0
ハミルトンガラスシリンジ100 μl	ハミルトン	80601 モデル 710LT
鉱物油 (重) ハミルトン ガラス シリンジ	フィッシャー サイエンティフィ	O122-1
ポリエチレン チューブ ガラス シリンジとガラス キャピラリー ニードル/非毒性	ベクトン ディキンソン アンド カンパニー (BD)	427420 イントラメディック クレイ アダムス ブランド
3 cc 使い捨てシリンジ	ベクトン ディキンソン アンド カンパニー (BD)	309657
使い捨て21ゲージ針	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー(BD)	305122
2mmプラチナ電極1組	ブルドッグバイオ / ネパジェネ	CUY611P3-2
電極ホルダー	ブルドッグバイオ / ネパジェネ	CUY580
デュモン細鉗子5番	ファインサイエンスツール(FST)
卵を封じるためのマット仕上げの目に見えないテープ	オフィスデポ	520-928
綿	ッシャーサイエンティフィック	23-400-101
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