でプライマリ神経発生を評価しますアフリカツメガエル胚用いた免疫染色

サマリー

この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。

要約

Primary neurogenesisは、中枢神経系の初期レイアウトを設定する胚発生中の動的で複雑なプロセスです。この過程で、神経幹細胞の一部が分化し、新生中枢神経系内で分化した初代ニューロンの最初の集団が生じます。いくつかの脊椎動物モデル生物を用いて、神経細胞の運命指定、パターン化、分化のメカニズムを探っています。その中には、アフリカツメガエル(Xenopus)があり、その急速でアクセス可能な発達と発生学的および分子的操作の容易さにより、一次ニューロン新生に関与する分子および細胞メカニズムを調査するための強力なシステムを提供します。ここでは、Xenopus中枢神経系内の神経細胞のさまざまな集団を観察するための便利で迅速な方法を紹介します。Xenopusの胚切片に対する抗体染色と免疫蛍光法を用いて、初代神経新生における神経幹細胞と分化した初代ニューロンの位置を観察することができます。

概要

脊椎動物では、中枢神経系の開発は、いくつかの独特まだ連続した段階を含みます。最初のステップは、ナイーブ外胚葉細胞は、神経運命ではなく、表皮の運命に向かって指定されている神経誘導、です。いくつかの相互接続さ調節機構は、 アフリカツメガエルおよび他のモデル系^1,2のこの段階の間に関与しています。このプロセスは、主に、コーディン、ノギンおよびフォリスタチン^3-7として基本となる中胚葉によって産生される分泌因子によって調整されています。神経誘導した後、神経前駆細胞のサブセットは、細胞周期を終了し、一次神経新生と呼ばれるプロセスで分化し始めます。すべての神経前駆体は、この時点では区別されません。残りの神経前駆細胞は、それによって開発を通して、および成人期に中枢神経系の継続的な成長のために必要な幹細胞のプールを維持し、増殖し続けます。

これらの広報神経前駆細胞をoliferatingはSRY（性決定領域Y）-box 3（sox3）遺伝子^8-11の発現によって特徴付けられます。細胞の他の集団、出口細胞周期および分化した運命にコミットするには、分化の遺伝子マーカー、 チューブリン、ベータ2BクラスのIIb（tubb2b、N- 浴槽 ）とミエリン転写因子1（MYT1）の発現により同定されます^12-14。このような分化した神経細胞は、最終的には神経管^15-17内の異なる領域に位置し、モーター、間、および感覚ニューロンを含むがこれらに限定され、ではないが、ニューロンの異なるカテゴリを生じます。

かなりの努力が前方神経外胚葉でイベントを決定するパターニングと運命を支配する調節機構を解明することに専念してきたが、あまり注目は、以下の発生神経性のイベントを調査してなされたものです初期のパターニング段階。実際に、シグナル伝達、転写の規制だけでなく、翻訳後修飾は、すべての神経新生^18-20中の両方のタイミングおよび系統仕様を制御し、この後の段階に関与しています。これらのメカニズムへのさらなる調査が簡単に視覚化し、神経細胞の異なる集団を区別するために信頼性の高い方法を必要とします。 、Sox3、MYT1、及びN-タブを含む上記神経マーカーは、従って、神経分化^21-23の基礎となるメカニズムを明らかにするために必要な基礎を提供し、これらの異なる細胞集団を同定するための手段を提供することができます。

神経細胞集団の特異的標識は、他のモデル生物で実証されているが、比較的少数の研究は、この点において最大限にアフリカツメガエル系を利用しています。これは主に、確実に、様々なneurを識別互換性のある抗体の不足に起因しています神経管でonal細胞集団。ここでは、 アフリカツメガエルにおける一次神経発生を調査するための堅牢かつ便利な手法を提供する免疫染色を介して初期のアフリカツメガエル胚で神経分化を可視化する方法について説明します。このプロトコルは、ステージ26とステージ45との間にアフリカツメガエルの中枢神経系の早期開発に興味を持って研究者のための十分な指針を与える必要があります。

プロトコル

全ての動物実験は、マンチェスター動物福祉センターの大学から承認されたと英国内務省プロジェクトライセンスによって覆われていました。

1.収集と固定アフリカツメガエル胚の

1. 実験のための試薬および材料を準備します。
   1. 約800mlの超純水にNaClを56.5グラムに溶解し、1 MのKClのストック溶液を添加することによって10倍マークの改変リンゲル（MMR）を調製、1MのMgSO _4、1MのCaCl _2、1 M HEPES pH7.4の最終濃度を達成します20mMのKCl、10mMのMgSO ₄を、20mMのCaCl ₂を、50mMのHEPESの。 10 MのNaOHにより7.4にpHを調整した後、1 L.への最終的な音量を調整
   2. 液体サイクルで20分間121℃でオートクレーブすることにより、10倍MMR液を滅菌します。使用時には、0.1×最終濃度までのddH ₂ Oで希釈し、微生物の増殖を阻害するために20mg / Lのゲンタマイシンを追加します。
   3. 24 gでトリス-HCl 5.6 gでのTris-Bを混合して10倍TBS溶液を作っASE、88グラムのNaClとで約900ミリリットルの超純水を溶解します。最終溶液は、7.6付近のpH値を持つことになります。 1 Lに7.6の最終pH及び最終容量を達成するために、10 M NaOHまたは濃塩酸のいずれかで調整
   4. 使用する際に、超純水9部と10倍のTBS溶液の1部を希釈することにより、1×TBSを作ります。
   5. 10 mMの_4の硫酸マグネシウム、約800mlの超純水に2,092グラムのMOPSを溶解し、20mMのEGTAの最終濃度を達成するように0.5 M EGTA及び1MのMgSO ₄のストック溶液を添加することによって10倍MEM塩を作ります。 10 MのNaOHにより7.4にpHを調整した後、1 L.への最終的な音量を調整
   6. それはオートクレーブ処理された後、溶液を室温での保存の数ヶ月青色から黄色に変化したりすることができる（液体サイクルで20分間121℃でオートクレーブ処理によってMEM塩溶液を滅菌するが、色の変化は、その使用には影響しません。 ）。しかし、長期貯蔵（6ヶ月以上）した後の溶液を使用しないでください。
   7. 1×MEMを作りますMEM塩1部、（少なくとも1~2週間4℃で安定したV / V）超純水8部、37％ホルムアルデヒドの1部を希釈することにより、FA溶液。
   8. 60℃に1×TBS溶液熱の100ミリリットル溶液にパラホルムアルデヒド粉末の4グラムを溶解することによって（ファロイジンを含むその後の染色用）TBS中4％パラホルムアルデヒドを準備し、溶解を助けるために10 M NaOHを数滴を追加します。 5〜10ミリリットルの体積のアリコートと-20℃で凍結します。再凍結しないでください一度解凍しました。
      注意：パラホルムアルデヒド粉末は刺激性であり、したがって、計量工程が、ドラフト内で実行する必要があり、吸入すると有毒です。
   9. コレクションをサンプリングする前にスクリューキャップと同様に多くの4ミリリットルガラスバイアルにラベルを付けます。
   10. 50 ml遠心チューブに（50℃の水槽で予備加熱）、40％の魚ゼラチンを20mlを注いで、15％ゼラチン/ 15％のスクロースを準備します。ショ糖の8グラムを追加し、1×TBSで50ミリリットルラインにチューブを埋めます。
   11. ロータリーミキサーやローリングベッドの上にゼラチンチューブを配置室温で一晩混合します。このゼラチン溶液を1週間4℃で安定です。期限切れのソリューションを使用しないでください。また、凍結融解をしないでください。
2. 準備し、Xを修正しました。 ツメガエルまたはX.理想のステージへトロピカ胚培養。
   1. 文化受精X.ツメガエルまたはX.希望の段階までゲンタマイシンと0.1×MMRでトロピカ胚 。
      注：一般的に、ステージ40の後のステージ23および胚の40以降のコレクションの間の胚を収集するには、脊髄から軸索成長を観察するが、追加のゼラチン浸透時間が必要なことを心に留めておく場合は特に、可能です。胚は、阻害剤で処理された、野生型、トランスジェニック、突然変異体であってもよいし、モルホリノ（MO）は-injected、または^23,24を電気穿孔しました。
   2. 各4ミリリットルのガラスバイアルに20-50胚を収集し、できるだけ多くの媒体を除去し、MEMFAと交換してください。
      注：その後の染色はファロイジンが含まれている場合、4％パラホルムアルデヒドを使用します代わりMEMFAの商業供給さホルムアルデヒド溶液は、通常、ファロイジン染色を妨害する安定剤として最大10％のメタノールを含有するからです。
   3. 室温での緊急性、であればロータリーミキサー上で2時間、4℃で一晩固定してくださいまたは。胚を、4℃で少なくとも1週間固定液中で安定です。
   4. 固定後、0.05％トリトンX-100で1×TBSを用いて20分間胚を3回洗浄します。最終洗浄後、できるだけ多くのTBS-トリトンを削除し、各バイアルに15％ゼラチン/ 15％スクロースの3ミリリットルを追加します。
   5. 室温で一晩床ローラーにバイアルを置きます。ステージ40よりも古い胚のために、浸透時間の少なくとも24時間を使用します。浸透した後、次の日のセクション2.2にすぐに進んでください。

2.マウントとアフリカツメガエル胚の凍結切片化

1. 実験のための試薬および材料を準備します。
   1. 積極料の1箱を取りますスライドを編、理想的に未開封。
      注：開いた場合、（ドライボックスなど）乾燥状態でスライドを維持し、スライド上の静電荷が維持されていることを確認するには、1カ月以内に使用します。サンプルは免疫染色の間に落ちるので、期限切れのスライドを使用しないでください。
   2. -30℃にクライオスタット室を事前に冷やします。ミクロトーム用の-35℃と12μmの切片厚などの機器パラメータを設定します。ステージ上に厚いカバーガラスをインストールし、クライオスタットは、セクションの開始前に少なくとも30分間平衡化させます。
   3. セクションストリップを移動させるための塗装ブラシを準備し、クライオスタットチャンバ内に保ちます。
   4. スライド上に書き込むために鉛筆を準備し、室温でそれらを置きます。
   5. 凍結切片中に手袋を着用してください。素手を使用しないでください。
2. アフリカツメガエル胚をマウントします
   1. 慎重に気泡を導入することなく、プラスチックやガラスピペットを用いてガラスバイアルから5-10胚を吸引します。で胚を転送装着室へとステレオスコープの下で観察します。セクションブロックの剛性を確保するために、ゼラチン溶液との装着室を埋めます。
   2. 先の細いピンセットを用いて、 図1の通りに胚を配置します。極低温互換のマーカーを用いてチャンバの縁にある矢印を描くことで、ヘッドの向きをマークします。胚の複数のグループの場合、同様に対応するチャンバの縁に各グループの説明を書き留めます。
   3. 慎重にドライアイスで半分満たされたフォームボックスに水平室を配置し、蓋を閉じます。 5-10分で装着室の凍結を観察します。このようなプロセス直列室（ すなわち 、次の1に進む前に、ドライアイスの上に以前の室を配置）過密になるためにドライアイスボックスを凍結し、防止するために、各チャンバーのための十分な時間を残します。
      注：冷凍取り付け室が水平に立つ必要はありませんし、ボックス内に積み重ねることができます。
   4. 凍結切片を続行、または、必要に応じて、免疫原性を失うことなく、少なくとも1-2週間-80℃で凍結したサンプルを保ちます。
3. マウントされたアフリカツメガエル胚の凍結切片
   1. （鉛筆など）鈍いスティックを使用して、チャンバの底部を押すことにより、チャンバから凍結試料ブロックを削除します。
   2. 試料保持ディスクに組織凍結培地を数滴、（ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールを含有する培地）を追加し、胚の前端とサンプルブロックを取り付ける（ 図2）に上向き。 mounted-ブロックは約1分間、または組織凍結培地が不透明になるまで、クライオスタットチャンバ内に立​​つことができます。
   3. すぐに直面しているサンプルブロックの下側にミクロトームに試料保持ディスクをインストールします。サンプルブロックは、まだ比較的「ソフト」である場合、各区間の長さを減少させるために、ブレードを用いてサンプルブロックの部分を切り落とします（希望の場合）。その温度が平衡状態に到達できるようにするには、少なくとも5分間ミクロトーム上の試料保持ディスクのままにしておきます。
   4. オタマジャクシの頭が半透明ゼラチンを通して見えるようになるまで徐々にダウンサンプルブロックをトリミング。サンプルブロックは、サンプル保持ディスクから脱落することができるので（例えば、「トリム」オプションを有効にするように）この段階では切片厚（ 例えば 20〜25μM）の高い（厚い）の設定を適用し、速度をトリミング増加ではなく、厚すぎるために、 。後続のセクションの長い帯状の生成を確実にするために、この段階で、このような刃の鋭さと角度として、クライオスタットの性能を確認します。
   5. オタマジャクシの頭が見えるようになるしたら、ペイントブラシを使用して、ミクロトームとステージの両方正常に戻って（ 例えば 10から12μM）をクライオスタットの設定を調整し、きれい。静かに完成したスライスはSTRを形成することができることを確認する（電動式設定を使用しないでください）​​ハンドホイールの設定を使用して、トライアルとして2-3のセクションを作りますIPSは、重複またはブレードに付着していません。
   6. オタマジャクシの頭がほぼ露出するまで（これはいくつかの経験が、達成可能が必要な場合があります）トリミング続けます。ステージ上の任意の残余セクションをはねのけるとサンプルセクションのコレクションが開始されます。
   7. 約10〜15のセクションを作成し、それらが長いストリップを形成してみましょう。
   8. 側に厚いカバーガラス板を裏返し、静かに先の細いペイントブラシを使用してブレードからストリップを取り外し、ブレードへの長軸に平行でステージ上に配置します。
   9. 室温で1正に荷電したスライドを選び、（その後の染色処理中に洗い流されることはありません）鉛筆でラベルを付け、プレス、それはすぐにしっかりとストリップ上にラベル面を下に向けてクライオスタットチャンバからスライドを削除します。正しく行わ場合は、ストリップはすぐに正に荷電したスライド（ 図3A）に固執する必要があります。
   10. 各スライドさせる上で20〜30スライスを持っているために、この手順を繰り返しeと平行（ 図3B）に配置されています。これは、Xの全脳領域をカバーするのに十分ですトロピカリス胚およびXの前脳の大部分と中脳の領域胚をアフリカツメガエル 。
   11. すぐに続行するか、免疫原性を失うことなく、少なくとも3〜6ヶ月間、-80℃でスライドボックスでスライドを保存し、10分間、スライドを空気乾燥します。

セクション化されたアフリカツメガエル胚の3免疫染色

1. 実験のための試薬および材料を準備します。
   1. 0.05％の最終濃度を達成するために、1×TBS中にトリトンX-100を添加することによって0.05​​％TBS-トリトンX-100を調製します。このソリューションは、3〜4日間室温で安定しています。期限切れのソリューションを使用しないでください。
   2. 5％の熱不活性化ヤギ血清またはTBST中の5％BSAをブロッキング緩衝液として準備します。まず、30〜60分間65℃の水浴中で血清の約20-30 mlで配置することによって、ヤギ/子羊血清を熱不活性化します。 1.5ミリリットル遠心機へのアリコートチューブおよび-20℃で凍結。いいえ再不活性化は、使用する際に必要とされません。
   3. 使用前に、5％の最終濃度を達成するために、TBST中で熱不活性化血清またはBSAを希釈します。
   4. ブロッキング緩衝液中に希釈液に応じて適切な一次抗体を準備する（ 例えば、1：500抗Sox3 ^10,25 / 1：250抗MYT1 ²⁶ /抗アセチル化チューブリン）。各スライド上に抗体溶液の約100μlのを使用してください。
   5. バッファー（：500通常1）をブロックに適切な蛍光抗体（ 例えば抗マウス/ウサギ赤色蛍光色素標識抗体）を準備します。
   6. アクチンネットワークを明らかにするために、二次抗体ミックスに：（オプション）赤色蛍光色素共役ファロイジン（500 1）を追加します。
   7. （オプション）核局在化を可視化するために、二次抗体ミックスにDAPI（0.5 / mlの最終濃度）を追加します。
   8. 冷凍庫から抗フェードマウンティング培地を取り、室温の水浴中で解凍します。
2. 免疫染色
   1. で85〜90℃のヒートブロック上で乾燥させたスライドを焼く、その後、-80℃から冷凍スライドを削除し、任意の凝縮水滴を除去するために、少なくとも1時間、換気フードの内側にタオル一枚の紙の上に置きます接着機構を活性化する15分間上向きスライス。最後に、スライドを、室温まで（少なくとも10分間）冷却を可能にします。
   2. 純粋なアセトンで染色ジャーを記入し、魚ゼラチンを除去するために、10分間アセトン中でスライドをインキュベートします。複数のスライドを治療する場合、染色ラック上に配置します。換気フード内で15分間処理し、スライドを風乾し。しないでくださいアセトンを再使用します。
   3. 慎重にサンプルを触れることなく、PAPのペンを使用して、スライド上のサンプルの周りにリングを描きます。そうしないと抗体溶液は、染色中に流出する、リングが自己囲まれていることを確認してください。完全PAPペンリングを乾燥させます。
   4. トリトンX-100なしで1×TBSで別の染色ジャーを記入してください。 Inser染色ジャーに乾燥させ、スライドをTと少なくとも1時間再水和を可能にします。一方、0.05％トリトンX-100で1×TBSを用いて5％の最終濃度になるように熱不活性化ヤギ血清またはBSAのいずれかを希釈することによりブロッキングバッファを準備します。
   5. クリックロック食品ボックス内1-2 6ウェルプレートを配置することによって、ウェットボックスを作成し、超純水で途中井戸を埋めます。染色ジャーから再水和したスライドを削除し、（プレート蓋なし）6ウェルプレート上に水平に置きます。
   6. 慎重PAPリングの内側にブロッキング緩衝液の300から600μlを添加します。位置に蓋をロックすることにより、ウェットボックスを密封し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。
   7. ブロッキング緩衝液中で、適切な一次抗体を希釈します。一般的に、スライド当たり100から150μlの希釈した抗体溶液を使用します。複数のスライドが処理される場合は、比例ボリュームをスケールアップ。
   8. ブロッキングの後、慎重に吸引によりスライドからのブロッキング緩衝液を除去し、迅速にPを追加ドライアウトを防止するためrimary抗体溶液は、ウェット箱を密封し、4℃で一晩インキュベートします。
   9. 翌日、吸引によってスライドから一次抗体溶液を除去します。 0.05％トリトンX-100、3回、15分ごとに1×TBSで満たされた染色ジャーに挿入することにより、スライドを洗浄します。一方、（またはDAPIまたはファロイジンなし）をブロッキング緩衝液で適切な蛍光二次抗体を希釈します。
   10. 慎重にスライド上に二次抗体溶液の100から150μlを添加します。湿ったボックス内にスライドを置き、蓋を密封します。室温で1〜2時間のスライドをインキュベートします。
   11. 0.05％トリトンX-100、3回、15分ごとに1×TBSで満たされた染色ジャーにスライドを洗浄します。 -20℃で保存した場合、最終洗浄で、10分間50℃の水浴中でアンチフェードマウント培地を解凍。使用前に室温に封入剤をクールダウン。
   12. 上に封入剤の約20μlの（1滴）を追加スライドとは、サンプルを超える大規模なカバースリップ（少なくとも22ミリメートル×64ミリメートル）を適用します。 6時間後マウント内に蛍光または共焦点顕微鏡を用いて観察します。
       1. イメージングは​​同じ日に行うことができない場合は、マニキュアを使用してスライドをシールし、4℃で一晩湿ったボックス内に置きます。
          注：アンチフェードマウント媒体が徐々に数日後に酸化（茶色がかっターン）ので、できるだけ早く画像を撮影することが推奨されてしまいます。

結果

代表的な結果は、異なる抗体（ 図4）で染色し、異なるレベル、すなわち前脳、中脳、後脳、脊髄、でステージ30 アフリカツメガエル胚の断面を示しています。前述したように、分化した初代神経細胞が外側に移動して、神経管の限界層（基底層）の近くに見つけMYT1標識ながら、神経前駆細胞集団は、神経管の内腔の近くに位置しSox3標識。抗アセチル - チューブリンは、全体の神経管の中に観察することができる分化したニューロンにおける軸索を、ラベルを付けます。

側特異的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現は、特定の遺伝子の発現を調節する神経細胞の成長および分化を妨害するかどうかを評価するための神経生物学で広く使用される方法です。このような場合には、モルホリノ（MOS）またはDNA構築物（単数または複数）のいずれかのプロ搬送します moter駆動型遺伝子は、2細胞期²³における2つの割球の中に注入されます。あるいは、それらは、ノックダウンまたは過剰発現所望の遺伝子（単数または複数^）27の結果となる電気穿孔に続く脳室に注入することができます。どちらの場合も、効果は、未処理の内部コントロールとして、胚の反対側を作り、胚の片側に制限さ​​れます。

固定、切片、および免疫染色した後、遺伝子ノックダウン/過剰発現の影響をカウントし、胚の両側に異なる集団の細胞数を比較することによって定量化されます。いくつかの胚からこれらのデータを蓄積し、統計分析を行うことができます。当社の代表的な結果では、何の摂動は、胚では行いませんでした。遺伝子摂動と異なる神経細胞集団に対する効果の例は、参考文献^20,23に記載されています。

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図1：セクションの金型における胚の配置及び向き （A）取り付けアセンブリを示す漫画の描写は、トレイは、日付、ステージ、および胚の向きで標識されています注意してください。 （B）取り付けアセンブリの自然な外観を示すイメージ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：サンプルの保持ディスク上のゼラチンブロックの向きや位置 （A）節ブロックアセンブリを示す漫画の描写、胚は「ヘッドアップ」位置とゼラチンブロックがしっかりと固定されているOであることに注意してください。ベースで組織凍結培地による試料保持ディスクNTO（図2B参照）。 （B）節ブロックアセンブリの自然な外観を示す画像は、ゼラチンブロックと試料保持ディスクとの間の組織凍結培地の蓄積に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：セクション室の連続切片 （A）のモデル。サンプル保持ディスクは、胚側が上を向いている位置に回転し、固定してください。数（6-10）のセクションの後、連続するセクションのタイルの長いストリップを穏やかに細かいブラシを使用してブレード（青）から分離され、その後、保持板上に90°回転しました。その後、室内温度正に帯電したスライドですしっかりと下に向けセクションストリップに押し付け、すぐに集め、完成ストリップまで上昇。 （b）に示すように、通常は、各スライドは、ストリップの2本の平行線を収容することができます。鉛筆を使用して、スライドラベルに詳細な記録を作成することを忘れないでください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：ステージ30 X のクロスセクション 神経組織、20Xにオタマジャクシと染色を ツメガエル 。 アフリカツメガエルのオタマジャクシのセクション平面の相対的な位置（前脳、中脳、後脳、脊髄）を示す（A）回路図。 （B）抗Sox3（赤）で染色した断面を対応する、抗アセチル化チューブリン（グリーn）とDAPI（青）、相対的な神経幹細胞プールの位置ならびに神経管内ニューロフィラメントを示します。神経管中で分化した初代ニューロンの相対的な位置を示す抗MYT1（赤）およびDAPI（青）で染色した断面を、対応する（C）。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、 アフリカツメガエル胚における一次神経新生を可視化するための便利で効率的な方法を示しています。この方法は、細胞型特異的マーカーを用いて、神経幹細胞および分化した初代ニューロンを含む神経細胞の異なる種類の評価を可能にします。

プロトコルは、再現性の非常に高いレベルで一般的に堅牢です。前孵化段階にある胚（ すなわち 、最大28のステージに）、これは胚が完全に固定する前に、真っすぐになることができますように、我々は手動で固定前に卵黄膜を除去することをお勧めします。 （孵化する前に）比較的早い段階で胚を収集する際に曲がった胚が装着室内部に所望の向きに配置することが極めて困難であるため、これは特に重要です。 MEMFAまたはPFA固定、したがって、追加の抗原回復ステップは、このプロトコルには必要ありません後に我々は、免疫原性の損失を経験していません。また、この免疫染色の手順は、in situハイブリダイゼーション発色/蛍光からのサンプルで実施することができます。このようなシナリオでは、in situハイブリダイゼーションプロトコルの間にプロテアーゼK処理工程を省略することをお勧めします。蛍光/発色基質反応の後、試料を、TBSで洗浄することができ、MEMFA / PFA固定したサンプルと同様に魚ゼラチン溶液に包埋しました。蛍光in situハイブリダイゼーションは、後免疫蛍光染色と一緒に画像化される場合、サンプルバイアルをアルミホイルでバイアルを包むことによって光から保護することができます。

いくつかのケースでは、胚は、ゼラチン浸透後過度に収縮することができます。これは、おそらくどちらかが不十分な固定または不十分なTBS-トリトン抽出によって引き起こされます。胚は4℃で少なくとも2〜3時間、好ましくは一晩PFA / MEMFAで修正されていることを確認してください。問題が解決しない場合は、1時間、3にTBS-トリトンの洗浄時間を増加させます。

クライオ切断面の間に魚ゼラチンの異なるバッチは、異なる特性を有するように寧、サンプルブロックの剛性が変化してもよいです。この問題は、部分的にミクロトームの温度を調整することによって補償することができます。より低い温度は、サンプルブロックがセクションにくっきりと困難になるしかし、過度の低温下で「硬い」のサンプルブロックになります。各切片の前に（胚なしモックサンプルブロックを使用して）いくつかの微調整や練習は、特に貴重なサンプルを上の使用前に有益であり得ます。

切片中に一般的に遭遇する問題は、時々厚のガラス板上に固執するのではなくスチールステージ上に平らに滞在する傾向が薄い部分です。これは、常に連続的な切削プロセスを中断するので、特に破壊することができます。セクション室と（特に）厚のガラス板が機械およびoに十分な寒さ、または過度の静電気されていない。このような例は、通常、二つの理由のいずれかによって引き起こされます特に乾燥した天候でperator、。前者はセクション室の温度を下げ、余分な時間（おそらく一晩）内のガラス板を残すことによって解決することができます。かつ適切クライオスタットを接地することにより、後者。金属タップまたは金属製の同様の水配管システムにクライオスタットの金属面に接続すると、静電気を放出するための代替方法することができます。各使用後、厚いガラス板は、（そのような食器用洗剤など）、非腐食性の洗剤でよく洗浄しなければならない超純水によりリンスし、純粋なエタノールを噴霧し、損傷から表面及びエッジを保護するためにタオル紙に包まれました。

プロトコルに記載された抗体は、一般的に特異的であり、我々はほとんど非特異的吸着または高いバックグラウンドシグナルが発生しません。すべき（血清中のふわふわ沈殿の形成により可視化）、ブロッキング剤としての過度の熱不活性化を熱不活性化ヤギ/子羊血清を使用している場合、ことに留意すべきですこの沈殿剤は、二次抗体に非常に魅力的であり、高いバックグラウンドのソースに貢献するかもしれないとして避けるこ​​と。

ことが可能であり、時には同時に神経細胞の異なる集団を可視化するために二重染色を行うために、所望します。このような二重染色が可能であり、一般的に以下の組み合わせで満足のいく結果が得られます。Sox3 / N-浴槽またはMYT1 / N-浴槽。しかし、Sox3およびMYT1の二重染色は、2つの抗体がウサギの起源からの両方であるという事実によって複雑になります。私たちは、おそらく二次抗体からの信号増幅の不足のために、しかし、満足な結果が観察されなかったいくつかの抗体の直接標識キットを、（低信号対雑音レベル）を試験しています。この問題を回避する1つの可能なアプローチは、以下に説明するように、 アフリカツメガエルにおけるトランスジェニック系統を上げることです。

このプロトコルの主な制限の一つは、このプロトコルは十分にディできるが、ということです神経細胞のstinguish二つの主なプールは、すなわち、Sox3を発現する神経幹細胞プール及びMYT1発現する分化した神経細胞は、分化した神経細胞の異なる亜集団を明らかにする能力を欠きます。含む、しかし、一次運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンに限定されるものではなく、そのようなサブ集団は、通常、それらの差次的に発現マーカー遺伝子^28-30によって特徴付けられます。上記のように、 アフリカツメガエル胚における抗体ベースの免疫蛍光検出方法と組み合わせてin situハイブリダイゼーション多色の開発における最近の進歩は、潜在的な調査³¹分化したニューロンのこれらのサブ集団を明らかにするためにギャップを埋めることができます。あるいは、マウスモデルで実証されているように、また、アフリカツメガエルにおいて、異なる細胞集団を区別するために細胞型特異的抗体のより包括的なセットを高めることが望ましいであろう。

それはこのメソッドへの追加として、そのような多光子顕微鏡、3D再構成、およびセグメンテーションなどの光学イメージングおよび画像解析の最近の進歩は、また、 アフリカツメガエル卵母細胞のより包括的な観測を実現するだけでなく、ために初期評価の後に適用することができる、ことを言及も価値があります特に^32,33を設定^するライブ下の初期胚、。したがって、増殖、分化、および生きた動物における神経細胞の移動を追跡するためには、初期のアフリカツメガエルにおけるこのような細胞集団の生の観察を可能にするために細胞型特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を保有一つ以上のトランスジェニック系統を確立することが望まれるであろう胚。 X.の確立tauGFPとそのアプリケーションを駆動する神経特異的βチューブリンプロモーターとツメガエルのラインが良い例^23,34を提供^してきました。脊椎動物^35-37を特徴sox3とMYT1の両方の完全なプロモーター配列と、それはshのですアフリカツメガエルのコミュニティと一次神経形成研究のより一般的なフィールドの両方に広く貢献すべきであるアフリカツメガエルにおける追加のトランスジェニック系統を確立することは比較的容易であることウルド。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゲンタマイシン	シグマ・アルドリッチ	G1397
トリスHCl	Sigma-Aldrich	T3253
Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Sigma-Aldrich	746436
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MOPS	Sigma-Aldrich	RDD003
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
37% ホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	F8775
冷水魚の皮からのゼラチン	シグマ・アルドリッチ	G7765
ショ糖	シグマ・アルドリッチ	S7903
ベースモールド 使い捨て 15 mm x 15 mm x 5 mm スインポート	VWR	EMB-200-015A
ベースモールド 使い捨て 7 mm x 7 mm x 5 mm スインポート	VWR	EMB-200-010K
スーパーフロスト プラス スライド	サーモフィッシャー	12-550-15
ティッシュ凍結培地 (OCT)	ライカ
クライオスタット	ライカ	CM3050
グローブ
ドライアイス
トリトン X-100	シグマ・アルドリッチ	X100
85-90度;C ヒートブロック
PAP ペン	Sigma-Aldrich	Z377821
アセトン、分析グレード
スライドラック
適切なサイズのクリックロックフードボックス (1-2 6 ウェルプレートを内部に保持する能力があります)
抗アセチル化チューブリン	Sigma-Aldrich	T7451
抗マウスIgG(H+L)、F(ab')2 フラグメント(Alexa Fluor® 488 Conjugate)	Cell Signaling	4408
抗ウサギIgG (H+L), F(ab')2 フラグメント(Alexa Fluor® 555 Conjugate)	Cell Signaling	4413
Alexa Fluor® 647 Phalloidin	Cell Signaling	8940
DAPI	Cell Signaling	4083
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36930