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方法論記事

補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

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DOI:

10.3791/53944

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2016年4月22日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Konkuk University, 2Department of Chemical Engineering, University of Michigan

この記事について

サマリー

提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。

要約

我々は最近改善された生産収量と持続的な合成のための補因子再生と生体触媒の固定化の機能を備えた、シンプルな再利用可能と連結された全細胞生体触媒システムを開発しました。本明細書に記載さ2 E.から成るこのようなシステムの開発のための実験手順であります機能的に相補的な酵素を発現する大腸菌株 。一緒に、これらの二つの酵素はバイオ反応の生成物の収率を改善するため、高価な補因子の再生を仲介する協同機能することができます。また、アルギン酸カルシウムビーズ中の全細胞のカプセル化によって結合された生体触媒システムの固定化形態を合成する方法が報告されています。一例として、我々は、Eが結合することによって、L-アラビニトールからLキシルロースの改良された生合成を提示します大腸菌細胞が酵素のL-アラビニトール脱水素酵素やNADHオキシダーゼを発現しています。最適条件下で、150の初期濃度を用いmMのL-アラビニトール、最大Lキシルロース収率は、文献に報告されたものよりも高い96％に達しました。結合した全細胞生体触媒の固定化された形態は、遊離細胞系がほぼ完全に触媒活性を失っている間、連続した再使用の7サイクル後の最初のサイクルで得られた収率の65％を維持し、良好な動作安定性を示しました。したがって、ここで報告された方法は、L-キシルロースの工業生産だけでなく、一般的には補因子の使用を必要とする他の付加価値化合物の改善に役立つ可能性が2つの戦略を提供します。

概要

3 -微生物を使用する還元全細胞生体内変化は、商業的および治療 ​​的に重要な生体分子1の化学酵素合成のための普及した方法となっています。 7 -それは孤立した酵素の使用に比べていくつかの利点、特にコストのかかる下流の精製工程の排除と長寿命4のデモを提示します。補因子は、生成物の形成に必要とされる生体触媒の経路のために、全細胞系は、安価な電子供与共基質5,8,9の添加によってその場での補因子再生に提供する可能性を有します。 13 -しかし、この容量が希少または高価な補基質10の化学量論的濃度を必要とする反応のために減少します。一緒に細胞全体の貧しい再利用して、これはスケーラブルで連続のproduの確立を妨げますctionシステム。これらの補因子依存性生物変換のための全細胞システムの戦略的な改変は、前述の制限を克服するために必要とされます。具体的には、協働して動作する全細胞生体触媒の組み合わせは、有意に保有酵素14の生産性及び安定性を高めることが示されています。多くの場合、商業的に実行可能な製品の大量生産を可能にするために重要であり、これらの因子は、共固定化生体触媒微生物15によってさらに最適化することができます。我々は最近、L-キシルロース生産の16のための補因子再生と生体触媒の固定化の両方を可能にする、シンプルで再利用可能な全細胞生体触媒システムを開発しました。この研究では、このシステムは、改善された生体内変換歩留まりと生体触媒の再利用のために、これら2つの戦略を適用する実験手順を説明するための例として使用しました。

L-キシルロースは、CLAに属し生物学的に有用な分子のssは希少糖と命名します。希少糖は、自然の中で非常にまれにしか発生しないユニークな単糖類または糖誘導体であるが、生物活性分子17,18における認識要素として重要な役割を果たしています。彼らは、甘味料、機能性食品からの潜在的な治療薬19に至るまでのさまざまなアプリケーションを持っています。 Lキシルロースは、複数のαグルコシダーゼの潜在的な阻害剤として使用することができ、また、肝炎または肝硬変17,20の指標として用いることができます。全細胞系におけるLキシルロースをキシリトールの高効率変換をパントエアで以前に報告されているが21,22、 アルカリゲネス属 アナナティス 。 701B 23、 バチルス・淡蒼球 Y25 24,25および大腸菌（Escherichia coli）26。 E.で大腸菌は、しかしながら、それは唯一の原因で1よりも初期のキシリトール濃度の潜在的阻害効果に低い（<67 mM）のキシリトール濃度26を使用して達成されましたキシリトール-4-デヒドロゲナーゼ活性21,26上の00 mMの。キシルロースおよびキシリトールの間の熱力学的平衡を強くキシリトール25,27の形成に有利に働くことが示されています。さらに、キシルロース収率は、 その場 で補因子再生系の非存在下で供給されなければならない高価な補因子の量によって制限されます。一緒に、これらの要因は、L-キシルロース生合成のための持続可能なシステムにスケーリングするための可能性を制限します。

これらの制限を克服し、L-キシルロース生体内変換の収率を改善するために、補因子再生の戦略は、結合された全細胞生体触媒システムを確立することにより最初に使用しました。具体的には、 ハイポクレアジェコリーナ （HjLAD）、菌類のL-アラビノース異化経路中の酵素からのL-アラビニトール4-脱水素酵素（EC 1.1.1.12）は、L-キシルロース28,29にL-アラビニトールの変換を触媒するために選ばれました。多くの生合成酵素と同様に、主要なlimitatioHjLADのNは、この変換を実行するために高価なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補助因子（NAD +、NADHの酸化型）の化学量論量を必要とすることです。 化膿連鎖球菌 （SpNox）で見つかったNADHオキシダーゼは、高い補因子再生活性30,31を表示することが示されています。 SpNox、Eのこの属性を利用してLキシルロースの産生のためHjLADを発現する大腸菌細胞は、Eに結合されました図1（a）に示す結合された反応によって示されるL-キシルロース生産を後押しするNAD +の再生のためにSpNoxを発現している大腸菌細胞。最適な条件と150 mMのL-アラビニトールの初期濃度を使用して下に、最大Lキシルロース収率は、このシステムは、はるかに効率的な文献に報告されたものよりも製造、96％に達しました。

全細胞固定化の戦略がさらに結合されたbiocatalytの再利用性を高めるために、次の使用しましたICシステム。全細胞固定化のために一般に使用される方法は、高分子ネットワーク32内の架橋/捕捉およびカプセル化を固体マトリックスにリンク吸着/共有結合が含まれます。これらのアプローチの中で、細胞の固定化のための最も適切な方法は、カルシウムアルギネートビーズ中のカプセル化です。その穏やかなゲル化特性、不活性水性マトリックスおよび高気孔率は、カプセル化された生物学的製剤33の生理学的特性と機能を維持するのに役立ちます。 E.両方を含むため、結合された生体触媒システム大腸菌 HjLADまたはSpNoxをL-キシルロース生産の複数のサイクルを有効にするには、アルギン酸カルシウムビーズに固定化した保有する細胞（ 図2）【選択固定化生体触媒システムは、7サイクル後の最初のサイクルの変換収率の65％を維持し、良好な動作安定性を実証しました連続的な再使用、フリー電池システムは、ほぼ完全にその触媒活性を失っています。

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プロトコル

1.全細胞生体触媒の調製

注：組換えE. pET28a- SpNox 31またはpET28a- HjLAD 28を保有する 大腸菌細胞を、以下、Eと呼ばれています大腸菌SpNoxとE.大腸菌HjLAD、それぞれ。

  1. E.の単一コロニーを接種しますルリア-ベルターニ（LB）培地3ml中の大腸菌 HjLADはカナマイシン（50μg/ ml）を補充し、37°C ​​の 、250rpmでインキュベーターシェーカーO / Nでインキュベートします。
  2. 50μg/ mlのカナマイシンを含有する新鮮なLB 200ml中に100とOD 600が 〜0.6に達するまで37 O C、250rpmでインキュベートする：1により培養を希釈します。
  3. 培地に0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することによりHjLADタンパク質発現を誘導し、16 O C、16時間、180rpmでインキュベートします。
    1. また、25°Cの 、200 RPで誘導を行います6時間メートルL-キシルロース生合成（下記のステップ2）が同じ日に行われた場合。
  4. 誘導された大腸菌を収穫4 O℃で20分間、3200×gで遠心分離により大腸菌 HjLAD細胞上清を捨て、細胞ペレットを処理するために、ステップ2に進みます。
  5. E.のための1.4 -並行して、ステップ1.1を実行大腸菌 SpNox。

カップリングE.によるL-キシルロースの2生合成大腸菌 HjLADとE.補因子再生のための大腸菌 SpNox

  1. 大腸菌の細胞ペレットを再懸濁大腸菌 HjLADとE.コリ SpNox別々に50 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）5.0 g乾燥細胞重量（gDCW）/ Lの細胞密度で。
    注：gDCWから600nm（OD 600）で測定した光学密度との相関関係は、実験を容易にするために確立することができます。において使用される式異なる分光計によって異なる場合があります0.0965、 -このプロトコルは、1 gDCW / L = 0.722 * OD 600です。
  2. 5.0 gDCW / L Eの600μLをミックス大腸菌 HjLAD、5.0 gDCW / L E.600μlのコリ SpNox、20mMのNAD +を100μl、および14 mLの丸底チューブ内の2 MのL-アラビニトール150μlの50 mMトリス-塩酸（pH8.0）を550μlずつ添加することによって、2 mlまで反応容量をもたらします。
    注二つ全細胞生体触媒量の比は、生成物の生合成を改善するために最適化することができます。記載されているシステム、Eの比率のための大腸菌 SpNox：E.コリ HjLAD = 1：1のLキシルロース生合成（ 図1B）のために最適であることが見出されました。
  3. 30 Oは C、8時間、200rpmで反応混合物をインキュベートします。
  4. 、4°Cので遠心分離後の上清を回収し3200×gで10分間aについてndは以下の手順3で説明したように、L-キシルロース生産を定量化するために進んでください。

L-キシルロース定量化のための3比色アッセイ

  1. 吸引し1.5mlチューブにステップ2.4​​から収集した反応上清100μl。
  2. エタノールに溶解し、1.5％のシステインを50μl、70％硫酸を900μlの、および0.1％のカルバゾールの50μlを添加し、チューブを3回転倒混和します。
  3. 37 O C、20分間200rpmで反応混合物をインキュベートします。
  4. 分光光度計を用いて560nm（560）で反応混合物の吸光度を測定します。
    1. A 560読み取り値が1を超える場合、反応混合物を希釈します。

アルギン酸カルシウムビーズにおける組換え全細胞触媒の4固定化

  1. 100mlの蒸留水に4gのアルギン酸ナトリウムを溶解します。 Sを加えることによりアルギン酸塩溶液を調製します塊の形成を回避するために水に憎悪アルギン酸。必要に応じて、混合液を加熱しました。
  2. 5.0 gDCW / L Eの600μLを追加大腸菌 HjLADおよび5.0 gDCW / L E.600μlの1.2ミリリットルの4％アルギン酸塩で大腸菌 SpNoxは、ステップ4.1で調製し、気泡の形成を避けるために、穏やかなピペッティングにより細胞およびアルギン酸塩を混ぜます。
  3. 連続的に攪拌しながら100ミリリットルのビーカー中（のCaCl 2）溶液を注射針を用いて注射器にアルギン酸/細胞懸濁液を吸引し、0.3 M塩化カルシウムに滴下混合物を追加します。
    注：アルギン酸塩の液滴が完全に水没するためのアルギン酸ビーズ形成のために使用される塩化カルシウム溶液の量が十分でなければなりません。また、注射針および塩化カルシウム溶液の表面との間の距離が均一に球状のビーズの形成を確実にするために最適な範囲内に維持されなければなりません。最適な距離範囲は、実験を決定することができます同盟国とは、針の内径に依存します。推定として、〜15±5cmの距離0.6 cmの（内径）注射針のために最適であることが見出されました。
  4. 架橋およびゲルビーズの形成を可能にするために撹拌することなく室温で3時間- 2のためのCaCl 2溶液中のビーズを残します。
  5. 慎重に50ミリリットルコニカルチューブに塩化カルシウム溶液を注ぐことにより、ビーズを乱すことなくのCaCl 2溶液をデカントし、そして別の50mlコニカルチューブに塩化カルシウム溶液中に残っているビーズを転送します。
  6. 過剰のCaCl 2および非カプセル化細胞を除去するために3回の緩衝液を50mMトリス-HCl（pH8.0）10mlでビーズを洗浄します。
    注意： 任意のステップで、それらを破裂するようにすることなどのビーズを遠心分離しません。 5分 - 溶液からビーズを分離するために、サスペンションは3静置することができます。ビーズを底部に沈降し、洗浄緩衝液をデカントすることができ別の容器に。
    1. 使用する洗浄緩衝液を廃棄しないでください。ステップ4.5から収集した使用済みのCaCl 2溶液で使用トリス塩酸洗浄緩衝液（30ミリリットル）をプールします。
  7. 非固定化されたE.ペレットプールされたのCaCl 2およびトリス塩酸溶液を遠心分離により大腸菌細胞を20分間3200×gでステップ4.6から収集しました。ステップ2.1で説明したように固定化効率を決定するために、gDCW / Lでペレット化し、非カプセル化された細胞の密度を計算します。
  8. チューブにステップ4.6から洗浄したビーズを転送します。手順2.2に従ってください - 3.4を細胞ペレットの代わりに、洗浄したビーズの全てを用いたL-キシルロース生合成を評価します。

L-キシルロース生産のための固定化生体触媒の5安定性アッセイ

  1. ステップ4.8からビーズを収集し、（ステップ4.6で説明したように）遠心分離することなく、50mMのトリス-HCl（pH8.0）緩衝液10mlで二回洗浄します。
  2. すべての使用3.4 - 工程2.2に記載のように洗浄したビーズの反応を実行します。
  3. 生産サイクルの所望の数の5.2と各サイクルにおける反応上清中に産生さL-キシルロースの量を測定する - 繰り返して、5.1を繰り返します。

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結果

補因子再生を有効にするには、L-キシルロース合成はE.を含む結合された全細胞生体触媒システムで行いました大腸菌 HjLADとE.コリ SpNox細胞 。様々なパラメータの最適化に続いて、このシステムの再利用は、アルギン酸カルシウムビーズ（ 図2）の中に固定化することにより改善されました。

カップリング E. によって補因子再生を伴うL-キシルロース生産 大腸菌 HjLAD と E.コリ<...

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ディスカッション

最近の技術の進歩は、バイオテクノロジー産業における市場価値の緩やかな上昇をもたらし、組換え生物学的治療薬の商業化の急増を有効にしています。そのような進歩は、スケーラブルな産業システム38の確立に大きな期待を示している組換え微生物中で代謝工学の出現です。ほとんどのプロセスと同様に、遺伝子操作された微生物により産生された組換え生体分子の成功した商業化には ​​、システム39の製造歩留まりに大きく依存します。これは、生体触媒酵素の定方向進化は、生体触媒活性の3を改善するために実施されている「ブルートフォース」遺伝学39、の急速な発展につながっています。しかしながら、このような酸化還元経路のような特定の代謝経路のために、単なる生体触媒の改善はOTHの有意な効果により生産の経済化に影響を与えることは十分ではありません高価な補因子などの必須の反応要件、えー。このようなシステムのスケールアップは、さらに改善された生体触媒を用いて、唯一の製造コストを増大させるために役立ちます。このように、追加の戦略的な方法は、補因子の化学量論比を含む生物反応の実用化のために必要とさ...

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開示事項

著者には、競合する金融利益を宣言しません。論文は、アルギン酸ビーズに固定化された結合された全細胞生体触媒システムを生成するための詳細な方法論を報告することを目指しています。科学的なノベルティは以前の研究16に報告されています。

謝辞

本研究は、文部科学省、科学技術（NRF-2013R1A1A2012159とNRF-2013R1A1A2007561）、建国大学、化学工学やMCubed省によって資金を供給、韓国の国立研究財団（NRF）を介して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていましたミシガン大学のプログラム。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LBブロス シグマ アルドリッチL3022-6X1KG
カナマイシンフィッシャーBP906-5
イソプロピル &β;-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)シグマ アルドリッチI6758-10G
トリスベースフィッシャーBP1521
B-ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド水和物シグマ アルドリッチN7004-1G
L-アラビニトールシグマ アルドリッチA3506-10G
L-システインシグマアルドリッチ168149
硫酸シグマアルドリッチ320501-500ML
カルバゾールシグマアルドリッチC5132
エタノール フィッシャーBP2818-4
ギン酸ナトリウムシグマAldrichW201502
塩化カルシウム二水和物シグマAldrich223506-500G
エクセラE24シェーカーインキュベーターニューブランズウィックサイエンティフィック
ケアリー60UV-Vis分光光度計アジレントテクノロジー
遠心分離機5810Rエッペンドロフ
ビーカーフィッシャー
リンジフィッシャー
ドルフィッシャー
分析および精密計量天秤オーハウス
アルシニーパイオニア

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