我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。
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この記事について
サマリー
要約
血管生物学に関与する受容体チロシンキナーゼおよびそれらの相互作用するリガンドの分析を伴う関連する受容体のファミリーの構成的発現、関連するリガンドの広い範囲と専門内皮細胞の初代培養物を扱うのが困難にしばしば困難です。ここでは、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）、血管新生およびリンパ管新生を促進シグナルの主要なトランスデューサに対するリガンドを検出するためのバイオアッセイを説明します。エリスロポエチン受容体（EpoRを）の膜貫通および細胞質領域とVEGFR-2の細胞外（リガンド結合）領域の融合体をコードするcDNAは、因子依存性細胞株のBa / F3で表されます。この細胞株は、インターロイキン-3（IL-3）、24時間以内に細胞死におけるこの因子の結果の離脱の存在下で成長します。 VEGFR-2 / EpoRを受容体融合生存を促進する別のメカニズムを提供するの発現およびPotentiaでLLY融合タンパク質（ すなわち 、することができますクロスリンクVEGFR-2細胞外領域1）の細胞外部分に結合し、架橋することができるリガンドの存在下で安定にトランスフェクトされたBa / F3細胞の増殖。リガンドと細胞の少量を24時間で迅速な結果を可能にする半定量的アプローチ、および生存細胞数の代理マーカーを含む定量的アプローチ：このアッセイは、2つの方法で行うことができます。アッセイは実行が比較的容易であり、既知のVEGFR-2リガンドに応答性の高いであり、そのような受容体またはリガンドに対するモノクローナル抗体、および可溶性リガンドトラップとしてVEGFR-2シグナル伝達の細胞外阻害剤を収容することができます。
概要
分泌タンパク質成長因子およびその同族の細胞表面受容体の血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーの可溶性リガンドおよび膜埋め込み受容体、細胞膜を横切ってシグナルを伝達におけるそれぞれその機能の重要かつ多様な群です。彼らは、内皮細胞でだけでなく、上皮由来の細胞と免疫系1,2のもので、主に機能します。リガンド活性化VEGF受容体（のVEGFR）によって係合さシグナル伝達経路は、加齢性黄斑変性症および癌などの主要な病態において重要であり、それらを標的とする治療薬は、頻繁な臨床用途（VEGF-Aを標的とする、例えば、モノクローナル抗体ベバシズマブ）であります3,4。
VEGFファミリーの複雑さの一つは、自然界に存在する可溶性リガンド（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、パラポックスウイルス属ファミリーORFとヘビ毒VEGF、加えて他によってコードされるVEGFタンパク質の多様性であります抑制するVEGF-A）2のアイソフォーム。
これらのリガンドは、受容体チロシンキナーゼファミリーの3つのメンバー、すなわちVEGFR-1、VEGFR-2およびVEGFR-3と相互作用します。これらの受容体は、可変異なる細胞型上で発現されるが、多くの場合、すべてのサイズ5の血液やリンパ管を裏打ちする内皮細胞の表面上に共発現されます。 VEGFR....
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プロトコル
IL-3およびWEHI-3D-馴化培地の調製のソース
注：マウス顆粒球性白血病細胞株WEHI-3Dは、IL-3を含有する馴化培地を生成するために培養されます。
- 50μg/ mlのゲンタマイシンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％の長寿命グルタミンサプリメント、文化WEHI-3D。 T175のcm 3の組織培養フラスコ中の新鮮な培地50mlに対数増殖期中5×10 6個の細胞を接種し、約7日間増殖または細胞が約24による成長のそれらの対数期を経過するまで- 48時間（培養中の過剰な細胞死を避けるため）。 500 mlの一度に製造することができる - 馴化培地を200のバッチがので、-20℃で、複数の年間保存することが可能です。
- 15分には、細胞と細胞破片を除去するために、1,000×gでフラスコとスピンからの流体および細胞をデカントします。 supernのトップ90％を削除しますatant。 0.22μmのフィルターユニットを通して濾過。
- 小分けしWEHI-3D馴化培地（CM）1ミリリットル中に、-20℃での保存のために50ミリリットルと200ミリリットルのボリュームまたは-70℃です。小さなアリコートを分析の準備、因子依存性細胞株の継代培養培地を作製するための中間ボリューム、および長....
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結果
このセクションでは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ（アッセイの原理については、 図1を参照）の本質的な特徴を実証する実験の結果を示します。その他の公表された研究は、代替VEGFR-2リガンド、変異型VEGF分子および抑制性モノクローナル抗体8,10,19,24-30ためのアッセイのより広範なアプリケーションを示しています。
ここに提示したデータは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ三組換えヒトリガンド（VEGF-165、VEGF-CおよびVEGF-D）VEGFRに特異的な活性を定量化するために使用されるアッセイを表します-2阻害するモノクローナル抗体（ベバシズマブ）の存在下でのVEGF-165のデータは、VEGF-165を単独で（ 図2）への応答に対し.......
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ディスカッション
ここに記載のアッセイは、増殖因子に依存する高い生存性の細胞を、使用することに依存しています。細胞は、したがって、彼らが要因に依存していることを確認し、キメラ受容体の発現を維持するために慎重に培養する必要があります。媒体は作りたてと過度に長期間およびWEHI-3D CMが重要である高活性であることが格納されていないことを保証します。細胞は完全に救出リガンドに細胞を暴露する際に残留IL-3は、アッセイを汚染しないことを確実にするために、アッセイ培地中にIL-3含有培地から洗浄する必要があります。リガンドは、多くの異なる形態で来ることができるようにアッセイするためにこれらを準備する際には注意する必要があります。防腐剤、抗菌剤、塩または異なるpHの緩衝液は、アッセイに影響を与えることができ、および非トランスフェクトするBa / F3細胞の並列テストは、バッファ関連の問題について通知することができる理由です。
私たちは、半定量的および定量的なプロトコルの両方を使用しています。半quantitatiVEのアッセイは、前より多くの時間とサンプルを必要とし、完全に定量にコミットするには、サンプ.......
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開示事項
スティーブンA.スタッカーとマルク・M.アーヘンは、概日テクノロジーズ株式会社、成長因子のVEGFファミリーを標的とすることにより治療薬を開発する会社では株主です。
謝辞
SASとMGAは、プロジェクト助成金、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)からのプログラム助成金と研究フェローシップ、およびオーストラリアのビクトリア州政府が提供する運用インフラ支援プログラムからの資金によってサポートされています。MMHは、ピーター・マッカラム財団の助成金から支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4%溶液を細胞懸濁液と1:1で使用して、生細胞を測定します。ハザード-癌を引き起こす可能性があります |
| G418硫酸塩 (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | トランスフェクション真核細胞を選択するための薬剤。ハザード-アレルギーや喘息の症状、または呼吸困難を引き起こす可能性があります。 |
| 3H-チミジン | パーキンエル | マーNET-027 | この放射性ヌクレオシドは、有糸分裂中に染色体DNAに組み込まれます。ハザード放射線 |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | ATP モニタリング試薬を使用して生存率を定量化するための細胞 ATP の生物発光検出 |
| Prestoblue Cell Viability | Reagent Invitrogen | A13261 | レサズリンベースの細胞生存率指標。細胞の還元環境で色が赤くなります |
| Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | ||
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| セルハーベスター | Tomtec ライフサイエンス | Tomtec ハーベスター、96 マッハ 3M セルハーベスター | |
| 液体シンチレーションカウンター | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 ベータプレートシンチレーションカウンター |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | ホワイト 96 ウェル Barex マイクロプレート、GF/B フィルター 1 & マイクロ;m ポアサイズ |
| ゲンタマイシン | ギブコ、ライフテクノロジーズ | 15750-060 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ギブコ、ライフテクノロジー | ズ 15140-122 | |
| 0.22 um 細孔セルロース アセテート遠心分離管 フィルターユニット | Costar、コーニング | 8160 | 遠心分離管フィルターは0.22 µ500 & micro内のm細孔CA膜含有フィルターユニット;L容量ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ。 |
| 蛍光リーダー | BioTek | BioTek Synergy 4 ハイブリッド マイクロプレート リーダー |
参考文献
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (20....
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再版と許可
