アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

Summary

ここでは、アンジオテンシンIIのヨウ素-125標識類似体を用いた定量的、密度測定、in vitro受容体オートラジオグラフィーにより、ラット脳内のアンジオテンシンII型1受容体の局在を説明するためのプロトコルを提示します。

Abstract

このプロトコルは、受容体オートラジオグラフィーマッピングを実行するためのAng II受容体に特異的な放射性リガンドを用いて、ラット脳におけるアンジオテンシンII（アンギオテンシンII）の受容体結合パターンを説明しています。

組織標本を採取し、-80℃で保存します。クライオスタットは、冠状セクションに組織（脳）を使用し、帯電したスライド上のセクションをマウント解凍します。スライドに取り付けられた組織切片は、アンギオテンシンII受容体を放射標識するために¹²⁵ I-SI-アンギオテンシンII中でインキュベートします。受容体飽和の非放射性標識アンギオテンシンIIの濃度、または_（1 R AT）AT ₁アンギオテンシンII受容体サブタイプ選択的なアンギオテンシンII受容体アンタゴニストの存在下で、「非特異的結合」（NSP）、隣接するスライドを2つのセットに分離されています、ノーAT ₁ Rアンタゴニストと「総結合」。 AT ₂の飽和濃度_（2 R AT）アンギオテンシンIIレセプターサブタイプ拮抗薬（PD123319、10μM）もincubati中に存在しますバッファにAT ₁ Rサブタイプに結合する¹²⁵ I-SI-アンギオテンシンIIを制限します。スライド10μMのPD123319にさらされている」結合は合計「ながら〜22℃で30分間のプレインキュベーションの間に、NSPのスライドは、10μMのPD123319およびロサルタンにさらされています。次いで、スライドを「全結合」、およびPD123319およびアッセイ緩衝液中のNSPのためのロサルタン、塩を除去するために、いくつかのバッファ内の「洗浄液」、そして続いて水と非ためのPD123319の存在下で^、125 I-SI-アンギオテンシンIIと共にインキュベートします特異的に結合した放射性リガンド。次いで、スライドを、特殊なフィルムとカセットを使用して、オートラジオグラフィーフィルムに露光ブロードライヤーを使用して乾燥させます。フィルムは現像され、画像が独自のイメージングシステムとスプレッドシートを使用して、視覚的および定量的デンシトメトリーのためにコンピュータにスキャンされています。スライドの追加セットは、組織学的比較のためチオニン染色されています。

受容体オートラジオグラフィーを使用する利点は、視覚化する能力でありますアンギオテンシンII組織標本のセクション内のインサイツの受容体、および解剖学的には、隣接する組織の基準セクションと比較することによって組織の領域を特定します。

Introduction

心血管疾患は2011年¹米国における死因の30％以上を引き起こし、米国における死亡および障害の主要な原因であり続けています。米国心臓協会からの最新の統計が3で複数の人が1を持っていることを示しています心血管疾患の種類以上。心血管研究は、この疾患の理解に対して、引き続き注力していきますが、世代が高齢になっ始めると、これらの努力を継続することが不可欠です。レニン-アンギオテンシン系（RAS）は、主として、アテローム性動脈硬化症、炎症、全身の血管収縮、交感神経系の活性化（ 図^{1）2-8 を}促進^することによって、心血管系の調節において中心的な役割を果たしています。

RASは、腎臓の傍糸球体細胞は、血圧の減少に応答して血流中にレニンを分泌するときに活性化されるホルモン系、増加sympatありますhetic刺激、または黄斑緻密によってナトリウムの流れを減少させました。レニンは、アンジオテンシンI（アンI）を形成する（肝臓で合成された）アンジオテンシノーゲンを代謝します。アンギオテンシンIは、次いで、アンジオテンシンII（ANG II）、RASの主要なエフェクターペプチドを形成するために、主に肺および腎臓で、血管内皮細胞の管腔側に、アンジオテンシン変換酵素（ACE）によって外酵素が代謝されます。アンギオテンシンIIは、2つの受容体サブタイプを活性化することができます。 _（1 AT R）タイプ1受容体及び_（2 R AT）2型受容体は、心臓血管系を調節する両方、体液および電解質の恒常性を維持し、現在、認知機能および神経変性疾患に影響を与えると考えられている^8,9を処理^します。局所脳特異RASは、独立して、アンギオテンシンIIを合成することが報告されています。脳では、前駆体タンパク質アンギオテンシノーゲンはレニンのような酵素³によってアンギオテンシンIに変換アストログリア¹⁰で合成され、おそらくはプロレニンプロレニン受容体に結合しました^11、その後豊富脳¹²内のニューロンの細胞外表面上に発現されたアンジオテンシン変換酵素によってアンギオテンシンIIに変換されます。アンギオテンシンII生成されたこのintrabrainは₁ AT脳および血液由来のAng IIから隔離されている₂受容体でアゴニストです。

AT ₁ Rは、重要な生理学的役割を果たしているが、それはより良い、主に心臓血管系及び腎臓（ 図2）に影響を与える、体全体にその病態生理学的効果のために知られています。アンギオテンシンIIは、AT ₁ Rに結合すると、それは血管収縮を引き起こします。血流に対する抵抗性を増加させ、血圧を上昇させます。それはまた、増加したナトリウムおよび水の保持をもたらす、アルドステロンおよびバソプレシンの合成および分泌を促進します。これらの効果はまた、虚血性脳損傷および認知機能障害を誘発することができ、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびdiabeに連結されていますTES、並びに、最近学習および記憶^13-15に影響^を与えること^が同定されています。レニン分泌を抑制し、腎臓での傍糸球体細胞に₁ R ATという点で、RASでフィードバックループがあります。興味深いことに、AT ₂ Rは、一般的に血管拡張、神経突起伸長、軸索再生、抗増殖、および他の多くの間で脳保護^16-20を引き起こし_、1 R ATの行動を反調節します。 AT ₂ Rは、抗高血圧、最近、抗がん剤²¹のための標的として同定されています。様々な組織内のAng II受容体の局在化および密度を決定し、それらがどのように定量的デンシトメトリー受容体オートラジオグラフィーを用いた各種トリートメントや病気の状態によって影響を受けることはRASが特定の疾患に果たす役割を明らかにするのに役立ちます。

受容体オートラジオグラフィーは、アンジオテンシンIの存在を示すための有効な方法として、30年以上にわたって使用されていますI受容体と脳内のRASの他の構成要素および実験条件^22-34の様々な下ラット、マウス、モルモット、イヌおよびヒトの他の組織。脳内のAng II受容体の位置を特定することの重要性は、一つは、脳内でのAng IIのアクションに例えば機能的な神経解剖学を適用することができるということである、視床下部の室傍核におけるAT ₁ R（PVN）の存在は、アンの機能を示唆しています脳内のIIは、バソプレッシン、オキシトシンまたは副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）のリリース、または交感神経系の活性化を刺激します。したがって、AT ₁ Rをブロックする薬は、脳のRASの活動の上に関連したこれらのPVN媒介効果のいくつかを低下させる可能性があります。進行中の作業は₁ RアンタゴニストATの使用はCRHの心的外傷後ストレス障害（PTSD）誘導放出を減少させ、PTSDの症状を改善することができることを示唆している（ハートら 、出版のために提出します）。 PVN、弓器官（SFO）、および扁桃体がホメオスタシス、食欲/渇き、睡眠、記憶、感情的反応を調節するために知られており、この実証研究の対象領域です。これらの領域は、顕微鏡スライド上に脳の冠状切片を収集し、およびAng II受容体に特異的な放射性リガンドと共に特異的阻害剤で切片を処理することにより調べました。本研究では、提案したベンダーと一緒にすべての材料および試薬は記載されている、ヨウ素125は、その後、モノ¹²⁵ Iのようにして精製したアンギオテンシンII受容体拮抗薬、サルコシン^1、イソロイシン⁸のAng II（SIのAng II）を、放射性標識するために使用されたされています以前に³⁵記載のようにHPLC法を用いて-SIのAng II。この高い比活性の放射性リガンドの使用は、X線フィルムへの放射性標識部分の露光後に、低中程度および高い受容体密度の領域の可視化を可能にします。ヨウ素125、特定量の既知量を含む脳ペースト規格にフィルムを校正することにより、領域に結合アンギオテンシンII受容体を定量することができます。実験的研究では、実験対象の脳に結合アンギオテンシンII受容体は、対照被験者の脳におけるものと比較することができます。これはアンギオテンシンIIの作用は、遺伝的状態、表現型の異常、疾患状態または薬物療法に応答して変更されているかどうかを示すことができます。この知識は、その後、RASの調節不全に関連する疾患を治療するための治療法の開発に適用することができます。代替的な受容体結合部位を同定する技術が、低減解剖学的解像度で、解離定数（K _Dとしての放射性リガンド結合親和性を評価するために、濃度の範囲にわたって放射性リガンド組織ホモジネート由来の組織の膜調製物を使用する結合アッセイであります目的の組織の）および最大結合能（B _max）が。

ここで説明するプロトコルは、大きく5つの共同に分けることができますmponents：受容体オートラジオグラフィーのための組織切片を準備します。受容体オートラジオグラフィー;フィルムの露光、現像、組織学;そして、濃度測定の画像解析。

Protocol

この研究のために行うすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従ってにノバサウスイースタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された、 ^第 8版（国立アカデミープレス、ワシントン、DC、2011 ）。

受容体オートラジオグラフィーのために1.準備組織切片

1. 犠牲時に、収穫の新鮮な脳組織、できるだけ早く-20℃の冷凍庫にアルミ箔と場所で包みます。 20°Cの冷凍庫 - 正しい形状を維持するために、頭蓋骨の内側をシミュレートする脳の金型内の場所の脳は、アルミニウム箔と場所で包みます。 30分後、プレースシール可能な冷凍保存用バッグ内の組織とは、長期保存のために-80℃の冷凍庫に移動します。
   1. -80 -10℃と-18℃の最大値の最小値に設定し、クライオスタットのC冷凍庫、転送°、回避するための解凍から関心のある新鮮凍結組織標本を入手します。
   2. 唯一の媒体への試料のごく一部を埋め込む、メディアを埋め込むグリコールおよび樹脂系でマウント組織上に試料を置きます。脳のために、脳は前頭面で切片有効にするために垂直に装着されています。
2. 組織は、クライオスタット内ミクロトーム上にマウント置き、しっかりと所定の位置に締めてください。背腹軸が垂直に一般的に使用するための脳のアトラスであることを同じ前 - postero座標である脳の左右を確認し、。
3. スライド内のスペースのより大きな表面積を持つように垂直方向にスライド所望の厚さ（推奨さ20μm）での切断を開始し、顕微鏡上にセクションをマウント解凍。スライドの最初のセット、すなわち、5の連続セットでスライド上のセクションを収集1-1、1-2、1-3、1-4を標識し、1-5（ 図3）されています。
4. 切片とスライドのセットを充填した後、最大1時間空気乾燥さスライドを可能にし、SLIを配置デ自己シール冷凍保存バッグプラスチックスライドボックスで、-20℃で保存。

2.受容体オートラジオグラフィー

注意：放射能。放射能を処理するために、保護服装を使用してください。処分は、設立に依存され、かつ適切に崩壊（半減期60日）または認証取得企業によってピックアップされるガイドラインに従わなければなりません。

1. （ 図5）を -20℃冷凍庫から興味のある「-2」「-1」とスライドを外し、スライドグリップに取り付けます。一緒に「非特異的」治療のための「-1」のスライド、および「合計」治療のための「-2」のスライドをマウントします。バインディングjarはわずか10が含まれます、「合計」を（ 表1） ' を非特異的」jarは₂ R拮抗薬AT PD12331910μMの最終濃度で含有し、アッセイ培地緩衝液中で_、1 R拮抗薬AT（AM5）をロサルタンAM5でμMPD123319。
2. スライドを反転グリップは、室温で30分間AM5 35〜40 mlを充填したプレインキュベーションコプリンジャーにスライドし、それぞれの阻害剤を配置します。それらのプレインキュベーション浴内の後続のセットは、4分間隔で開始します。
3. すぐに部屋で60から90分間、10 AM5のミリリットルに加え、それぞれの阻害剤を用いた（ 図4で計算された^）125 I-SI-のAng IIの所定の濃度を含む、インキュベーションスライドメーラーへのプレインキュベーション溶液からスライドを転送します温度。十分な放射性リガンドがある場合は、10スライドが変更されたスライドグリップに（背中合わせに）配置し、コプリンジャーで¹²⁵ I-SI-のAng IIでインキュベートすることができます。
4. 場所は、（必要な場合）、ブロットは、ゆっくり2別々の容器に蒸留水400ミリリットルで1〜2秒間旋回によりすすぎスライドグリップに戻ってスライドします。
5. 図4に示すように、<（正確に1分間ずつ順次AM5 35〜40 mlを含む4コプリンジャーにスライドを移し/強いです>）。
6. 最後の1分リンスした後、軽く氷冷蒸留水の4変化で1-2秒間のセクションを旋回。
7. 涼しい空気とスライドを乾燥さ-ブロー（注意：熱い空気が放射性化合物を揮発さ）（ 図5）4分間異なる角度から設定4ヘアドライヤーを使用して、すべてのセクションが乾燥しているまで、ペーパータオルの上に置きます。
8. マウントは、組織が両面テープを使用して、X線フィルムに並置するために段ボールの上に上に向けてスライドします。
9. マウント各段ボールの上に少なくとも^1、125ヨウ素のキャリブレーション標準のスライド（ 図6）。
   注：キャリブレーション基準は徹底的に脳切片と同じ厚さに切断し、顕微鏡上に解凍マウントしクライオスタットある1ミリリットルツベルクリン注射器で遠心分離により圧縮フェノール環を含む化合物に結合した¹²⁵ヨウ素と混合脳ペーストで構成されスライド。また^、125 I較正標準で20μmの厚さで切片可塑性樹脂は、商業的に得ることができます。これらの規格でプラスチック樹脂は、部分的に40％〜の組織等価は、キャリブレーションに考慮されるべきであるように、放射線からフィルムを保護します。

3.フィルムの露光、現像

1. ストラップバックX線カセットおよびオートラジオグラフィーフィルムと暗室に進んでください。カセットを開き、内側スライド（ 図6）とのダンボールを置きます。
   1. ライトをオフにして、セーフライトをオンにします。慎重に1膜を除去し、カセット内のスライドの上に（右下隅にギザギザのエッジに）フィルム光沢面を配置し、X線フィルムのボックスを開きます。慎重にカセットを閉じて、光（ 図6）を出て密封するためにロッキングバーをねじります。 -20℃で数日から数週間のためのスライドを公開します。
2. 暗室では、カセットを開き、フィルム開発のprocを進めますESS。
   1. 連続してトレイにスライドを置きます。 2分、30秒、5％氷酢酸を含有する水、及び5分間定着用現像剤。フィルムはせいぜい10秒Photofloに入れ、ハングした後、20分間流水でトレイに配置されます。
      低い結合を有する領域から測定可能な信号を得るために十分な長さではなく、あまりにも長い間高い結合を有する領域によってフィルムを飽和するよう：露光時間は、経験的に決定され、異なる露光時間で複数の膜を含むことができる：注意してください。許容可能な露光が得られたら、次の手順に進みます。

4.組織学

1. チオニン染色および染色試薬（ 表2、 図7）を準備します。
   1. スライドラックに「-3」のスライドを置き、1分間脱イオン水で始まる順番に転送は、その後10分間チオニン染色液には消孤に3ディップが続きます化された水、脱イオン水で1 30秒間洗浄。
   2. 水に続いて、次のようにエタノール洗浄にスライドラックを置きます。 50％、70％、および30秒間90％は、1分ごとに100％エタノールで2回洗浄しました。最後に、5分間の第二のキシレン溶液に渡って転送した後、3分間キシレンにスライドラックを配置します。
2. 最後のキシレン浴から一度に一つのスライドを削除し、有機溶剤封入剤中の樹脂をベースとするスライドの上縁をカバーし、スライド上に24ミリメートル×60ミリメートルカバースリップを配置。スライドは十分に乾燥〜48時間、その後、2400 dpiのグレースケールでコンピューターにスキャンすることができます。

5.濃度測定の画像解析

1. 左下隅にあるギザギザのエッジに、フィルム光沢面を下に置き、イメージングシステムのコンピュータ内の任意の歪みのない膜密度情報を送信することができる独自のスキャナを使用してスキャンします。
2. 独自のイメージングsysを開きます。フィルム（ - 12 図9）上の画像の今後の濃度分析のためのキャリブレーション標準を確立するために、キャリブレーションバーをTEM及び利用します。
3. テンプレートを確立するか、経験的に関心のある分野を概説いずれかによって関心のある分野を測定します。データは、対照または野生型（セクション）、および領域のいずれかを収集し、フィルムに基づいて分離されます。密度（fmolの/ g）を、走査領域、および測定における総ターゲット領域（ 図9）を必ず含めてください。
   1. 関心領域は、強調表示のパラメータ（ 図10）の間に入ることを保証することにより、スキャンエリアバーを調整します。
   2. スプレッドシートへのデータのエクスポート（ 表4）。密度時間全体目標面積を掛け、その特定の領域の結合のための値を得るために、スキャン面積で割ます。これは測定されたすべての値に完了すると、特定の結合Pを生成するために合計から設立された非固有の基質憤慨。平均は、これらの値に対して実行されてもよいです。

Results

レニン-アンギオテンシン系の代謝経路の概要を、図1に示されており、アンジオテンシンII受容体サブタイプ_（1 R ATおよび₂ R AT）への直接的な焦点は、図2に記載されている。3ディスプレイ冠状脳の転送図 図4に見られるように、所定の¹²⁵ I-シャンII濃度を用いて受容体オートラジオグラフィーの手順を介して実行された顕微鏡スライド、上のセクション。5図は、その後、段ボールなどの上に固定されている受容体オートラジオグラフィーでのスライドの乾燥工程を示しています図6に見られ、続いて開発した。 表2は

Discussion

説明されたプロトコルは、齧歯類脳以前に採取し、-80℃で保存の冠状切片の隣接するセクションでの放射性リガンドの結合を「合計」及び「非特異的」の視覚化を識別し、実質的にすべての組織に容易に適用することができること解剖学的に受容体または放射性リガンド結合部位の差分量を表示する下部構造を解決しました。プロトコル内で説明する手順は簡単で、分析は結果を正しく解釈するために重要です。 20μmの厚さは最適であると決定されました。部が厚すぎると、非特異的結合が困難その標的への放射性リガンドの結合を解消すること、増加します。セクションを薄く切断した場合は、正常に切断され、歪みのないシーケンシャルセクションを保存することが困難となります。最適な切削温度が原因で組織の性質やセクションと私の厚さに多少異なりますsが通常は経験的に決定します。接触がブレードと組織との間で行われた後、試料の向きは見直し、バック離れブレードから組織標本を移動し、ボールマウントを再配向することにより、再整列することができます。齧歯類の脳を切断する場合には、脳の左側と右側を確保することが重要である同前 - postero座標であり、背腹軸は、一般的に脳​​アトラスを使用するために垂直...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 ml プラスチックビーカー	フィッシャー	02-591-30
24 mm x 60 mm カバースリップ	フィッシャー	22-050-25
オートラジオグラフィー イメージング フィルム 24 mm x 30 cm	ケアストリーム-バイオマックス MR フィルム	891-2560
バシトラシン (バチルス licheniformis から)	シグマ	B-0125
段ボールシート 8 x 11	三日月形イラストボード #201	201
Coplin Jars	Fisher Scientific	E94
業務用ヘアドライヤー	Conair	モデル SD6X
使い捨て培養チューブ	Fisher	14-961-26
EDTA (二ナトリウム塩、二水和物)	USB Corporation	15-699
エタノール	Fisher	16-100-210
D-19 Developer	Photographers Formulary, Inc.の代用品	01-0036
氷酢酸	フィッシャー	A38 SI-212
Histoprep/OCT	フィッシャー	SH75-125D
フィルム フィクサー	コダック	5160320
写真 flo	コダック	1464502
ロサルタン	フィッシャー/トクリス	37-985-0
MCID™コア 7.0	MCID	N/A
NaCl	フィッシャー	S271
ピール・ア・ウェイ・スライド・グリップ	VWR	48440-003
パーマウント	・フィッシャー	SP15-100
PD123319	フィッシャー	13-615-0
プレミアム・チャージ・スライド、ファイン・グラウンド・エッジ	・プレミア・マイクロスコープ・スライド	9308W
125I 配位子	パーキン エルマー	NEX- 248
125SI-Ang II	ジョージワシントン大学	放射性ヨウ素添加 スペス
スライドメーラーズ	フィッシャーサイエンティフィック	HS15986
二塩基性リン酸ナトリウム無水物 (Na2PO4)	フィッシャー	RDCS0750500
酢酸ナトリウム (無水)	フィッシャー	BP333-500
チオニン	フィッシャー	T409-25
X線ケース (10 x 12)	スペクトロニクス・コーポレーション	フォースクエア
キシレン	フィッシャー	X3P-1GAL