方法論記事

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

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DOI：

10.3791/53867

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2016年3月15日

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

この記事について

サマリー

我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。

要約

血管生物学に関与する受容体チロシンキナーゼおよびそれらの相互作用するリガンドの分析を伴う関連する受容体のファミリーの構成的発現、関連するリガンドの広い範囲と専門内皮細胞の初代培養物を扱うのが困難にしばしば困難です。ここでは、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）、血管新生およびリンパ管新生を促進シグナルの主要なトランスデューサに対するリガンドを検出するためのバイオアッセイを説明します。エリスロポエチン受容体（EpoRを）の膜貫通および細胞質領域とVEGFR-2の細胞外（リガンド結合）領域の融合体をコードするcDNAは、因子依存性細胞株のBa / F3で表されます。この細胞株は、インターロイキン-3（IL-3）、24時間以内に細胞死におけるこの因子の結果の離脱の存在下で成長します。 VEGFR-2 / EpoRを受容体融合生存を促進する別のメカニズムを提供するの発現およびPotentiaでLLY融合タンパク質（ すなわち 、することができますクロスリンクVEGFR-2細胞外領域1）の細胞外部分に結合し、架橋することができるリガンドの存在下で安定にトランスフェクトされたBa / F3細胞の増殖。リガンドと細胞の少量を24時間で迅速な結果を可能にする半定量的アプローチ、および生存細胞数の代理マーカーを含む定量的アプローチ：このアッセイは、2つの方法で行うことができます。アッセイは実行が比較的容易であり、既知のVEGFR-2リガンドに応答性の高いであり、そのような受容体またはリガンドに対するモノクローナル抗体、および可溶性リガンドトラップとしてVEGFR-2シグナル伝達の細胞外阻害剤を収容することができます。

概要

分泌タンパク質成長因子およびその同族の細胞表面受容体の血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーの可溶性リガンドおよび膜埋め込み受容体、細胞膜を横切ってシグナルを伝達におけるそれぞれその機能の重要かつ多様な群です。彼らは、内皮細胞でだけでなく、上皮由来の細胞と免疫系1,2のもので、主に機能します。リガンド活性化VEGF受容体（のVEGFR）によって係合さシグナル伝達経路は、加齢性黄斑変性症および癌などの主要な病態において重要であり、それらを標的とする治療薬は、頻繁な臨床用途（VEGF-Aを標的とする、例えば、モノクローナル抗体ベバシズマブ）であります3,4。

VEGFファミリーの複雑さの一つは、自然界に存在する可溶性リガンド（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、パラポックスウイルス属ファミリーORFとヘビ毒VEGF、加えて他によってコードされるVEGFタンパク質の多様性であります抑制するVEGF-A）2のアイソフォーム。

これらのリガンドは、受容体チロシンキナーゼファミリーの3つのメンバー、すなわちVEGFR-1、VEGFR-2およびVEGFR-3と相互作用します。これらの受容体は、可変異なる細胞型上で発現されるが、多くの場合、すべてのサイズ5の血液やリンパ管を裏打ちする内皮細胞の表面上に共発現されます。 VEGFR-2は、哺乳動物のリガンドのVEGF-6、VEGF-C 7およびVEGF-D 8,9と同様にオルフウイルスVEGF 10とヘビ毒VEGF 11を結合することができます。 VEGFR-2は、胚発生、創傷治癒、癌、および眼疾患における血管形成（既存の血管か​​らの新しい血管の成長）を駆動する際に主要な役割を果たしています。これらの状況では、そのようなVEGF-A、-C及び-Dバインドなどとリガンドは、血液、血管内皮細胞12-15上の受容体を活性化させます。リンパ管内皮細胞上で、VEGFR-2は、リンパ管形成、新しいリンパ管16を形成する役割を果たしています。 VEGFR-2はまた、拡張および健常組織と疾患17の主要な動脈およびリンパ管の拡大を促進することができます。 VEGFR-2の完全な理解：リガンド相互作用は、血管新生依存性疾患18の治療に使用するための阻害剤の開発のためには重要です。 VEGFR-2のVEGF-A結合のほとんどのアイソフォームは、VEGF-CおよびVEGF-Dのタンパク質分解切断はVEGFR-2 19,20に高い結合親和性を示すVEGF-相同ドメインからなるフラグメントを放出するために必要とされます。

我々は（特殊な培地を必要とする）を購入するには高価通過に技術的に困難である初代内皮細胞の必要性を回避するために設計され、VEGFR-2のリガンドを監視するためのバイオアッセイ、および文化21を開発し、複数のVEGFRおよび関連コを表現しています受容体22。スタッドに目的とする場合、他のVEGF受容体または共受容体とVEGFR-2のヘテロ二は、不必要な複雑さを引き起こす可能性がありますyのバイナリ受容体-リガンド相互作用、特異的な受容体に起因する活性を評価する、または阻害剤の効果を評価する。23。バイオアッセイは、細胞膜に関連する受容体の可動性を保持し、VEGFR-2の細胞外領域に結合し、架橋するリガンドの能力の評価を可能にします。

バイオアッセイは、（この場合はVEGFR-2）のVEGF受容体の細胞外領域を貫通し、エリスロポエチン受容体（EpoRを）、サイトカイン受容体ファミリーのメンバーの細胞内領域に融合されたキメラ受容体の構築に依存しています8,24。この融合タンパク質は、その後、結合し、受容体の細胞外ドメインが可能な細胞質エフェクター領域の活性化を引き起こす架橋することができるリガンドとその刺激によって、因子依存性プロB細胞系のBa / F3で表され細胞を促進するために、ヤヌスキナーゼ（のJAK）を介して生存シグナルを伝達生存および/または増殖。対照的に、リガンドと全長VEGFR-2と同じ細胞型において、および刺激の発現は、VEGFR-2経路の近位シグナル伝達エフェクターは、この細胞タイプでは利用できないことを示す、細胞の生存と増殖を促進しません。

私たちは、新規VEGFR-2リガンド10,19,20,24-29の結合を調査するために、種々の状況でアッセイを使用していました。 VEGFR-3-EpoRを-BA / F3アッセイと組み合わせて、我々は、VEGFR-2およびVEGFR-3 30に結合し、架橋のための相対的なVEGF-Cの活性とVEGF-Dの成長因子を比較しました。アッセイは、VEGFR-2またはVEGF-D、可溶性VEGFR-2トラップ及びVEGFファミリー31を標的とするペプチド模倣体に対するモノクローナル中和抗体の阻害活性を特徴付けるために使用されてきました。アッセイはまた、一次内皮細胞における試験の前にバインドするために、異なるオルフウイルス株からのVEGFの能力とクロスリンクVEGFR-2を表示するために使用されました 10,26アップ。アッセイは、それらがより面倒な内皮細胞アッセイ25時または浄化成長のための評価のプロトコルは27因子に導入される前に速やかに活性を評価することができるのVEGFの変異体の迅速なスクリーニングのために特に有用です。

私たちが説明するアッセイは、実施が容易であり、かつ半定量的バージョンは、成長因子、抗体または他の実験のための可溶性受容体ドメインの生産や精製を監視するときに時々必要とされる迅速な決定を可能にします。アッセイの使いやすさは、特定の組織または器官系から血液やリンパ管由来初代内皮細胞を用いて行われ、さらに、より完全な研究を補完する理想的なことができます。

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プロトコル

IL-3およびWEHI-3D​​-馴化培地の調製のソース

注：マウス顆粒球性白血病細胞株WEHI-3D​​は、IL-3を含有する馴化培地を生成するために培養されます。

  1. 50μg/ mlのゲンタマイシンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％の長寿命グルタミンサプリメント、文化WEHI-3D​​。 T175のcm 3の組織培養フラスコ中の新鮮な培地50mlに対数増殖期中5×10 6個の細胞を接種し、約7日間増殖または細胞が約24による成長のそれらの対数期を経過するまで- 48時間（培養中の過剰な細胞死を避けるため）。 500 mlの一度に製造することができる - 馴化培地を200のバッチがので、-20℃で、複数の年間保存することが可能です。
  2. 15分には、細胞と細胞破片を除去するために、1,000×gでフラスコとスピンからの流体および細胞をデカントします。 supernのトップ90％を削除しますatant。 0.22μmのフィルターユニットを通して濾過。
  3. 小分けしWEHI-3D​​馴化培地（CM）1ミリリットル中に、-20℃での保存のために50ミリリットルと200ミリリットルのボリュームまたは-70℃です。小さなアリコートを分析の準備、因子依存性細胞株の継代培養培地を作製するための中間ボリューム、および長期保存のために大容量のために有用です。 IL-3は、無菌条件下で使用した場合ので、解凍した媒体は、数週間保存することができ、4℃で比較的安定です。
  4. 代替的に、0.22μmフィルターユニットを通して濾過した後、培地中に希釈した50 ng / mlでの濃度で組換えマウスIL-3を使用します。

VEGFR-2-EpoRを-BA / F3および制御するBa / F3細胞株の2文化と評価

  1. DMEMで培養制御するBa / F3細胞を、10％FBS、50μg/ mlのゲンタマイシンまたはペニシリン/ストレプトマイシンサプリメント、1％L-グルタミンおよび10％WEHI-3D​​-CM安定。細胞からの3日ごとに約1時15希釈で継代細胞対数期で増殖。
  2. DMEMで培養VEGFR2-EpoRを-BA / F3細胞を、10％FBS、50μg/ mlのゲンタマイシン、1％L-グルタミンおよび10％WEHI-3D​​-CMおよび1mg / mlのG418を安定化。対数期に増殖している細胞から1：15希釈で継代細胞。キメラ受容体の構築および発現の詳細については24を参照してください。
  3. 中期対数期培養物から収穫制御するBa / F3またはVEGFR2-EpoRを-BA / F3細胞。穏やかにフラスコの底から、これらの非付着細胞を除去するために、ピペット。培地IL-3を含むを除去するために（細胞ペレットを回収するために5分間750×gで、10 mlの遠心分離）を、マウスの等張リン酸緩衝食塩水、pHが7.3（PBS）で3回洗浄します。
  4. その後、ウォッシュWEHI-3D-CMまたは組換えIL-3を含まないDMEMと添加剤と一度細胞、および13.5μlのあたり7.4×10 4細胞/ ml（ すなわち、1,000細胞の濃度で、この培地中で再懸濁し、10,000個の細胞あたり血球計数器を用いて計数することによって決定されるように135μL）のためにそれぞれのアッセイの半定量的または定量的のバージョンで使用しています。
  5. トリパンブルー排除（注意）によって生存のために細胞を評価します。細胞集団で1と血球計数器に100個の細胞の最小値をカウント：PBS（0.4％）1にトリパンブルーを混ぜます。色素を取る細胞は死んだか死んで考えられています。 98％以上の生存率アッセイを行うために必要とされます。

3.半定量的アッセイ

  1. RTで72ウェルのマイクロウェルプレートのウェルにIL-3欠損培地の13.5μlの中に含まれる洗浄された細胞（1,000細胞）を追加します。重力がバイアス細胞濃度をしないことによって、細胞沈降を確実にするために等分中に細胞懸濁液を混合するために注意してください。よく較正されたP20自動ピペット、およびオートクレーブ処理のヒントを参考にしてください。
  2. 較正されたP20ピペットまたは、好ましくは、P2ピペットを用いて（ウェルあたり1,000個の細胞を含む15μlの最終容量を作り、1.5μl）を10％の体積でウェルに試験サンプルおよびコントロールを追加します。 CAを取ります再サンプルはpH、塩および他の細胞増殖抑制性/潜在的な細胞傷害性物質の面でのBa / F3細胞の培養条件と互換性があることを確認します。可能であれば、（それぞれ、 例えば、DMEMまたはPBS）に適合する培地または緩衝液を使用するか、またはそのような培地または緩衝液中に希釈します。同じチップで粉砕して、混合を確実にします。
  3. 対照サンプルについては、単独で含有ノーIL-3を培地（i）を含みます。 （ⅱ）WEHI-3BD-CMは10％最終容量で、単独で培地に添加し;および/または（iii）VEGF-Aには、IL-3を含まない、培地単独中を100ng / mlに希釈しました。
  4. 滅菌水、PBSまたは媒体とマイクロウェルプレートの未使用井戸を記入し、（水に浸したティッシュペーパーで）加湿容器内にプレートを配置したガス交換を可能にします。 10％CO 2の加湿雰囲気中で容器内の細胞をインキュベートします。試験サンプルおよびメディアコンポーネントが利用可能である場合、このアッセイは、快適に一人で3時間に設定することができます。
  5. 典型的に16時間後にプレートを評価しますインキュベーションは、その時に正と負のサンプル間の時間差別は明らかです。細胞が培養中に表示される方法の例については、 図3を参照してください。 100倍の倍率 - 40で標準的な倒立位相差顕微鏡を使用してプレートを分析します。
    注：ウェルズはラウンドと半透明表示されるセルが含まれていますように、IL-3またはVEGF-Aとして支持する成長因子を含みます。支援的な成長因子を含まない、または培地のみを含むウェルは、円形細胞の数、ならびに死亡または瀕死の細胞および細胞破片（例えば、 図3C）を低減しています。 24〜48時間後のインキュベーションでアッセイを評価する感度のために最適です。

4.定量的バイオアッセイ

  1. 室温での標準的な96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、IL-3欠乏培地中で洗浄された細胞（135μl中10,000細胞）を加えます。 CEには影響しません重力によって細胞の沈降を確実にするために等分中に細胞懸濁液を混合するために注意してくださいLL濃度。
  2. 較正されたピペット（P20）を使用して、10％の容量（15μL）でウェルに試験サンプルおよびコントロールを追加します。試料はpH、塩または他の細胞増殖抑制性/潜在的な細胞傷害性物質の面でのBa / F3細胞の培養条件と互換性があることを確認するために注意してください。可能な場合は、互換性のあるメディアを使用するか、バッファー（ 例えば 、DMEMまたはPBS）またはそのような培地または緩衝液中に希釈します。フィルターは、0.22μmの細孔酢酸セルロース遠心管フィルターユニットを用いて少量を滅菌します。
  3. 48時間、10％CO 2の加湿雰囲気中で、細胞、成長因子および/ ​​または阻害剤の薬剤の混合物をインキュベートします。水に浸したティッシュペーパーを有しており、ガス交換を可能にする加湿容器内にアッセイを行います。ウェル中の生細胞数の代理マーカーは、インキュベーション期間の終了時に、その下に記載されている代替方法のいずれかを使用してアッセイを評価しています。
  4. 代替＃1：3 H-thymidineの設立
    注：この定量化は、96ウェルプレートフォーマットのために設計されています。
    1. 37°C（ウェル当たり150μlの体積）で48時間、アッセイプレートのインキュベーションの後、（IL-3 / WEHI-3D ​​CMなしのBa / F3培地）アッセイ培地を50μlの体積で3 H-チミジンを加えますウェルあたり1μCiの最終用量を与え、20μCiの/ mlの濃度でウェルあたり。
    2. セルハーベスターを用いて細胞を回収する前に、37℃でさらに4時間培養します。シンチラントにフィルタを配置することによって、個々のサンプルを抽出し、液体シンチレーションカウンターで定量化します。
  5. 代替＃2：携帯ATPの生物発光検出
    注：このアプローチは、集団内の生存細胞を反映した生物発光信号を生成することができる細胞溶解物と組み合わせたATPモニタリング試薬を使用しています。
    1. ATPを抽出し、生成するATPモニタリング試薬を使用するために細胞を溶解製造業者の説明書に従って発光シグナル。 96ウェルプレートフォーマットと互換性のルミノメーターを使用して発光をお読みください。
  6. 代替＃3：生存可能な細胞によるインジケータ染料の酵素的還元
    注：レサズリンベースのアッセイは、細胞生存率に対して良好な相関を示します。
    1. レサズリン系色素で培養した細胞を組み合わせて、製造業者の説明書に従って、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイを定量化します。

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結果

このセクションでは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ（アッセイの原理については、 図1を参照）の本質的な特徴を実証する実験の結果を示します。その他の公表された研究は、代替VEGFR-2リガンド、変異型VEGF分子および抑制性モノクローナル抗体8,10,19,24-30ためのアッセイのより広範なアプリケーションを示しています。

ここに提示したデータは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ三組換えヒトリガンド（VEGF-165、VEGF-CおよびVEGF-D）VEGFRに特異的な活性を定量化するために使用されるアッセイを表します-2阻害するモノクローナル抗体（ベバシズマブ）の存在下でのVEGF-165のデータは、VEGF-165を単独で（ 図2）への応答に対し...

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ディスカッション

ここに記載のアッセイは、増殖因子に依存する高い生存性の細胞を、使用することに依存しています。細胞は、したがって、彼らが要因に依存していることを確認し、キメラ受容体の発現を維持するために慎重に培養する必要があります。媒体は作りたてと過度に長期間およびWEHI-3D​​ CMが重要である高活性であることが格納されていないことを保証します。細胞は完全に救出リガンドに細胞を暴露する際に残留IL-3は、アッセイを汚染しないことを確実にするために、アッセイ培地中にIL-3含有培地から洗浄する必要があります。リガンドは、多くの異なる形態で来ることができるようにアッセイするためにこれらを準備する際には注意する必要があります。防腐剤、抗菌剤、塩または異なるpHの緩衝液は、アッセイに影響を与えることができ、および非トランスフェクトするBa / F3細胞の並列テストは、バッファ関連の問題について通知することができる理由です。

私たちは、半定量的および定量的なプロトコルの両方を使用しています。半quantitatiVEのアッセイは、前より多くの時間とサンプルを必要とし、完全に定量にコミットするには、サンプ...

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開示事項

スティーブンA.スタッカーとマルク・M.アーヘンは、概日テクノロジーズ株式会社、成長因子のVEGFファミリーを標的とすることにより治療薬を開発する会社では株主です。

謝辞

SASとMGAは、プロジェクト助成金、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)からのプログラム助成金と研究フェローシップ、およびオーストラリアのビクトリア州政府が提供する運用インフラ支援プログラムからの資金によってサポートされています。MMHは、ピーター・マッカラム財団の助成金から支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Trypan BlueSigma-AldrichT81540.4%溶液を細胞懸濁液と1:1で使用して、生細胞を測定します。ハザード-癌を引き起こす可能性があります
G418硫酸塩 (Geneticin)Invivogenant-gn-5トランスフェクション真核細胞を選択するための薬剤。ハザード-アレルギーや喘息の症状、または呼吸困難を引き起こす可能性があります。
3H-チミジンパーキンエルマーNET-027この放射性ヌクレオシドは、有糸分裂中に染色体DNAに組み込まれます。ハザード放射線
Vialight Plus KitLonzaLT07-221ATP モニタリング試薬を使用して生存率を定量化するための細胞 ATP の生物発光検出
Prestoblue Cell ViabilityReagent InvitrogenA13261レサズリンベースの細胞生存率指標。細胞の還元環境で色が赤くなります
Nunclon Delta Surface (72 well)Thermo Scientific136528Small microtitre plate
96 well Tissue Culture PlateFalcon, Corning Inc.
DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
Fetal Bovine SerumGibco 10099-141
セルハーベスターTomtec ライフサイエンスTomtec ハーベスター、96 マッハ 3M セルハーベスター
液体シンチレーションカウンターLKB Wallac1205LKB Wallac 1205 ベータプレートシンチレーションカウンター
UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177ホワイト 96 ウェル Barex マイクロプレート、GF/B フィルター 1 & マイクロ;m ポアサイズ
ゲンタマイシンギブコ、ライフテクノロジーズ15750-060
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ、ライフテクノロジーズ 15140-122
0.22 um 細孔セルロース アセテート遠心分離管 フィルターユニットCostar、コーニング8160遠心分離管フィルターは0.22 µ500 & micro内のm細孔CA膜含有フィルターユニット;L容量ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ。
蛍光リーダーBioTekBioTek Synergy 4 ハイブリッド マイクロプレート リーダー 
PBS中の353072

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