覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

サマリー

覚醒マウスにおいて、細胞外神経活動を同時に記録し、記録部位付近で複数の神経活性物質を放出する電極の構築方法を提示します。この技術により、目的のニューロンへの推定される局所シナプス入力の詳細な分析が可能になります。

要約

神経伝達物質および神経修飾物質、その結果、異なる神経応答の活性の違いは、麻酔をかけたと目を覚ました動物との間で見つけることができます。したがって、覚醒した動物におけるシナプスのシステムの操作を可能にする方法は、麻酔薬による影響を受けないニューロンの処理にシナプス入力の寄与を決定するために必要とされます。ここでは、同時に細胞外神経活動を記録し、覚醒マウスにおける記録部位の近傍に複数の神経活性物質を放出するための電極を構成するための方法を提示します。これらの手順を組み合わせることで、我々は選択的に頭拘束マウスの下丘のニューロンでGABA _A受容体をブロックするgabazineのmicroiontophoretic注射を行いました。 Gabazineに成功し、このような周波数応答領域と刺激固有の適応などの神経応答のプロパティを変更しました。したがって、我々は我々の方法はrecordinに適していることを示していますグラムシングルユニット活動と聴覚処理中の特定の神経伝達物質受容体の役割を解剖するため。

記載された手順の主な制限は、レコーディング・セッションに動物の慣れのレベルによって決定され、比較的短い記録時間（〜3時間）、です。一方、複数の記録セッションは、同じ動物で行うことができます。 （例えば全身注射または光遺伝学モデルの使用など）、神経伝達や神経調節のレベルを操作するために使用される他の実験手順に対するこの技術の利点は、薬剤の効果は、ターゲットニューロンにローカルシナプス入力に限定されていることです。また、電極のカスタム製造は、（例えば、録画の信号対雑音比を改善するためのチップ抵抗等の）関心のニューロンの神経構造や種類に応じて、特定のパラメータの調整を可能にします。

概要

神経興奮と抑制の相互作用は、感覚情報¹を処理するための基本です。また、麻酔は、皮質の活性化およびシナプス入力^2,3の時間パターンの動態に強い影響を有することが知られています。例えば、麻酔薬は皮質ニューロン^3,4における視覚誘発反応の持続時間を変化させることが観察されています。また、興奮性と抑制性シナプス入力間 ​​の比率は、両方の誘発と自発的活動率^6,7を変更^すること、麻酔し、覚醒した動物で^4,5異なります。覚醒中に、阻害は励起よりも強かったのに対し、シナプスのコンダクタンスを測定することにより、ハイダーや同僚^4は阻害が麻酔下での振幅で励起と一致したことがわかりました。これらの知見は、覚醒動物における感覚処理に関する特定のシナプス入力の影響を研究するための実験手順の開発を促します。

（NAのオーダーの）小電流注入を適用することにより、帯電した神経活性物質の制御放出は、広くシナプス入力の寄与と感覚処理^8-13で推定細胞受容体の役割を研究するために使用されてきました。 microiontophoresisと呼ばれるこの技術は、迅速かつ閉じ込め効果に寄与する記録ニューロンの近傍に薬剤の適用を可能にします。この手順は、全身注射、微小透析または光遺伝学技術の使用など、他の実験操作によって誘発される広範囲の効果と比較して、神経活性物質の局所作用を研究するために、より適しています。通常、ピギーバック電極構造^14,15は、同時に標的ニューロンを記録し、関心の神経活性物質を送達するために使用されます。これは、神経活性物質を運ぶmultibarrelピペットに装着された記録電極から構成されています。 Oの修正HaveyとCaspary ¹⁴によって説明riginal手順が実施されてきました。例えば、タングステン電極の代わりにガラスの一つは、神経活動^16を記録するために使用することができます。記録の要件を満たすためにタングステン線のヒント、ガラス絶縁、および先端露出の調整の電解エッチング：タングステン電極^17,18の製造のための以前に公表された方法は、3つの一般的なステップを伴います。

聴覚神経科学における興味深いと緊急フィールドは、刺激固有の適応（SSA ^19）の研究です。 SSAは、他の、めったに提示しない音に一般化されていない反復的な音に神経応答の特定の減少です。 SSAの重要性は、聴覚脳内の逸脱検出の基礎となる神経機構としての潜在的な役割に存在するだけでなく、聴覚の後期ミスマッチ陰性コンポーネントの可能性の神経相関は、潜在的な^20,21を誘発しました。 SSA O聴覚皮質^19,22-24までICからccurs。 GABA媒介阻害はまた、麻酔²⁶の影響を受けることが示されたSSA ^7,16,25の利得制御機構として作用することが実証されています。ここでは、前と覚醒したマウスにおけるGABA _{A -}受容体の選択的アンタゴニストの適用中にICニューロンのシングルユニット活動を記録するために前述の方法を組み合わせたプロトコルを提示します。まず、ピギーバック電極と次の、外科的および記録方法の製造を説明します。薬物放出の有効性を試験するために、我々は受容野と同様に前とgabazineのmicroiontophoretic排出中のICニューロンのSSAのレベルを比較しました。

プロトコル

全ての実験手順は、の承認を得て、サラマンカ大学で行われ、サラマンカの動物管理委員会の大学、​​の基準だけでなく、欧州連合（指令63分の2010 / EU）の規格に準拠した方法を使用していました神経科学研究における動物の使用。

1.タングステン電極

注：タングステン電極の製造はメリルとエインズワース²⁷とエインズワースら ²⁸に記載^された独自の手法に基づいており、バロックら ¹⁷に記載^のワークステーションのセットアップを使用して行われます。

1. 2.5MΩ - ICニューロンの単一ユニットの細胞外活動を記録するために、1.5の先端インピーダンスと電極を使用しています。詳細な説明は上述の参考文献中に見出されているのでここでは、タングステン電極の製造に含まれるステップは、のみ簡単に説明します。
2. カスタムビルドのアライメントにタングステン線を配置ツール（ 図1A）は、所望の長さへの切断を補助します。位置合わせツールは、ワイヤへ〜40mmの長さを制限するために、一端に停止して、2mmの間隔で平行に接着30針（25 G）からなります。慎重に粘着テープでワイヤーの緩い端を取り付け、強力なハサミでワイヤーの残りの部分をカット。
3. すべての配線がテープに付着したままであることを確認して、アライメントツールからタングステン線を除去するために、テープから慎重に引き抜いてください。良好な電気的接続が存在するので、スピンドルにしっかりと電線を保持し、真鍮のスピンドル（ 図1B、C）の上にテープをロールバックします。
4. ワークステーションで5回転モータにスピンドルを接続し、エッチング液（KNO _2、80ミリリットル当たり90グラム）内に突出するワイヤの先端を浸します。角度エッチング溶液の表面に対して45°軸スピンドル。電線の〜1月3日は、溶液を接触するように、ワイヤ先端を浸し。
5. イム回路を閉じるために、エッチング浴中に炭素棒電極をERSE。スピンドルが回転している間に、スピンドル軸にエッチング供給を適用するために、スプリング銅編組ブラシを使用してください。電極と250ミリアンペアにエッチング液を通過する電流を調整します。電流は200ミリアンペアまで低下すると、チップエッチングを停止します。ワイヤ先端は非常に細かい点にエッチングされます。
6. 任意のグリースおよび接着剤の残留物を除去するために、炎を介して1尖らのワイヤを渡します。ホウケイ酸ガラスキャピラリー内にワイヤ（第一平滑末端）を配置（1.5ミリメートルのOD、0.86ミリメートルのID） その下端に粘土でブロックしました。上部と下部に垂直方​​向にピペットを固定します。加熱コイル（直径5ミリメートル、深さ5ミリメートル）と中断し、プランジャーを使用してピペットを引き出します。ワイヤは、プランジャーの重量により下方に引っ張られているように、溶融ガラスは、その周りに非常に微細な被膜を形成します。
7. ナトリウムの溶融ビーズの助けを借りて、電極の鋭利な端に先端をカバーガラスを削除します四ホウ酸。それは、ビーズに溶けるまでビードを形成するためには、発熱体の上に置き、ゆっくりと水（〜0.5ミリリットル）少量の四ホウ酸ナトリウム（〜0.25グラム）を混合し、直径〜2ミリメートル。加熱素子の温度は、ポテンショメータによって制御されます。テーブルに固定されたマニピュレータアーム上のビーズや発熱体を配置し、ビーズは、低倍率で顕微鏡下でフォーカスされるまでそれを移動します。
8. スライドにガラスで覆われたワイヤーを固定し、顕微鏡下に置きます。先端と四ホウビーズが焦点になるまで段階ノブでスライドを移動します。それがわずかに溶けるまでビーズを熱し、そして〜10ワイヤ先端の挿入 - 15μmで。加熱ポテンショメータをオフにします。ビーズが冷却としては、それが収縮し、基礎となるタングステンを露出させ、電極の先端からガラスを削除します。タングステン電極を使用する準備が整いました。

2. Multibarrelガラスピペット製造業

1. マルチの端を保護しますバレルガラスキャピラリー熱収縮チューブと（H-構成で5バレル）、プラークランプに、より良いグリップを可能にし、破損を防止し、垂直プラーに1を配置します。
2. これらのパラメータの特定の設定に応じて、同様に変更した後、38を微調整：熱：：84、サブマグネット力：49、メインマグネット力15ミリメートル〜の先端の長さを取得するには、次のパラメータにプラーを設定発熱体。
3. 閉塞ヒントを2ピペットを得るために、キャピラリーを引き出します。細かいハサミやピンセット、またはメスの平らな面を使用して、30ミクロン - 〜20をモデリング粘土を使用して、スライド上にピペットをマウントし、外径があるまで、顕微鏡下でピペットの先端を破ります。壊れたエッジが粗すぎる場合には、ステップ1.7に記載の四ホウビーズ技術を使用して絞り込みます。
4. 顕微鏡クワガタに搭載された3軸の小型マイクロポジショナーの終わりに20 G針で作られたホルダーに（セクション1）からタングステン電極を配置電子。先端から30ミリメートル〜、10° - 鉗子を使用して、電極5の端部を曲げます。
5. 顕微鏡下で、慎重にmultibarrelチップの上にタングステン電極の位置を合わせます。いったん整列、2つの上部バレル間の溝にフィット、multibarrelそれまでの連絡先を電極を下げます。離れmultibarrelの先端から20ミクロン - それは〜15を突出するまで、電極の先端をスライドさせます。電極とより良い接着を得るために、できるだけ小さくmultibarrelとシンナーアンサンブルとの間の角度を作ります。
6. 先端から離れた光硬化性接着剤〜5ミリメ​​ートルの小滴を適用します。接着剤はmultibarrelチャネルを遮断することを避けるために、先端に到達しないように注意してください。
7. 青色光LEDランプを使用して接着剤を硬化します。より良い接着のために、必要に応じて硬化/接着剤のアプリケーションを繰り返します。
8. タングステン電極の端部がホルダーから解放されるまで静かに顕微鏡ステージを移動します。スライドからピギーバックアンサンブルを削除します。
9. 番目のラップ熱収縮チューブの短い長さのピギーバック電極の電子中間部、さらにmultibarrelにタングステン電極を確保するガラス用速硬化エポキシ適切に適用されます。

Microiontophoresis 3.薬

注：水に溶解したときにmicroiontophoresisのために使用される薬剤は、電荷を持っている必要があります。興味のある薬剤は、この手順のために適切であるかどうかを確認するために文学を確認してください。ここでは、gabazine手順、GABA _A受容体のアンタゴニストは、記載されています。

1. 水を殺菌し、何の溶質を含有しない確保するために0.2μmのシリンジフィルターを用いて蒸留水をフィルタリングします。この蒸留水を使用してgabazineの20mM〜千μLを準備します。
2. 先の細いpH電極を用いて、0.2μmのろ過NaOHで4への希釈液のpHを調整します。
3. -20ºCで200μlのアリコート - 100を保管してください。記録の日に解凍。動物がある前にその日、拘束柔軟なプラスチック針を装着した100μlのマイクロを使用して、薬でmultibarrel電極の - （5μlの3）edは、樽を埋めます。

4.手術とHeadpostの移植

1. 27と30グラムの重量を持つ2つのオスのCBA / Jマウス（ ハツカネズミ ）で実験を行います。ブライアントと同僚^{29、Portfors}および協力者^30-32、およびデュケとMalmierca ²⁶の外科手術と記録手順に従ってください。
2. 手術前の日に、動物を処理し、それらを自由に探索できるようにすることで、記録チャンバーにそれらを慣らします。 1日3セッション、少なくとも30分間持続それぞれ1を実行します。この方法では、動物は、録音中に穏やかで快適になります。
3. ケタミンの混合物（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kgの）を使用してマウスを麻酔は、筋肉内注射しました。この用量では動物は約1時間のために深く麻酔をかけています。 1 THIRの補助的な用量を与えます必要に応じて、初期投与量のd-。
4. 38±1ºCの温度を維持し、2耳バーと一口バーを使用することにより、定位フレームに動物の頭を安定させるために設定した加熱毛布の上に動物を置きます。耳のバーで鼓膜に穴を開けないように注意してください。
5. 眼科用ゲルのドロップを適用することによって、目を保護します。
6. はさみを使って頭皮を剃ると皮膚を消毒するためにポビドンヨードを適用します。
7. メスを用いて、頭蓋骨を露出させ、頭頂部と後頭部の骨のより吻側一部を覆う骨膜を後退させるために正中線に沿って切開を行います。
8. 頭蓋骨上のラウンドとフラットベース（直径5mm）で軽量ジュラルミンheadpost（重量〜0.65グラム、長さ30ミリメートル、 図2A）を接着し。自由、その端部を残してheadpostの中央に銀線を接着。銀線を、電気生理学的記録のために参照電極として使用されます。
9. LIGの薄い層を適用しますHT-硬化性頭蓋骨上の接着剤とheadpostのベース。 10秒待ってから、正中線に沿って、頭頂骨の吻側領域の上headpostを置きます。
10. 効果的な接着強度を、光が20秒間青色光源を使用して接着剤を硬化させます。
11. 3つの穴の周りや電気ドリルや小さなドリルビットを使用してheadpostのベースの背後をドリル。
12. 頭蓋骨とヘッドステージとの間の追加の接触点として機能するように開けられた穴に2時計のネジ（〜2ミリメートルの長さ）を配置します。ネジは1.5でジャストフィットを実現するためにターンが必要です。彼らが緩んでいないことを確認する鉗子でネジをテストします。
13. 必ずそれ接点硬膜を作る第三の穴に銀アース線の先端を挿入します。頭蓋骨にワイヤーを結合するための耐水性シアノアクリレート接着剤の小滴を適用します。
14. 頭蓋骨とheadpostの結合を強化するために、光硬化性複合材料を適用します。 headpostのベース、銀線の低い部分をカバーし、そして記録時にアクセスを許可するには、ラムダの後ろに拡張しないように注意しながら、ネジ、。青色光源を用いて硬化させます。
15. 頭蓋骨への挿入に近い首の後ろに筋肉を撤回。小さなトレパン（2.35ミリメートル径）を使用して、下丘（IC）を露出させるために、ちょうど正中線にラムダ縫合糸と横の下に丸い窓を開けます。境界線が緩んでいる場合には、微細なピ​​ンセットでカバーする骨を引き上げます。出血が発生した場合、それを停止し、冷滅菌生理食塩水ですすいでください。
16. それはコンポジットと光硬化と窓周り（ワイド〜1ミリメートル、高〜1ミリメートル）の小さな壁を作ります。
17. 抗生物質軟膏で露出した頭蓋骨と筋肉をカバーしています。そして、記録ウィンドウの周囲に壁を作った後によく生成を充填し、滅菌生理食塩水でICの露出表面を濡らし、ワセリンでそれをカバーしています。
18. 鎮痛剤として（0.03ミリグラム/キログラム、滅菌生理食塩水で1:10に希釈した）ブプレノルフィンを皮下に注入します。
19. トンに動物を保管してくださいそれは目覚めとレコーディング・セッションの前に3日間手術から回復するためにそのハウジングケージにそれを返すまで、彼は毛布を加熱します。個々のrat'sハウジングケージの家動物はゼリーを一掃ケージメイトを防止し、金属グリッドカバーに触れheadpost。動物は、単一の収容されたときにケージにいくつかの濃縮を置きます。また、感染を防止し、慎重に動物が適切に回復し、不快感の兆候を示していないことを確認するために毎日のおがくずを変更します。ワセリンが露出脳を保護する記録ウィンドウの上にある場合にも確認してください。

5.電気生理学的記録とMicroiontophoresis

1. 回復後、記録環境に順応し、その頭部が拘束した動物の時間を与えます。マウスはその体の大きさ（ 図2B）に刻まれたカスタムメイドのクッション泡拘束具の上に座っている間にホルダーにheadpostを固定することにより、動物を順応させます。この意志limをそのマウスの動きとその冷静に貢献します。
2. 10分のセッションで開始し、次第に120分に期間を増加させます。セッション中に、甘い液体で動物を報いる所定の間隔³³で（コンデンスミルク、水に30:70に希釈）。その後、記録セッション中に、開始時に、セッションの終了時に、または全く神経細胞が単離されていない状態で同じ報酬を与えます。
3. 動物が記録前に非常に興奮している場合は、軽度の鎮静アセプロマジン（2ミリグラム/キログラム、腹腔内）を注入します。関心の神経システムによれば、鎮静はあなたの結果に影響を与えることができます。
4. 10分 - 動物が自由に5ための記録室を見てみましょう。
5. 泡のカスタムメイドのクッション制止（ 図2B）に、動物の体を置きます。
6. 定位フレーム（ 図2C）に取り付けられたホルダーにheadpostを固定します。これは動物に液体報酬を与えるために良い時間です。
7. 共同綿毛布と動物の体内版と緩くプラスチックhemicylinderや粘着テープを使用して固定します。
8. 記録ウィンドウからワセリンを削除し、暖かい滅菌生理食塩水で洗い流してください。
9. 神経活動とgabazineのイオン導入アプリケーションを記録します。
   1. マイクロドライブによって制御され、マイクロマニピュレータに取り付けられ、そのホルダーにmultibarrel電極を配置します。
   2. 小さなワニクリップを使用して、記録用の配線を接続します。タングステン電極の端部に正端子を接続し、その接点硬膜銀線にグランド端子。
   3. 各バレルの内側にコーティングされていない銀線を配置するので、一方の端に接触ソリューションと他端がアクセス可能です。製造業者の説明書に従って、microiontophoresisデバイスにそれらの両端を接続します。
   4. 脳の先端に接触面までmultibarrel電極を移動します。目の乾燥を防ぐために暖かい滅菌生理食塩水を適用します。電子脳組織。その時点で、シングルユニット活動を探しながら、バレル先端からの薬物の漏出を回避するために、（特定の薬剤に関する文献を確認し、gabazine -10 NA）保持電流を印加します。
   5. 単一ニューロン細胞外活性を単離するための標準的な技術を使用してください。ニューロンの周波数応答領域（FRA）を取得し、 すなわち 、周波数およびニューロンがこれらのサウンド^34-36に敏感であるため、応答を惹起することが可能な強度の組み合わせ。
   6. 同様の発火率とパターンを呼び起こす二つの周波数（f1とf2）を選択します。オドボールパラダイムの下で、これらの周波数のそれぞれとして稀で、反復刺激を提示します。
      注：簡単に言うと、変わり者パラダイムにおいて、一つの周波数（F1）が発生する確率が高い反復刺激として提示され、第二（F2）は、繰り返しのものの中からランダムに散在稀逸脱刺激、あるとき。第変わり者シーケンスでは、相対2刺激の確率が逆になっています。刺激パラダイムの詳細は、以前に^22,37に記載されています。
   7. （ - 20 nAの10）正の値に電流をシフトすることによってgabazineをリリース。再びFRAを入手し、gabazineアプリケーションの下で変わり者のパラダイムを繰り返します。発火率が観察されている中で目に見える効果まで排出を維持します。特定の薬剤、その濃度、及び放出電流の大きさに応じて、20分 - それは、通常、5を取ります。薬物の影響下での値を得るために、記録プロトコルを繰り返します。
   8. 保持値に電流を戻すことによって、注入を停止します。オドボールパラダイムにFRAまたは応答が値を制御するために返すことを監視することにより、洗い流すために薬物の効果を待ちます。
      注： - 1日3時間、および動物が不快感や苦労の兆候を示している場合は、以前の終了すべき記録セッションは、2を最後にすることができます。報酬の液体を与え、記録CHをカバーワセリンとアンバー。

6.データ解析

1. gabazine注入だけでなく、SSAのレベルの前との間にFRAを測定します。
2. 共通SSA指数（CSI）と以前^{19,22,23,38,39}記載したように周波数固有のSSA指数（SI）によってSSA応答の強度を定量化します。 CSIおよびSIはまれな刺激に対する神経応答と反復1への応答間の正規化の違いを反映しています。正CSIおよびSI値は、（刺激あたりスパイク）は、繰り返しのトーンよりも稀に高かった神経応答を示しています。
3. 制御と薬剤吐出状態からのデータを比較してください。

結果

私たちは、ICの4よく分離されたニューロンのシングルユニット活動を記録しました。覚醒マウスにおける細胞外記録中に得られた代表的な信号対雑音比は、 図3Bに示されている。 図4Aは、前及びGABA _Aの遮断がgabazineで-受容体の間に各ニューロンの周波数応答領域（FRA）を示します。応答の強さ（スパイク/刺激）と同様に、スペクトルのチューニングの広がりの増加が観察されました。誘発反応の増加は、（ 図4B）提示されたすべての周波数および強度に神経応答から得られた累積周囲の刺激時間のヒストグラムにも明らかでした。

ニューロンのFRA（ 図4Aの×印）内の周波数のうちの1つまたは2ペアはsに、変わり者パラダイムにおける反復又は希音として提示されるために選択されましたそれらの応答におけるSSAのレベル...

ディスカッション

覚醒した動物における神経活性物質のmicroiontophoresisは、プローブと単一ニューロン^40,41の活性に特定のシナプス入力の役割を分析するための強力な手法です。さらに重要なのは、この手順では、麻酔薬の潜在的な干渉なしに神経回路上の神経伝達物質および神経調節物質の影響の決意を可能にします。ここで、我々は目を覚ましたマウスのICでgabazineのアプリケーションはロバスト周波数同調（ 図4A）、時間応答パターン（ 図4B）およびSSA（ 図5）に変更することを示しています。

記載された手順の主な制限は、レコーディング・セッションに動物の慣れのレベルによって決定され、比較的短い記録時間（〜3時間）、です。一方、複数の記録セッションは、同じ動物で行うことができます。 microiontophoresisを使用すると、それがどの程度まで不明です適用される神経刺激性物質が周囲の組織に拡散します。したがって、神経回路網の活動上の可能な効果が記録されたニューロン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タングステンワイヤー	ハーバード装置株式会社	33-0099	0.005インチx 3インチ
ホウケイ酸ガラス毛細管	Harvard Apparatus LTD	30-0053	ラメントなしのホウケイ酸標準壁、外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ100 mm
のマルチバレルガラスキャピラリー	ワールド精密機器	5B120F-4	5バレルキャピラリー、長さ4インチ、外径1.2 mm、フィラメント付き
Diaplus	DiaDent	2001-2101	ガラス製マルチバレルピペットにタングステン電極を取り付けるために使用される光硬化型接着剤
G-Bond	GC Corporation	2277	動物の頭蓋骨にヘッドポストを取り付けるために使用される光硬化型接着剤
カリスマ性	ヘレウス・クルツァー	66000087	ヘッドポストと頭蓋骨の結合を強化するために使用される光硬化型複合材料
Araldit Cristal	ガラスマルチバレルピペットへのタングステン電極の取り付けをさらに固定するために使用される	Ceys
加熱ブランケット	Cibertec	RTC1
定位フレーム	成重	SR-6N	マウス用改造
マイクロイオン導入装置	ハーバード装置株式会社	ニューロフォア BH-2	IP-2イオントフォレーシスポンプ(薬物送達チャネルごとに1つ)とバランスモジュールを含む
マルチバレルガラスピペットプーラー	成茂	モデル PE-21
LEDランプ	テクノフラックス	CV-215	5 W、430-485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	フレキシブルプラスチックニードル、34 AWG
Imalgene	Merial		Ketamine、100 mg / mL
ロンプン	バイエル		キシラジン、20 mg/mL
ガバジン / SR-95531	シグマ	S106	準備 ~ 1000µ20 mMガバジンを蒸留水に溶かし、pHを4に調整します