方法論記事

植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順

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DOI：

10.3791/53940

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2016年4月9日

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

この記事について

サマリー

>jove_content<ここで提示されている実験計画法は、植物抽出物中の分散粒子を凝集させる能力の観点から、さまざまな凝集剤の評価を可能にし、その結果、濁りと下流処理のコストを削減します。

要約

植物は、食品、飼料、原材料などの商品を提供するだけでなく、バイオ医薬品などの付加価値製品の製造プラットフォームとしてますます使用できるため、人間にとって重要です。どちらの場合も、微粒子を除去するために液体植物抽出物を清澄化する必要があるかもしれません。最適な清澄化により、容量と寿命が延びることにより、ろ過と遠心分離のコストが削減されます。これは、凝集剤と呼ばれる荷電ポリマーを導入することで達成でき、凝集剤は分散した粒子を架橋して固液分離を促進します。植物抽出物のような複雑な混合物の機構的な凝集モデルは存在しないため、代わりに経験的モデルが使用されます。ここでは、さまざまな凝集剤の迅速なスクリーニングを可能にし、植物抽出物の清澄化を最適化し、濁度を大幅に低減する実験計画法の手順について説明します。結果として得られる予測モデルにより、ロバストなプロセス条件と相補的な特性を持つポリマーのセット(特定の導電率を持つ抽出物の効果的な凝集など)を特定できます。タバコ葉抽出物の結果は、他の植物種や組織にも容易に適応させることができるため、コモディティや植物由来の医薬品のより費用対効果の高い下流プロセスの開発が容易になります。

概要

植物は、広くそのようなフルーツジュースのような食料品を製造するために使用されるが、それらはまた、より高い値のバイオ医薬品製品1-3の製造のためのプラットフォームとして開発することができます。両方の場合において、下流処理（DSP）は、多くの場合、粒子を含んだ抽出物4,5の明確化に続いて、このような葉や果実などの組織からの液体の抽出から始まります。バイオ医薬品の製造のために、DSPのコストが全体的な製造コスト6,7の最大80％を占めることができ、これは、部分的には、ブレードベースの均質8,9として破壊の方法で調製した抽出物中に存在する高い粒子負荷を反映しています。抽出物中の粒度分布に合わせてフィルタ層の合理的な選択は、フィルタ容量を増加し、コスト10,11を削減することができるが、改善がごとに保持されなければならない粒子の数によって定義される絶対的な容量の上限を超えることはできません明確化を達成するためのフィルタ領域の単位。

より少ない粒子が濾過列における最高のフィルタの表面に到達した場合天井に持ち上げることができる、分散粒子が大きなフロック12を形成するために凝集を促進する凝集剤として知られているポリマーと混合される場合、これを達成することができます。このようなフロックの微細化と、より高価なデプスフィルターに到達する粒子の負担を軽減し、より粗い及びより安価なバッグフィルターによってさらに上流に保持することができます。ポリマーは、適正製造基準（GMP）に準拠している必要があり、そして典型的にはモル質量> 100 kDaのを持っている必要がありますし、中立的であるか、または13を帯電したことができますいずれかのバイオ医薬品などのため、それらの用途に適した安全性プロファイルを、持っている必要があります。中立凝集剤は、一般に、それらの凝集および径のフロックを形成させる分散粒子を架橋することによって作用するのに対し、1ミリメートル11、荷電ポリマーがdの電荷を中和します>ispersed粒子は、その溶解性を低下させ、従って、沈殿14を引き起こします。

凝集は、抽出物15,16の特性と一致するように、このような緩衝液のpHまたは導電率、及びポリマーの種類や濃度などのパラメータを調整することによって改善することができます。 0.5〜5.0のG L -1ポリエチレンイミン（PEI）で前処理したタバコ抽出物については、デプスフィルタ容量の2倍以上の増加が100-Lパイロット規模のプロセスで報告されました。セルロース系濾過助剤17と組み合わせた場合、このポリマーのコスト未満€10キロ-1プロセスにため、その導入は、フィルタ、さらにバッチ16またはあたりの消耗品のため、約€6,000コスト削減をもたらしています。たとえそうであっても、予測モデルは、それらの含有は15〜30分間16,18のホールドステップを必要とすることができるため、ストレージのための更なる投資コストで、その結果、凝集剤の先験的経済的利益を評価するために必要とされますタンク。しかし、凝集の複雑な性質のために、このような実験の結果を予測することができます利用可能なメカニズムのモデルは現在ありません。そのため、より適切な設計・オブ・実験（DOE）アプローチ19本資料に記載されているよう開発されました。一般のDOE手順のためのプロトコルは、最近20を出版されました。

小規模な装置は現在、凝集条件21のハイスループットスクリーニングのために利用可能です。しかしながら、これらのデバイスは、現実的に、植物の凝集中に条件をシミュレートしないことがあり、反応容器（96ウェルプレートのウェルについて約7 mm）の寸法ために抽出した粒子またはフロックは離れて一桁未満であることができます。これは、混合パターンため、​​モデルの予測力に影響を与えることができます。また、原因混合挙動の非線形変化の沈殿を含む方法を縮小し、STAを沈殿させることは困難です性22。そこで、この記事では、100Lのパイロットスケールプロセス16への最初の20ミリリットルの反応ボリュームからスケーラブルな結果をもたらす、一日あたり50から75のサンプルのスループットを持つベンチトップ規模スクリーニングシステムの概要を説明します。エネルギー省のアプローチと組み合わせると、これは予測モデルは、品質・バイ・デザインコンセプトの一環として、プロセスの最適化やドキュメントのために使用することができます。

以下に記載される方法はまた、凝集剤はまた、コスト削減ツール23として検討されている細胞培養ベースのプロセスで製造バイオ医薬品に適合させることができます。また、キャノーラ、トウモロコシおよび大豆24,25で生産βグルクロニダーゼのために示されているように、精製戦略の一部として、粗抽出物から標的タンパク質の沈殿をモデル化するために使用することができます。凝集剤の特性の詳細な説明は、16,26の他の場所見つけることができ、そのポリマーconcentrを確保することが重要ですationsは、非毒性または最終製品11中の有害レベル以下のいずれかです。

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プロトコル

1.適切な実験戦略を開発

  1. 確立または最適化すること凝集手順に関連する環境・プロセス・パラメータを識別し、 すなわちその要因は凝集に最強の効果を持っています。一般的に、最近20が原因で機構的なモデルの不足のために必要である説明したようにDoEのアプローチので、そのようないくつかのパラメータがあります。
    1. 文献データ12、システムとの事前の知識や経験に基づいて選択したパラメータ（要因）。代表的な要因は、緩衝液のpH、緩衝液の導電性、インキュベーション時間及び温度、並びにポリマーの種類および濃度15,16,27を含みます。
    2. カテゴリカル因子に対する各数値の要因とレベルの意味の範囲を定義する（1.1参照）は、同じ参照を使用してください。
    3. 実験の結果（レスポンス）を監視し、凝集の効率性を評価するために使用されるように定義します。システムによっては、このろ液または上清濁度、沈降速度、凝集体の大きさやその後のフィルタ16,23,28-30の容量をすることができます。
    4. その結果、高品質なデータが後でまたは別のオペレータによって行われた実験で増強することができるように、応答を測定するために使用されるアッセイは、再現/、定量的堅牢性と再現性であることを確認してください。
  2. 多くの要因が調査すると知識の度合いがすでにシステムについての累積合っDoEのタイプを選択します。適切なエネルギー省タイプ20を識別するために利用可能な文献を使用してください。
    1. 調査されるべき凝集システムについてはほとんど情報がある場合、スクリーニングのデザインを選択し、多数のパラメータをスクリーニングしなければならないか、少しはパラメータの意味のある範囲について知られています。典型的なスクリーニングの設計は完全かつ一部実施要因設計されています。パラメータは、 例えば、非線形の影響を有することが期待される場合、設計上の中心点を含みます一定の閾値19以上の飽和。
    2. 応答曲面法（RSM）を選択し、 例えば中央の複合設計（CCD）31または最適32,33、よく知られている範囲を有する唯一のいくつかの要因を正確に特徴付けする必要がある場合。
  3. DOEは設計空間の割合が20を満たしているような先験的品質基準を確保し、適切なソフトウェアに設定します。

2.凝集実験を準備

figure-protocol-1
図1：植物エキスの凝集ワークフロー：プロセススケール（左）とベンチトップスケール（右）。水性緩衝液でタンパク質抽出に続いて、細胞破片の分散粒子を凝集剤を添加することにより凝集されます。凝集体は、次いで、バッグ及び深濾過及びこれらの能力のカスケードにより除去されます濾液の濁度と共にフィルタは凝集の効率を測定するために直接使用することができます。

  1. 一般的な実験作業の流れ（ 図1）を開発。
    1. 例えば 、特殊なホモジナイザー、最終的なアプリケーションのスケールで予想と同じ粒度分布をもたらす（またはすでに観察された）抽出装置を、使用してください。可能であればタバコ10を離れるの均質化のために説明したように、抽出のスケールダウンモデルを設計。
    2. 凝集実験（ここでは20ミリリットル）中に使用されるエキスのボリュームを定義します。粒子の代表的な数は、反応容器中に存在することを可能にするボリュームを選択し、20ミリリットルずつ例えば凝集実験は、固形物34との粒子サイズ〜0.5 [w / vで]〜7％を含有するタバコ抽出物のための再現性と拡張性の高い結果が得られました〜3ミリメートル〜16ミクロン。
    3. 番目のように、すべての監視およびポスト凝集操作を設計しますEYは、最終的なアプリケーションの規模を代表するものであり、 例えば生産規模で使用されているのと同じ粒子保持動作とフィルタを選択します。
  2. 抽出物は、派生元となる植物を栽培。
    1. 同じ植物系統、ここではタバコ品種を使用してください。プチハバナSR1、および以前に33記載の製造時に使用される培養条件。
    2. 他の供給原料を処理する場合、それらは例えば 、最終的なアプリケーションの規模を代表するものであり、本格的なバッファを使用するように、これらの供給原料を準備考慮して任意の希釈段階を処理中に、ここでは、予想されるpH及び導電率にpHが7.5に固執し、導電率30ミリ秒-1。
  3. ろ過ユーティリティ、濁度・デバイスのモニタリングおよびサンプリング容器を準備します。
    1. それらはすぐに米国でない場合、15×15 cm 2で、ここで、必要なサイズにフィルタ材料を切断電子モジュール。すべての監視および分析デバイスが機能していることを確認し、すべての試料管にラベルを付けます。
    2. これらは単純なタスクであっても、彼らは実際の凝集実験中の割り込みが発生しないことを確実にするために時間内にこれらの項目を準備します。彼らは凝集は、時間依存性プロセスであることを示す結果を妨げる可能性があるため、遅延を避けます。
  4. 凝集剤原液を準備します。注意：凝集剤、 例えば手袋を取り扱う際には、適切な個人用保護具を着用します。材料は危険なことができます（ヨーロッパUE 67/548 / CEEに応じた危険性のラベル、1999/45 / CEは、N、西またはXnを含みます）。ホコリを避け、物質安全性データシートを参照してください。ヒュームフードの下で働きます。
    1. ここでは、各凝集剤用のストック濃度、80.0グラムのL -1を使用した2 PEIの凝集剤を選択してください。凝集剤を添加する際に、試料希釈を回避するために、できるだけ高い濃度を選択し、粒子concentraを低減することになりまするので、凝集効率に影響を与えます。
    2. ポリマーは既に水50％[重量/容量]の溶液として供給されている場合、例えば 、ポリマーの製造業者の処方を反映する任意の予備希釈用のアカウント。 4〜8％の凝集剤ストック溶液[V / W]これまでに最も適していることが見出されました。
    3. 心の中で、上述の点をベアリング、凝集剤の濃度は、最終的な凝集剤濃度が正しく調整されていないため、潜在的にエラーを起こし、ピペッティングを阻害する、高粘性溶液を生成しないことを確認してください。
    4. これは、このようにエラーの可能性を低減し、ピペッティングスキーム（2.5）のセットアップを容易にするため、可能な場合は、すべての凝集剤に同じストック濃度を使用してください。
    5. pHが4-10と伝導15-55ミリ秒のCMここで、抽出条件に合うように各凝集剤ストック溶液のpH及び導電率を調整-1。メートルならば、単一の凝集剤のための個別銘柄を準備pH及び/又は伝導状態の一組以上の鉱石は、そのポリマーについて試験されます。
    6. もはや使用前に48時間よりも、新鮮に凝集剤ストック溶液を準備していません。凝集以上4週間保存ポリマー株で誘導することができるにもかかわらず、効率が高いまたは低いpH値で、ポリマーの加水分解を減少することができます。詳細については、製造元のマニュアルを参照してください。
    7. Doeの選択されたパラメータは、実験中に各サンプルについて正確に調整することができていることを確認し、 例えばインキュベーション温度を調整するために利用可能な加熱/冷却浴、ここでは4°C、20°Cと37°Cが存在することを確認します。凝集時に混合が実験の一部である場合、混合装置は、電源入力などの重要なパラメータに関して最終的なアプリケーションのスケールの代表であることを確認してください。
  5. エネルギー省のスケジュールは、ピペッティングスキームに変換します。
    1. TESであることが異なる凝集剤の濃度を変換しますストック濃度によって最終凝集剤濃度を分割し、凝集実験で使用したサンプル体積を掛け：抽出物の試料に添加されるストック溶液の体積にテッド。サンプルの20ミリリットルが、これは22ミリリットルになります2ミリリットル凝集剤原液の最大と混合されている場合例えば 、最大の結果の最終的なボリュームを識別します。
    2. 凝集剤の株式の0.75ミリリットルは、バッファの1.25ミリリットルを維持するために必要とされるサンプルに添加されなければならない場合に凝集剤の株式の最大のボリュームに基づいて、すべての凝集アリコートで同じ最終体積を維持するために必要なバッファの容量の追加する、 例えば計算22ミリリットル（2.5.1）の最終サンプル体積。
    3. エネルギー省のために必要とされる原液の絶対容積を計算するために、各ポリマーおよび凝集状態のための凝集剤原液のボリュームをまとめます。
  6. 収穫タバコの葉と抽出液を調製。
    1. トップ6リー​​を削除しますタバコの適切な年齢の植物、6週齢例えば 、そのようなホモジナイザーやスクリュープレスなどの適切な抽出装置への転送からVES（またはプロセス指示にによって示されるようになど多くの）。
    2. グラムバイオマスあたりの抽出バッファーの三巻、 例えば 100グラムあたり300ミリリットルを追加し、8分間ブレンドします。
    3. 異なるpHおよび/または伝導性が試験されている場合は、適切な緩衝液を用いて、個々の抽出物を準備します。ここでは、これは、ブレンダーやジューサー34で3×30秒間の植物材料を均質化することを含みます。
    4. また、調査中のプロセスの代表的な方法で抽出液を調製。
  7. 抽出を等分し、バッファを追加します。
    1. 手動で、徹底的にサンプルは、粒子の均一な分布を有する均質であることを確認するために、全手順の間の抽出物をかき混ぜます。
    2. 正確にデカントすることにより、予め標識反応チューブの中でエキスを配布し、ここで、各容器内の20ミリリットル。自立50mlチューブは取り扱いを簡素化し、20ミリリットルのサンプルに最適です。
    3. 適切なピペットを使用して、各個々の反応管のための固定された最終的な体積を維持するために必要なそれぞれの抽出緩衝液の体積を加えます。

3.異なるポリマーと凝集植物抽出物

  1. エネルギー省のランダム化された実行順序で示さ順次としてサンプルに、ここでは、0.1〜2.0ミリリットルを凝集剤原液の必要量をピペット。徹底的に正確に20秒間振とう強烈なマニュアルによる凝集剤を添加した後、直ちに各サンプルを混ぜます。
    1. 必要に応じて、完全な混合を確実にするために、他の供給原料のための揺れの時間を調整しますが、厳密にすべてのサンプルについて一貫性のある混合時間を確保します。フロックの不可逆的な混乱を引き起こす可能性があり、混合延長し、一貫性のない凝集結果を歪めることができ揺れの間に力を適用するに注意してください。
  2. オプション：2以上の凝集剤の同時適用のために上記の手順を変更します。
    1. オプション1：代わりに、単一のポリマーのは、ここでは2つ以上の凝集剤の混合物、PEIとキトサンを追加します。エネルギー省で定義された凝集剤の組み合わせを使用してください。エネルギー省のセットアップ（1.1）の間の比率および個々のパラメータのようなポリマーの絶対濃度を組み込みます。
    2. オプション2：抽出液に2種以上のポリマーを順次追加します。
      1. エネルギー省のセットアップ時に追加の要因として、抽出に各添加の間、個々のポリマー濃度、その種類、およびインキュベーション時間を使用してください。
      2. また、単一のポリマーの繰り返し添加は凝集を向上させることができるかどうかをテストするには、このアプローチを使用しています。 、4つのステップ例えば 、凝集剤をゆっくり添加をシミュレートするために、段階的添加を使用して、それぞれが4分かけて20ミリリットルボリュームに0.25ミリリットル80グラムのL -1凝集剤の株式を追加することで凝集剤を添加することを模倣することができます0.25ミリリットル分-1の流量。
      3. 全ての場合において、ここでは、サンプル・ボリュームにまだ22ミリリットルすべての凝集剤の最大ボリュームを追加することによって、このセットアップのための新たな最大の最終試料容量を特定し、必要に応じて音量調整のための凝集剤ストック溶液および緩衝液の必要なボリュームを再計算します。
  3. フロックの形成を可能にするために、典型的に3-30分のDoE、で定義された時間にサンプルをインキュベートします。他のすべてのインキュベーション条件、 例えば温度を確認してください、エネルギー省に応じて設定されています。
  4. 観察し、文書のフロック形成。必要に応じてフロック形成の進捗状況を記録し、沈殿した固体の高さを測定することによって、1分当たりの沈降フロックのミリメートルとして例えば 。必要に応じて、夜間など長時間のための凝集を延長します。
  5. 凝集したエキスをフィルタリングします。
    1. 適切な後に凝集したエキスを明確にするために、以前の準備フィルタ材料（2.3）を使用しますフィルター材を通過し、清浄な容器又は反応管に凝集サンプルをデカントすることによりインキュベーション時間。
      1. 濾過前のない再懸濁定住フロックを行うと分〜300ミリリットルの割合でで抽出を適用-1フィルターに、20ミリリットルのサンプルについて3-4秒に対応します。
      2. 異なる材料は、粒子保持の点で最終工程に比べて、ベンチトップ実験で使用される場合、濾過工程の性能を確認して、両方の試料型11の粒径分布を測定することによって、 例えば
    2. 必要に応じて、適切なデバイスを使用して、濁度および/ ​​または粒径分布の観点でろ液を分析し、 例えば、A濁度計。
    3. オプション：不安定なフロックの形成または再形成を調査するために、 例えば 12から24時間、拡張インキュベーション時間後に分析を繰り返します。
  6. Prの規約にサンプルを分析電子定義された応答（1.1.3）。
    1. ろ液からサ ​​ンプルを取り、異なる標的タンパク質または貴重な生成物の濃度例えば 、追加の応答パラメータのためにそれらを分析します。
    2. オプション：プロセスの物質収支を閉じるには、同じパラメータの保持物（主に固形物）を分析します。具体的には、サンプルを処理または凝集剤で処理されていない後の質量残りの固形物を比較することにより、液体回収に凝集剤の効果を定量化します。
  7. データ品質を確認したDOEソフトウェアに結果を転送します。
    1. 収集した応答データ、 例えば予想外に高い値に極端な値を探します。
    2. すべての応答データが正しくそれらに対応する実験条件と整合していることを確認してください。
    3. DoEのソフトウェアに結果を転送し、標準および無作為化ラン注文が混同されていないことを確認してください。

4.評価エネルギー省

  1. 以前に20を説明したように予測モデルを開発するためのDOEソフトウェアの組み込みのデータ分析ツールを使用してください。
    1. モデル構築を容易にするために、必要に応じて適切なデータ変換モードを選択し、ここで10を記録。最大対最小応答値の10を超える比率は、データ変換が必要なことを示しています。ボックス・コックスプロット35を 、例えば 、適切な統計ツールを使用して、最も適切な変換を特定します。
    2. 例えば （i）は、選択のDoE（1.2）に収まると、（ii）のDOEソフトウェアの分散分析（ANOVA）ツールの分析に基づいて、調査中のシステムについての以前の知識と一致するベースモデル、二次多項式を選びました多くの場合、一次多項式よりインキュベーション時間の観察された効果に優れたフィット。
    3. 、それらを選択解除して反復的に有意でないモデルの要因、 例えば p-> 0.05、または因子の相互作用を削除しますrebyは、モデルの複雑さを軽減し、その予測力を増加させます。
    4. R 2を比較することにより、モデルの品質を確認し、調整R 2およびスチューデント化残差の正規確率プロットと一緒にR 2を予測し、残差-VS-ラン、VS-実際の予測とのBox-Coxは36をプロットします。すべてのR 2の値が0.2の範囲内でなければなりません。
    5. 最終モデルは、負の濃度が予測されていない例えば 、物理学や熱力学の基本的な前提条件と一致することを確認します。
  2. ここでは、調査中のシステム、低濁度のために最も有利な条件を予測するモデルを使用してください。
    1. 最も重要な応答およびそれらの好ましい状態、 例えば最小の濁度を選択します。内蔵されているいくつかのDoEソフトウェアパッケージ36の特徴望まし機能または同様のツールを、最大にすることによってこれらの選択を兼ね備えています。
    2. 意図された用途のOによってモデルfは、選択の確認は条件が最も有利で ​​あると予測フォローアップ実験として、それらを選択し、初期エネルギー省の一部ではない場合に最適な条件および/ ​​または、 例えば 、一般的には、モデルの予測力を検証するために実行されます。

5.モデルを改善し、予測精度を確認してください

  1. 最も望ましい動作条件、モデル予測（4.2）に基づいて、0〜1,000比濁濁度単位（NTU）の範囲で例えば、低濁度に初期の設計空間を絞り込みます。
  2. 新しいDOEは重要なまたは関連するものとして同定されているだけでこれらの要因を含め、これらの範囲内で設定します（4.1.2））。
    注：係数は、モデル解析の点で有意であるが、プロセスとは無関係であることができ、応答に対するその効果、すなわち他の要素に比べて、<1％です。
  3. モデル予測の品質はrequiremenと一致するまで繰り返して、1から5.2ステップTS、 例えばソフトウェアによって示されるように、モデルの標準偏差は、意図された用途のために十分です。これらの反復のために必要に応じて実験戦略を変更し、 例えば微細化に一つだけの凝集剤を使用します。
  4. 転送し、パイロットスケールまたは最終生産規模にスケールダウンモデルからの結果を確認します。

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結果

異なるポリマーとタバコ抽出物の凝集

上述の方法は、正常なモノクローナル抗体（HIV中和抗体2G12）と蛍光タンパク質（DsRedの）（ 図1）16の製造中にタバコ抽出物の凝集のためのプロセスを開発するために使用し、以降転送されていますレクチン、マラリアワクチン候補および融合タンパク質（未発表データ）を含む他のタンパク質に。典型的には、凝集剤の適用は、〜6000 NTU（抽出後万NTU）へ〜千NTUからバッグろ過植物抽出物の濁度を減少させました。 （この要因は凝集効率13,27に影響するため）最初のスクリーニング実験では、91ランIV-最適設計は、3つの異なる濃度で18の異なるポリマーをテストするために使用され、〜12時間のインキュベーションペリオ上に凝集を観察D（ 図2AおよびB）。長い潜...

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ディスカッション

粒子の凝集を特徴付けるためにエネルギー省を設定する際に考慮すべき最も重要な側面は、デザインは、原則的に例えば 、pH、ポリマーの種類とポリマー濃度16の影響を予想または考えられる影響36,38を検出し、記述することができなければならないということです。したがって、実際の実験を開始する前に、設計空間（FDS）の割合を評価することが重要です。 FDSは、 例えば 、250の濁度の差を検出し、既知の可変のシステム与えられた2つの実験結果の間で事前に定義された差を検出することが可能な範囲内（設計因子、 例えば、pHによって覆わ）多次元実験空間の割合でありますNTUは、125 NTUの変動を与えられました。 FDSは、追加の実行を使用してデザインを増大させることによって増加させることができ、プロセス制御36を案内するように意図された設計のために≥0.95する必要があります。また、ランの数がトンを許可しない場合彼全実験は一日で行うことが、ブロックを考慮するためのDoEに予め定義されるべきであるバッチ間および日々の変動。植物材料で作...

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開示事項

著者は、開示することは利害の衝突を持っていません。

謝辞

私は、トランスジェニックタバコの種子を提供してくださったトーマス・ラーデマッハー博士と、タバコ植物の栽培をいただいたイブラヒム・アル・アメディに感謝したいと思います。編集協力をしてくださったRichard M Twyman博士と、実りある議論をしてくださったRainer Fischer教授に感謝いたします。この研究は、欧州研究会議アドバンスドグラント「Future-Pharma」(提案番号269110)、フラウンホーファー未来財団、およびフラウンホーファー研究機構の内部プログラム(助成金番号)によって部分的に資金提供されました。125-600164を引き付けます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2100P携帯用濁度計Hach4650000濁度計
2G12抗体PolymunAB002参照抗体
Biacore T200GEヘルスケア28-9750-01SPR装置
BP-410Furh2632410001袋フィルターCatiofast
VSHBASF79002360凝集剤
遠心分離機 5415Dエッペンドルフ5424 000.410遠心分離
機 遠心分離管 15 mlLabomedic2017106反応管
遠心分離管 50 ml 自立Labomedic1110504反応管
ChitosanCarl Roth GmbH5375.1凝集剤
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEソフトウェア
リン酸二ナトリウムCarl Roth GmbH 4984.3 メディアコンポーネント
Ferty 2Kammlott5.220072
Forma -86C ULT冷凍庫サーモフィッシャー88400庫
温室n.a.n.a.植物栽培用
グローダンロックウールキューブ 10 x 10 cmグローダン102446ロックウールブロック
HEPESカールロスGmbH9105.3メディアコンポーネント
K700P 60Dポール5302305デプスフィルターレイヤー
KS50P 60DポールB12486デプスフィルターレイヤー
ミラクロスLabomedic475855-1Rフィルタークロス
マルチライン マルチ 3410 IDSWTWWTW_2020pHメーター/導電率計
オスラム クールホワイト 36 Wオスラム4930440光源
フィトトロンイルカ・ツェルn.a.植物栽培用
ポリミンPBASF79002360凝集剤
POLYTRON PT 6100 Dキネマティカ11010110カスタムブレードツール付き均質化装置
プロテインAライフテクノロジーズ 10-1006抗体結合タンパク質
塩化ナトリウムCarl RothGmbH P029.2培地成分
シナジーHTBioTekSIAFRT蛍光プレートリーダー
TRISCarl Roth GmbH4855.3メディアコンポーネント
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3メディアコンポーネント
VelaPad 60ポールVP60G03KNH4フィルターハウジング
ゼータサイザー ナノ ZSマルバーンZEN3600DLS 粒度分布測定
の型 メガ肥料冷凍

参考文献

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