バイオフィルム関連をターゲット<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して

サマリー

ほとんどの細菌感染症はバイオフィルムを生成します。その環境のおかげで、バイオフィルム関連細菌はしばしば表現型的に薬剤耐性があります。したがって、バイオフィルム中の細菌を殺す新しい抗菌分子は、高い優先順位です。バイオフィルムの根絶に有効な抗菌化合物を迅速にスクリーニングするためのアッセイを確立します。

要約

ほとんどの病原菌は感染中にバイオフィルムを形成することができますが、バイオフィルムの操作と評価が難しいため、実験室での作業の大部分はプランクトン細胞で行われています。ここでは、黄色ブドウ球菌を用いて実施されるペグプレートバイオフィルムアッセイについて説明します。細菌バイオフィルムは、96ウェルマイクロタイタープレートの蓋に取り付けられたペグで増殖し、バッファーに穏やかに浸して洗浄し、薬物チャレンジプレートに入れます。その後のインキュベーション後、それらを再び洗浄し、蛍光色素レサズリンが生存率の指標として機能する最終回収プレートに移します。このアッセイは、使いやすさ、信頼性、再現性が大幅に向上し、キネティックリードとして実施した場合に豊富なデータを提供します。さらに、このアッセイは、エンドポイントの蛍光読み出しを代わりに行うミディアムスループットの薬物スクリーニングアプローチに適合させることができ、創薬努力の道筋を提供します。

概要

病原性微生物は、非急性慢性感染¹に導くインビボでバイオフィルムを形成することができます。バイオフィルム関連感染は、異物（ 例えば、人工骨置換、乳房インプラント）、または気管チューブまたは尿道カテーテル²のインストールの注入を伴う医療処置の重大な危険因子です。バイオフィルムベースの感染はめったに自分でクリアされないように、これらの状況では、抗感染療法も免疫応答性個体では、ほとんど常に必要である。 黄色ブドウ球菌は、の使用中に発生するバイオフィルム関連の合併症に関与し、最も頻繁に観察された病原体の一つであります侵襲性医療機器^3。

残念ながら、保護バリアとしてのバイオフィルムの本質は、浮遊細胞^1,4より治療に対してより耐性になり、予測臨床的有効性の評価は、両方の初期の重要な部分です医薬品開発だけでなく、薬剤耐性サーベイランス。プランクトンの文化に焦点を当てた実験室条件は、忠実に実世界の疾病^5を表していない可能性があること増加肯定応答があります。さらに問題を配合、バイオフィルムの表現型の複製は困難であり、既存のバイオフィルムモデルは面倒であり、高間およびアッセイ内変動⁶苦しみます。このように、多くの研究者は、必要を通じて、それによって潜在的に細菌毒性および疾患の重要な側面を無視し、薬剤感受性の浮遊性細胞アッセイをデフォルトに。

ここでは、具体的には、S、細菌をアッセイするためのプロトコルを記述します96ウェルベースのバイオフィルムシステム^7,8を利用^して事前に成長したバイオフィルム中の黄色ブドウ球菌 、。バイオフィルム形成と挑戦のためのプロトコルは、本質的に製造業者の勧告に従っているが、我々はbioF遺伝子の生存率を定量化するための代替情報が豊富な方法論を提示しますチャレンジ後ILM。簡単に説明すると、細菌がバイオフィルムは、プレートの蓋に取り付けられた突出ペグに形成ペグプレートで培養されます。バイオフィルム形成後、ペグは穏やかに浮遊細胞を除去するためにPBSで満たされた新鮮なプレートのウェル中に浸漬されています。ペグ蓋は、添付のバイオフィルムで、アッセイされる抗生物質の種々の濃度を含む、新規のチャレンジプレートに移します。第二のインキュベーションの後、蓋を再び取り出し、洗浄し、そしてそれらが最終インキュベーションを受けるレサズリン色素を含有する回収プレートに移します。レサズリン変換を動力学的に記録された、または定義された回復期間の後、エンドポイントの読み取りとすることができます。独自プロトコル⁷に記載され、このバイオフィルムの生存率を定量化するの染料ベースの方法は退屈CFU（コロニー形成単位）かなり異なるカウントベースの方法論。 OD薬物挑戦板とレサズリン変換速度の₆₀₀の測定値は、生存率のリードとして働きますそれぞれプランクトンとバイオフィルム細胞のアウト、バイオフィルムの生存のための高速で信頼性の高い、情報が豊富で技術的に簡単な分析を提供しています。

プロトコル

1.バイオフィルム開始

1. 栄養豊富な培地中でバイオフィルム産生生物の文化を育てます。グリセロールストックからミューラーヒントン培地10mlに黄色ブドウ球菌株ニューマンを接種します。 S.の取り扱いに関わるすべての作業を実行します手袋と安全キャビネット内球菌 。
2. ロータリーシェーカー（100〜200回転）に37℃で16時間インキュベートします。
3. 分光光度計と標準キュベット（：1センチメートル経路長）を用いて培養のOD _600を決定_します 。
4. 式を使用してchelexedロズウェルパーク記念研究所培地（cRPMI中^）9で0.1のOD _{600（接種材料）}で接種物の20ミリリットルを準備するために必要な培養液量（V）を計算します。[V = 20ミリリットル* 0.1 / OD _{600（文化）]}
   注：リファレンス9のcRPMIの準備の詳細を提供します。
   1. 万×gで1分間回転させることによって遠心分離管、ペレット細胞に（上から）計算培養容量を加えます。 prepaへバイオフィルム接種再、20ミリリットルのcRPMIで過ごした成長培地を再懸濁細胞ペレットを吸引。
5. 25ミリリットルのリザーバーに接種材料を注ぎます。
6. 慎重にそれをまっすぐに引き上げて、滅菌96ウェルペグプレートからふたを外します。
   注意：注意は、蓋から垂下ペグを汚染しないように注意する必要があります。蓋は安全キャビネット内の清浄表面上に逆さまに配置することができます。
7. 200μlのマルチチャンネルピペットを用いて、底板のGへの行の各ウェルに125μlの接種材料を追加します。
8. 無菌性制御などの行Hの各ウェル中の125μlの無菌のcRPMI培地を記入してください。
9. ペグ蓋を取り、下に向けペグ付きプレート底部の上にそれを保持します。慎重に、それ​​ぞれのウェルを有する個々のペグの位置を合わせます。プレートとペグの間の物理的接触を避けてください。整列した後、慎重にダウン蓋を下げます。ペグの後に行われる再調整が底板は続きがあり触れてきたようにミスアライメントを避けます行Hのアミ無菌コントロール
10. しっかりとシール、密封可能なビニール袋に蒸発し、場所を防止するために、パラフィンフィルムでプレートに蓋をシール。蒸発を最小限に抑えるために、できるだけ低くバッグ内の空気量を保ちます。
11. 5％CO ₂インキュベーター中で48時間37℃で振盪せずにインキュベートします。
    注：成長の48時間は、Sのために最適となっています黄色ブドウ球菌が、使用する生物に基づいて異なります。
    注：静的なインキュベーションは、アッセイを最適化するための良い出発点ですが、静かにマイクロプレートシェーカー上で150 rpmで振とうすると、一部のS.のバイオフィルムの形成を促進する可能性のある変動であります黄色ブドウ球菌が分離します。

バイオフィルムチャレンジプレートの調製

1. バイオフィルムチャレンジの日に新鮮な96ウェルプレートを取ると、一貫性のない結果を回避するために、行の各ウェルBにHに、RTに平衡化のcRPMIの100μLを、追加、200μLを保持することができ、96ウェルプレートを利用メディアのペグが内側であり、バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法でウェルを備えていたとき。
2. ステップ2.7での最終希釈を考慮するために、所望の最終濃度を2倍のcRPMI中の1.0ミリリットルで別々に4試験化合物まで希釈します。
   注：良い出発点は、浮遊細胞の阻害濃度以上の8倍です。
3. A3、ウェルA12にA10のA9にウェルA7におけるA6にウェルA4中の化合物2、化合物3および化合物4に、ウェルA1に化合物1の200μLを加えます。
4. シリアルマルチチャンネルピペットを用いて、試験化合物を希釈し、B行と混合するためにA列から100μlのを転送します。
5. そのようにして、ウェルによく100μlのを転送し続けます。各転送後に混合し、行Fに停止
6. 混合した後、廃棄物容器に行Fから100μLを追放します。行GとHに液体を転送しないでください
7. にマルチチャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルにcRPMI中の100μlのを追加します。200μlにボリュームをもたらします。最終的なプレートレイアウトについては、 図1を参照してください。

3.バイオフィルムチャレンジ

1. バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法を有するウェルを備え、新鮮な滅菌96ウェルプレートにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の200μlのを追加します。
2. インキュベートバイオフィルム開始プレートからプラスチックの袋とパラフィン膜を除去。
3. まっすぐふたを持ち上げます。バイオフィルムを損傷する恐れがあり、このようペグとプレート底部との接触を避けてください。 （3.8を参照）、その後のOD ₆₀₀の分析のために底部を保管してください。
4. （ステップ3.1から）PBSを含むプレート上にペグ蓋を配置することにより、浮遊細胞を洗い流します。 PBSの外に持ち上げ、5秒間ペグ水没し、ウェル側面に対するペグをヒットしないように注意して、もう一度水没。
5. チャレンジプレートにすすぎペグ蓋を置きます。これはにつながるバイオフィルムにダメージを与えますようにペグと底板との間に不必要な接触を避けます一貫性のない結果。
6. シールパラフィンフィルムでプレートし、ステップ1.10で説明したように密封可能なビニール袋に入れます。
7. 5％CO ₂インキュベーター内で37℃で24時間振盪せずにプレートをインキュベートします。
8. 3.3からバイオフィルム開始プレートの底を取ります。各ウェルにマルチチャンネルピ ​​ペットを使用して細菌を再懸濁し、全てのウェルに生じる成長を確認するために、適切なマイクロプレートリーダーでOD _600を測定_するが、行Hの無菌コントロール

4.バイオフィルムの決意

1. インキュベーションチャンバーとレサズリン変換を検出するための運動蛍光測定値をとることができる装備プレートリーダーを使用してください。 530nmの励起および590nmの発光を用いて24時間の運動蛍光測定を設定します。
2. 37℃に室内温度を設定し、プレートを20分ごとを読んでいます。メーカーのinstrucに係るプレートの底から測定するために、プレートリーダーを設定します。ション。
3. 滅菌96ウェルプレートにマルチチャンネルピペットを用いて200μlのPBSを添加することにより、洗浄プレートを準備します。
4. 0.8ミリグラムの400μLを添加することによって、バイオフィルムの回復培地を調製/ 16 / mlのレザズリンの最終濃度までのcRPMI培地20mlのストック溶液をレサズリンmLです。
   注：レサズリンは、既知の皮膚刺激性です。処理中に白衣、スプラッシュゴーグル、手袋を使用してください。バイオフィルムの回復メディアとしてのcRPMIは、最低のバックグラウンド信号を提供するために使用したが、適切な場合には、ミューラーヒントン培地に置き換えることができます。
5. 新鮮な96ウェルプレートの各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いてバイオフィルムの回復培地150μlを添加します。
6. 安全キャビネットに移すインキュベーターからチャレンジプレートと慎重にビニール袋を取り外し、封止膜。
7. チャレンジプレートからペグ蓋を外し、3.4で説明したようにPBSに浮遊細胞を洗い流してください。その後のOD ₆₀₀ ANAための挑戦プレートの底を保ちます溶解（4.10を参照）。
8. すすいだ後、バイオフィルムの回復培地を含むプレート底部にペグ蓋を置きます。
9. 周囲のウェルの底を妨げないように注意しながら、パラフィンフィルムでプレートの側面を包みます。すぐにプレートをラップした後、プレートリーダーの上に置き、ステップ4.1から以前に運動プロトコルリザズリン製を開始することにより、24時間の期間にわたって運動の読み取りを開始します。
10. または挑戦中に発生してもしなくてもよい浮遊細胞の成長を定量化するために、マイクロプレートリーダーを使用して、全体チャレンジプレート底部のOD _600を読み取ります。ステップ3.8で与えられた指示に従ってください。
    注：バイオフィルムをオフに流して細胞がウェルの底に塊に成長する傾向があるとして慎重に各ウェルの内容を再懸濁します。ウェル内の気泡を強くOD ₆₀₀の読みを妨害する、回避または読み取りの前に除去されなければなりません。

結果

レサズリンアッセイは確実に挑戦した後、薬剤を含まない培地中で複製することができる非常に少数の生存可能な細胞を検出するのに十分な感度です。この方法論では、我々は何のレサズリン変換は24時間以内に見られない最低の濃度として最小のバイオフィルム根絶濃度を定義します。レサズリンアッセイは、青からピンクへの染料の色を変換する代謝的に活性な細胞に見られる酸化的分子に依存しています。染料の変換は、このように、細胞増殖の指標であり、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量することができます。本論文では、ネオクプロインとCu-ネオクプロイン（銅と複合体を形成ネオクプロイン）はS.関連するバイオフィルムに向かってそれらの活性について試験しました黄色ブドウ球菌は、 図1に基づいてレイアウトを適用する。プロトコルの実行中に得られたデータは、品質管理として機能するバイオフィルムの開始プレートのOD ₆₀₀読み取りである（データは示していません）プレート底部の、OD ₆₀₀

ディスカッション

ここでは、Sでテストした阻害剤の活性を測定するために修飾バイオフィルムアッセイを記載していますバイオフィルム関連する細胞の代謝状態に焦点を当て球菌バイオフィルム。記載のバイオフィルムの開始とチャレンジ手順主に模倣メーカーの推奨事項が、24時間の阻害剤の挑戦を生き残るバイオフィルム関連細胞を検出し、定量化するための色素をレサズリンの使用は劇的に細胞（水浴の超音波処理を介して）回復とそれに続く列挙の推奨手順を簡素化CFUの計数を経由しての生細胞。このメーカー推奨の手順は、それらの各エラーを起こしやすい、労働集約、および自動化することは非現実的に少なくとも5つの追加操作ステップを伴います。ペグプレートアッセイの読み出し手順を簡素化することの利点は、高スループット動作及びアプリケーションのための魅力を増加させます。

ステップ数によって長いプロトコル、このprocedurけれどもeは、いくつかの重要なステップで、かなり概念的には簡単です。最も決定的に、繰り返し同じ品質のバイオフィルムを増殖する能力は、再現性のある結果を得るために必須です。ペグ蓋を取り外しま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405
メーカーRPMI-medium	Corning の	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 ミディアム Chelex 100 樹脂で 1 時間チェレックス 1640 充填後、10% アンチェレックス RPMI-1640
Chelex 100 樹脂	バイオ ラッド	142-2822
MBEC プレート	Innovotech	19111
レサズリン ナトリウム塩	Σ	R7017	800 & マイクロ;脱イオン水中のg/ml    フィルター滅菌
マイクロプレート振とうプラットフォーム	ハイドルフ タイトラマックス 1000
Cytation 3 プレート リーダー	Biotek
Gen5 ソフトウェア	Biotek		レサズリン変換の記録と分析
ネオクプロイン	シグマ	N1501	100%エタノールで10 mMストックを調製し、-80 & ordmで保存します。C
硫酸銅	Acros Organics	7758-99-8	、水で100 mMのストック溶液を準備し、4 & ordmで保存します。C
Cu-ネオクプロイン	自作		ネオクプロインと硫酸銅の等しいモル濃度を混合して生成します。混合物をCRPMI培地で所望の濃度に希釈した。
ゲンタマイシン	シグマ	G3632-1G

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