マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

サマリー

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。

要約

多発性硬化症は、認知および運動障害を生じる中枢神経系（CNS）において病変形成することを特徴とする炎症性自己免疫疾患であると推定されます。それはまた、CNS内の病変形成、運動障害を特徴とし、また、自己免疫疾患および炎症反応により駆動されるので、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSの有用な動物モデルです。 EAEモデルの一つは、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）マウスにおける_35-55に由 ​​来するペプチドを用いて誘導されます。 EAEマウスは、進行性疾患のコースを開発しています。このコースは3つのフェーズに分かれています。前臨床段階（日0から9）、疾患の発症（日10から11）と急性期（日12から14）。 MSおよびEAEは、CNSに浸潤する自己反応性T細胞によって誘導されます。これらのT細胞は、さらに、免疫細胞の動員をもたらすケモカインおよびサイトカインを分泌します。脊髄dのため、免疫細胞の分布3疾患の段階をuringすることを検討しました。 T細胞、B細胞および単球の活性化/増殖/蓄積が開始される疾患の時点を強調するために、リンパ節、脾臓および血液中の免疫細胞の分布についても評価しました。さらに三病段階におけるいくつかのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）のレベルは、疾患の炎症過程への洞察を得るために、測定されました。結論として、データは、EAEの病理中の免疫細胞の機能プロファイルの概要を説明します。

概要

多発性硬化症（MS）およびその対応する動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、中枢神経系（CNS）における自己免疫神経炎症の変化を示します。早期活性MSおよびEAEの病変は、浸潤免疫細胞の存在によって特徴付けられます。 MSの病因は不明であるが、広く自己反応性T細胞によって媒介ミエリンの破壊を伴うと考えられています。これらの自己反応性T細胞は、循環からのB細胞、単球および好中球などの他の免疫細胞を誘引前炎症性サイトカインおよびケモカインを分泌します。単球はマクロファージに分化します。自己反応性T細胞によって分泌されるインターフェロンγ（IFNγ）は、前炎症性マクロファージにマクロファージを偏光します。前炎症性マクロファージ放出サイトカインおよびオリゴデンドロサイトのアポトーシスを促進する活性酸素種。オリゴデンドロサイトの死は脱髄につながります。さらに、B細胞は、pに分化します細胞をlasma、最終的にミエリンの劣化が生じ、ミエリン鞘に対する自己抗体をリリース。ミエリンの喪失は、軸索及びニューロンの劣化にし、それによってMS ¹の主な特徴を表すCNSにおける病変部位の形成をもたらします。周囲に、T細胞とB細胞はリンパ節において活性化され、それらは、脾臓中で増殖し、中枢神経系への循環を通って移動します。単球および好中球は骨髄で増殖し、また、中枢神経系への循環を通って移動します。

血液中へのまたはCNSへの血流からの骨髄、脾臓およびリンパ節からの白血球の血管外漏出は、ケモカインおよびケモカイン受容体によって媒介される白血球と内皮細胞との間の分子間相互作用を含むいくつかの要因に依存する多段階プロセスです。種々の細胞型によるケモカインの産生、免疫reactio中に誘導することができますその後炎症^2,3の部位への免疫細胞を補充腫瘍壊死因子α（TNFα）などのサイトカイン、IFNγおよびインターロイキン6（IL-6）、によってN。免疫細胞は、炎症部位への細胞型及び移動経路に応じて、それらの表面上のケモカイン受容体のサブセットを提示します。したがって、CXCR2、CCR1とCXCR1は、骨髄や血液⁴で成熟した好中球上に発現し、そのリガンド、CXCL2、CCL5またはCXCL6の結合され、それぞれ、好中球を活性化し、その後、細胞の遊走を内皮細胞への接着を促進し、組織^5-9に。 CCL2とCCL20はそれぞれ、CCR2 ¹¹およびCCR6 ^12を発現^し 、単球およびTh1 / Th17細胞^10を 、引き付けます。 T細胞、単球およびマクロファージを含む^、13の異なる細胞型によって発現CCR1及びCCR5、CCL3、CCL5及びCCL7に結合し、MS ¹⁴の間にアップレギュレートされます。 CXCR3は、T細胞上に発現され、CCL9、CCL10に結合され、かつCCL11 ^15。

MSの治療における一つの主要な戦略は、免疫細胞の枯渇またはCNSへの免疫細胞の浸潤の予防です。したがって、特定のケモカイン受容体の遮断は、EAEに検討されています。拮抗作用またはCCR1 ¹⁶の遺伝子欠失、CCR2 ^17は 、CCR7 ¹⁸またはCXCR2 ^19は、拮抗作用またはCCR1 ²⁰の遺伝子欠失のに対し、CCR5 ²⁰またはCXCR3 ^21は病変を減少させなかった、EAEの病理を低減します。したがって、白血球上の特定のケモカイン受容体の発現は、CNSへの後者の浸透のために重要であり、EAEのコースを指示します。

浸潤免疫細胞は、順に、炎症過程またはニューロン²²の劣化を促進し、TNFα、IL-6およびIL-1βなどのサイトカインを放出するため、免疫細胞の枯渇が、MS患者に対する有効な治療戦略です。また、自動反応性Th1細胞は、順番に、TNFα、IL-1βおよびIL-23を解放するためにマクロファージを刺激しIFNγを放出します。

この原稿は、EAEの誘導、EAEマウスの種々の組織における免疫細胞の分布とサイトカインレベル（mRNA）の決意を示しています。細胞は、最終的にCNSにおける病変形成をもたらす炎症過程の時間依存性の概要を提供するために、疾患の経過中の異なる時点で単離しました。

プロトコル

倫理の声明：私たちの実験手順はRegierungspräsidiumダルムシュタット（ドイツ）の倫理委員会によって承認され、国内および欧州の規制に確認されています。すべての努力は、動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減少させました。

1. EAEモデル

1. EAEモデルの誘導
   1. EAEの誘導のために10〜13週齢の雌129S4 / SvJae×C57BL / 6マウスを使用してください。
   2. 200μl中400μgの結核菌を含む完全Freund`sアジュバント（CFA）を乳化_55（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）ペプチド（200μgの）、 _-脳炎誘発性MOG ₃₅の、背面上部および下部に、マウスに皮下注射を与えます。
      注：陰性、非疾患誘発偽対照として、同じ量および同じ経路で、 結核菌を含む不完全フロイントアジュバントを使用することができます。
   3. THEReafter、そして再び24時間後、マウスを（200μlのリン酸緩衝生理食塩水、PBSで希釈し、合計0.2μgの中で、）百日咳毒素の腹腔内注射を与えます。健康な動物との患部を比較することができるように、対照群として未処理マウスを使用してください。
      注_：、55ペプチド300 - _- - 300μgのMOG ₃₅ 200でEAEを誘導することも可能である注射当たり0.2ミリリットル- 0.1の容量で0.3μgの百日咳毒素- CFAと0.2での結核菌 500μgの。
   4. （ステップ1.2.1を参照）、注射後1週間以降、臨床症状について毎日マウスを調べます
      注：疾患発症の日が異なる実験で変動するが、我々の研究室での条件の下で、これは11日目のまわりであり、従って、ここでは14日目には、疾患の発症後3日間として定義されています。本研究における全てのマウスは臨床症状を発症しました。
2. マウスのスコアリング
   1. 次のように臨床スコアによって臨床症状を分類：0）兆候ない、尾の0.5）遠位麻痺、1）尾の完全麻痺、1.5）尾の引きずりと後肢の軽度の弱さ、2）尾の引きずりと後足の重度の衰弱、2.5）尾の引きずりとの麻痺1後肢、3）尾の引きずり、両方の後肢の麻痺、後肢と1前肢の弱さの両方の3.5）麻痺が（このスコアを達成したマウスは）地元の倫理ガイドラインを踏まえて、安楽死させました。

フローサイトメトリー分析のための単一細胞の調製

注：抗体混合物は、1μlのCD45-VioBlueに、2μlのCD8-eFluor650、0.5μlののCD11b-eFluor605、0.5μlのF4 / 80-PE-Cy7を、1μlのCD3-PE-CF594、CD4-V500、0.5μlのCD11cので構成されてい-AlexaFluor700、1μlのCD19-APC-H7と1μlのLy6G-APC-Cy7を。

注：血液、リンパ節、脾臓および脊髄を取る場合は、次のように手順は次のとおりです。マウスを深くisoflの組み合わせで麻酔urane（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）。次に、胸郭を開き心臓内棒で血液を除去し、冷PBSで心臓内にマウスを灌流。その後、脾臓、最終的には脊髄が続いリンパ節を削除します。あなたが心臓内にマウスを灌流する必要がない場合は、首の脱臼により深い麻酔下でマウスを安楽死させます。

1. 脾細胞の単離
   1. イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。
   2. 80％のイソプロパノールでウェット切開領域は、はさみを使って、毛を持つ任意の汚染を回避し、より深部の組織を穿刺することなく、縦方向に胸郭を開きます。
   3. 冷PBSのpHは7.0 ²³で心臓内にマウスを灌流。
      注：脾臓は胸郭の下で左上腹部の象限に位置しています。脾臓が検討される場合にのみ、この器官はretaiするために、灌流前に除去することができます関心のあるすべての細胞型をn個。
   4. 脾臓を取り出して、約1/8をカットし、それを量ります。氷上のPBSでサンプルを保管してください。
   5. 2mLの注射器のプランジャーを用いて、（50mlのチューブ上に配置）70ミクロンメッシュの篩を通して脾臓組織を絞ります。
   6. 5ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。 3分間1800×gで遠心分離します。ソリューションを溶解500μlのペレットを再懸濁。
      注：この段階では、後で、代替のFACS解析方法は、ビーズを使用しないという使用される場合、差分細胞カウントを行うことが必要であってもよい（セクション3を参照）。
   7. 室温（RT）で10分間インキュベートし、500μlのPBSを追加します。室温（RT）で650×gで6分間遠心。
   8. 500μlのPBSで洗浄工程を繰り返します。 100μlの0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）で細胞ペレットを再懸濁し、上清を捨て/ PBSは、2μLのFc受容体1（のFcRI）ブロッキング緩衝液を追加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
   9. 13μlの追加tibody混合物を、暗所で室温で15分間インキュベート室温で650×gで6分間、500μlのPBSおよび遠心分離機を追加します。上清を捨てます。
      注：メーカーの染色手順は、単一の洗浄を推奨するが、バックグラウンド染色のさらなる減少は、必要に応じて洗浄工程を一又は二回以上繰り返すことによって達成することができます。
   10. 500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁（またはおそらくタンパク質の分離のためのバッファを実行すると、潜在的に細胞凝集を減少させる）、フローサイトメトリーチューブに移します。細胞を氷上に保管してください。
2. リンパ節細胞の単離
   1. イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。
   2. 80％のイソプロパノールでウェット切開領域とハサミを使用して縦方向に胸郭を開きます。冷PBSのpHは7.0 ²³で心臓内にマウスを灌流。
   3. 鼠径リンパ節を単離するために、慎重にハイの領域で皮膚を除去鉗子で脂肪組織の外に慎重にリンパ節をpと選択します。鼠径リンパ節を秤量し、氷上でPBSでサンプルを保存します。
      注：我々は、我々の研究のためO`Connor らに鼠径リンパ節を使用していました。活性化単球、マクロファージ、好中球およびT細胞の高い数は、すべてのEAE誘導後²⁴鼠径リンパ節中に存在することを見出しました。
   4. 2ミリリットルの注射器のプランジャーを用いて、（50ミリリットルチューブの上に配置）70ミクロンメッシュの篩を通してリンパ節を絞ります。
   5. 5ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。 8分間、2400×gで遠心分離します。 100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁し、2μlののFcRIブロッキング緩衝液を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
   6. 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。
   7. 上清を捨て、300μlのPBSで細胞ペレット（または適切なランニングバッファー）を再懸濁し、それを移しますフローサイトメトリーチューブに。
3. 血液細胞の単離
   1. （EDTAで安定化された）50μlの血液に50μlの20 mMのHEPESを追加し、ソリューションを溶解500μlを添加します。 RTで10分間インキュベートし、500μlのPBSを追加します。室温で650×gで6分間遠心分離します。上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。
   2. 100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁し、2μlののFcRIブロッキング緩衝液を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
   3. 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。 、上清を捨て、300μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。
4. 脊髄細胞の単離
   1. イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。
   2. 80％のイソプロパノールで湿潤切開領域と縦方向に胸部を開きはさみを使って。冷PBSのpHは7.0 ²³で心臓内にマウスを灌流。
   3. 背面の切開領域を湿らせ、メスで再び縦カットをすると皮膚を取り除きます。
   4. （後肢を神経支配）脊椎の腰部を切り出し、脊髄を抽出​​するためにPBSで満たされた注射器でそれをフラッシュします。 、腰椎コードの約1/3を切り取り、これを計量し、氷上でPBSでサンプルを保存します。
   5. 4°Cで2分間250×gで遠心分離します。上清を捨て、500μlの細胞剥離液とHBSS追加（1：1）。 、3 mg / mlでコラゲナーゼA及び1単位/ mlのDNアーゼIを追加アップ繰り返し、ダウンピペッティングにより細胞を首をはねると400rpmで37℃で振とうしながら30分間インキュベートします。
      注：好ましい場合、細胞懸濁液は、バックグラウンド自己蛍光のANを低減することにより、測定フローサイトメトリーの感度を向上させることができる密度勾配遠心分離によりミエリン及び細胞残屑を汚染するクリアすることができ取得する必要のあるイベントの数をD（セクション3.5を参照）。
   6. 室温で2分間、250×gで遠心します。上清を捨て、1ミリリットル10％ウシ胎児血清（FCS）/ダルベッコ最小必須培地（DMEM）中にペレットを再懸濁し、最大繰り返し、ダウンピペッティングにより細胞を再度首をはねます。
   7. 室温で2分間、250×gで遠心します。洗浄工程を繰り返します。
   8. 1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、2ミリリットルの注射器のプランジャーを用いて、（50ミリリットルチューブの上に配置）70ミクロンメッシュのふるいを通して脊髄を圧迫。
   9. 4ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。室温で3分間、1,800×gで遠心します。上清を捨て、のFcRIはブロッキング試薬2μlを添加し、暗所で室温で15分間インキュベートし、100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁します。
   10. 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。
   11. 上清を捨て、細胞PELLEを再懸濁500μlのPBS（または適切なランニングバッファー）でtとフローサイトメトリーチューブに移します。

3.フローサイトメトリー分析

1. オレシュら ²⁵によって記載されるように最適な濃度を決定するために、事前にすべての抗体を滴定します。
2. manufacturer`s指示に従って、マルチカラー補正行列を作成するために単一色補正のための抗体捕捉補償ビーズを使用します。
3. manufacturer`s指示に従って特定のビーズを使用して、毎日機器較正を制御します。
4. 直接測定のフローサイトメトリーの前に、絶対細胞数を決定するために（分離のためのセクション2.1、2.2、2.3、2.4を参照）を細胞に30μlのフローサイトメトリー絶対数の標準を追加します。代わりに計数ビーズを用いて細胞を計数することができます。
5. フローサイトメーターに試料（50万イベント：10万イベント、脊髄、脾臓、リンパ節及び血液からの細胞）を取り上げますND特定のフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析します。
   1. フローサイトメトリーソフトウェアを開き、ボタン「サンプルを追加」を押すことで、FCS 3.0のファイルを追加します。
   2. ダブルクリックして追加したファイルを開きます。 x軸とy軸のチャンネルを調整します。目的の細胞集団を選択するには（ 図4を参照）は、ゲートを作成します。

4.定量的PCR分析

1. cDNAへのmRNAの単離および転写
   1. フェノール-クロロホルムにより腰部脊髄（1/3）、脾臓（1/8）および鼠径リンパ節からmRNAを抽出し、エタノール²⁶で沈殿します。
      1. このために、10分間インキュベート1mlのグアニジンチオシアネート - フェノール混合物中で組織をホモジナイズします。 200μlのクロロホルムを加え、再び10分間インキュベートします。
      2. 遠心分離工程（4℃で15分間、18,000×gで）した後、4時（上部の水相は、500μlのイソプロパノールおよび遠心分離機である8分間18,000×gで洗います°C）。
      3. 500μlのエタノールでペレットを洗浄し、遠心分離工程（4℃、5分間18,000×gで）した後、真空濃縮器（30℃、5分）でペレットを乾燥させます。その後、30μlの水にペレットを再懸濁。
   2. 血液からmRNAを抽出するには、遠心分離機500μlのEDTA安定化血液（300×gで10分間、4℃）。
      1. 、バフィーコートを取る白血球を含有する、溶液（150mMのNH ₄ Cl _を 、100mMの_炭酸水素ナトリウム、0.1mMのナトリウム、EDTA pH7.4）に溶解1mlに希釈します。
      2. 室温で10分間インキュベートした後、6分間、650×gで細胞を遠心分離し、その後PBSで2回洗浄します。
      3. 製造者の指示に従ってRNA抽出用キットを使用して、白血球（WBC）からmRNAを抽出します。
   3. 製造業者の指示に従ってランダムヘキサマーを含むcDNA合成用キットを用いてcDNA合成を行います。 CDN 200 ngのmRNAをを使用して合成。
2. 定量PCR
   1. 特定のmRNAの量を定量化するために、1μlのcDNAを、1μMリバース/フォワードプライマーと、製造元の指示²⁷に従って、蛍光DNA結合色素を使用します。プライマーセットのための配列については表1を参照してください。定量PCRシステムを用いて、IL-1β、IL-6、IL-23、IFNγ、TNFαおよびPPIA（ペプチジルプロリルイソメラーゼ）のCT値を測定します。
   2. 相対的mRNA発現を決定するために、比較CT（サイクル閾値）法^27を使用^します 。
      1. このため、以前の研究（Barthelmes らに記載されているように、標的遺伝子からPPIAの平均CT値を減算することによりPPIAの発現レベルに標的遺伝子のCT値を正規化する^{。28、Schiffmann} ら ^{。29、Schiffmann} ら ^30）。続いて、ΔCT値を正規化する、使用して、いわゆるΔΔCT値を計算しますEAEマウスにおけるΔCT値から未処置マウスにおける平均ΔCT値を減算することにより再度、未処理マウスの標的遺伝子の発現レベルにEAEマウスからの標的遺伝子の。
      2. ^{- ΔΔCT2：}標的遺伝子の相対的mRNA発現を得るために、以下の式を用いて比を計算します。
3. 各プライマーの特異性をテストします。 2％アガロースゲル^31を使用して増幅断片のサイズを決定します。フラグメントサイズを表 1に示します。

結果

図1は、この記事で説明されているさまざまな方法の概略図を示します。1）マウスは、MOG _35-55抗原の注射を受け、10.7±0.3日²⁸後の初期の臨床症状を起こします。 EAEマウスの代表的な疾患経過を図1に示されている。2）種々の組織（脾臓、リンパ節、腰部脊髄）および血液を前臨床段階（2日目、4日目の間に異なる時点で制御し、EAEマウスから抽出され、6日目）、疾患の発症時（10日目）および疾患（12日目、14日目）。3）EAEの発生を調節するサイトカインのmRNA発現プロフィールの急性期の間、さまざまな決定されます組織は、定量的PCRを用いて、疾患の経過中の異なる時点で抽出した。4）単一細胞抽出種々の組織から単離されます疾患の経過および免疫細胞の分布の間の異なる時点でフローサイトメトリーを用いて決定しました。

ディスカッション

ここで説明EAEモデルは、MSのモデルとして最も注目されており、日常的にMS ³²のための治療戦略を試験する際に使用されます。マウスの疾患は、MSの多くの臨床的および組織学的特徴を示し、神経細胞の抗原に対する自己免疫の誘導によって引き起こされます。ミエリン抗原に対する感作は、血液脳関門機能不全に関連し、それによって、CNSへの免疫細胞浸潤されます。我々の知見は、免疫細胞が急性期でリンパ節内に一時的に増加することを示しています。脾臓T細胞とB細胞は、疾患の前臨床段階で減少します。好中球は、疾患依存的に増加させるのに対し、血液循環において、T細胞、B細胞、樹状細胞および単球は、前臨床段階で一過性に増加します。最後に、脊髄内に、免疫細胞の増加が検出（ 図 2）です。これらのデータは、T細胞およびB細胞が作用脾臓から移行することを示しますこれらの細胞は、それらが活性化し、増殖しているリンパ節のリザーバ。その後、彼らは、脊髄への血液循環を経て移行します。好中球、単球および樹状細胞が、一方、CNSへの循環を介して骨髄から移動します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ABI Prism 7500 配列検出システム	Applied Biosystems, Austin, USA		定量PCRシステム
Accutase	Sigma Aldrich Munich, Germany	A6964	cell detachment solution
CD3-PE-CF594	BD, Heidelberg, Germany	562286
CD4-V500	BD, Heidelberg, Germany	560782
CD8-eFluor650	eBioscience, Frankfurt, Germany	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience, Frankfurt, Germany	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD, Heidelberg, Germany	560583
CD19-APC-H7	BD、ハイデルベルク、ドイツ	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-910
CompBeads	BD, Heidelberg, Germany	552843 compensation	beads
Collagenase A	Sigma Aldrich Munich, Germany	C0130
Cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	BLI-580-10
サイトメーターのセットアップとトラッキングビーズ	BD、ハイデルベルク、ドイツ	642412
DNase I	Sigma アルドリッチ、ミュンヘン、ドイツ	D5025
EAE Kit	Hooke Laboratories、ローレンス、アメリカ	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend, Fell, Germany	123114
First Strand cDNA-Synthesis kit	Thermo Scientific、Schwerte、ドイツ	K1612
Fc受容体-1ブロッキングバッファー	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
Flow cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	580
FlowJo software v10	Treestar、アッシュランド、米国		フローサイトメトリーソフトウェア
LSRII/Fortessa	BD、ハイデルベルク、ドイツ		フローサイト
メーターLy6G-APC-Cy7	BD、ハイデルベルク、ドイツ	560600
Lysingソリューション	BD、ハイデルベルク、ドイツ	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K0221	蛍光DNA結合色素
RNeasyミニキット	Qiagen、ヒルデン、ドイツ	74104	RNA抽出キット