補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

サマリー

提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。

要約

我々は最近改善された生産収量と持続的な合成のための補因子再生と生体触媒の固定化の機能を備えた、シンプルな再利用可能と連結された全細胞生体触媒システムを開発しました。本明細書に記載さ2 E.から成るこのようなシステムの開発のための実験手順であります機能的に相補的な酵素を発現する大腸菌株 。一緒に、これらの二つの酵素はバイオ反応の生成物の収率を改善するため、高価な補因子の再生を仲介する協同機能することができます。また、アルギン酸カルシウムビーズ中の全細胞のカプセル化によって結合された生体触媒システムの固定化形態を合成する方法が報告されています。一例として、我々は、Eが結合することによって、L-アラビニトールからLキシルロースの改良された生合成を提示します大腸菌細胞が酵素のL-アラビニトール脱水素酵素やNADHオキシダーゼを発現しています。最適条件下で、150の初期濃度を用いmMのL-アラビニトール、最大Lキシルロース収率は、文献に報告されたものよりも高い96％に達しました。結合した全細胞生体触媒の固定化された形態は、遊離細胞系がほぼ完全に触媒活性を失っている間、連続した再使用の7サイクル後の最初のサイクルで得られた収率の65％を維持し、良好な動作安定性を示しました。したがって、ここで報告された方法は、L-キシルロースの工業生産だけでなく、一般的には補因子の使用を必要とする他の付加価値化合物の改善に役立つ可能性が2つの戦略を提供します。

概要

^{3 -}微生物を使用する還元全細胞生体内変化は、商業的および治療 ​​的に重要な生体分子¹の化学酵素合成のための普及した方法となっています。 ^{7 -}それは孤立した酵素の使用に比べていくつかの利点、特にコストのかかる下流の精製工程の排除と長寿命⁴のデモを提示します。補因子は、生成物の形成に必要とされる生体触媒の経路のために、全細胞系は、安価な電子供与共基質^5,8,9の添加によってその場での補因子再生に提供する可能性を有します。 ^{13 -}しかし、この容量が希少または高価な補基質¹⁰の化学量論的濃度を必要とする反応のために減少します。一緒に細胞全体の貧しい再利用して、これはスケーラブルで連続のproduの確立を妨げますctionシステム。これらの補因子依存性生物変換のための全細胞システムの戦略的な改変は、前述の制限を克服するために必要とされます。具体的には、協働して動作する全細胞生体触媒の組み合わせは、有意に保有酵素¹⁴の生産性及び安定性を高めることが示されています。多くの場合、商業的に実行可能な製品の大量生産を可能にするために重要であり、これらの因子は、共固定化生体触媒微生物¹⁵によってさらに最適化することができます。我々は最近、L-キシル....

プロトコル

1.全細胞生体触媒の調製

注：組換えE. pET28a- SpNox ³¹またはpET28a- HjLAD ^28を保有^する 大腸菌細胞を、以下、Eと呼ばれています大腸菌_SpNoxとE.大腸菌_HjLAD、それぞれ。

1. E.の単一コロニーを接種しますルリア-ベルターニ（LB）培地3ml中の大腸菌 _HjLADはカナマイシン（50μg/ ml）を補充し^{、37°C ​​の} 、250rpmでインキュベーターシェーカーO / Nでインキュベートします。
2. 50μg/ mlのカナマイシンを含有する新鮮なLB 200ml中に100とOD _600が 〜0.6に達するまで37 ^O C、250rpmでインキュベートする：1により培養を希釈します。
3. 培地に0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することによりHjLADタンパク質発現を誘導し、16 ^O C、16時間、180rpmでインキュベートします。
   1. また^、25°Cの 、20....

結果

補因子再生を有効にするには、L-キシルロース合成はE.を含む結合された全細胞生体触媒システムで行いました大腸菌 _HjLADとE.コリ _SpNox細胞 。様々なパラメータの最適化に続いて、このシステムの再利用は、アルギン酸カルシウムビーズ（ 図2）の中に固定化することにより改善されました。

カップリング E. によって補因子再生を伴うL-キシルロース生産 大腸菌 _HjLAD と E.コリ<.......

ディスカッション

最近の技術の進歩は、バイオテクノロジー産業における市場価値の緩やかな上昇をもたらし、組換え生物学的治療薬の商業化の急増を有効にしています。そのような進歩は、スケーラブルな産業システム^38の確立に大きな期待を示している組換え微生物中で代謝工学の出現です。ほとんどのプロセスと同様に、遺伝子操作された微生物により産生された組換え生体分子の成功した商業化には ​​、システム³⁹の製造歩留まりに大きく依存します。これは、生体触媒酵素の定方向進化は、生体触媒活性の^3を改善するために実施されている「ブルートフォース」遺伝学^39、の急速な発展につながっています。しかしながら、このような酸化還元経路のような特定の代謝経路のために、単なる生体触媒の改善はOTHの有意な効果により生産の経済化に影響を与えることは十分ではありません高価な補因子などの必須の反応要件、えー。このようなシステムのスケールアップは、さらに改善された生体触媒を用いて、唯一の製造コストを増大させるために役立ちます。このように、追加の戦略的な方法は、補因子の化学量論比を含む生物反応の実用化のために必要とさ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LBブロス	シグマ アルドリッチ	L3022-6X1KG
カナマイシン	フィッシャー	BP906-5
イソプロピル &β;-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)	シグマ アルドリッチ	I6758-10G
トリスベース	フィッシャー	BP1521
B-ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド水和物	シグマ アルドリッチ	N7004-1G
L-アラビニトール	シグマ アルドリッチ	A3506-10G
L-システイン	シグマアルドリッチ	168149
硫酸	シグマアルドリッチ	320501-500ML
カルバゾール	シグマアルドリッチ	C5132
エタノール	フィ	ッシャーBP2818-4
ギン酸ナトリウム	シグマAldrich	W201502
塩化カルシウム二水和物	シグマAldrich223506-500G
エクセラE24シェーカーインキュベーターニュー	ブランズウィックサイエンティフィック
ケアリー60UV-Vis分光光度計	アジレントテクノロジー
遠心分離機5810R	エッペンドロフ
ビーカー	フィッシャー
リンジ	フィッシャー
ドル	フィッシャー
分析および精密計量天秤	オーハウス

アルシニーパイオニア