パスの長さのプロトコルを採餌キイロショウジョウバエ幼虫

サマリー

私たちは、Drosophila melanogasterの採餌経路長アッセイのための詳細なプロトコルを提供します。試験動物の調製と取り扱い、アッセイの実施方法とデータの分析方法について説明します。

要約

キイロショウジョウバエ幼虫のパス長の表現型は、行動変化に遺伝的要因と環境貢献を研究するために使用される確立された尺度です。幼虫のパス長のアッセイは、後に採餌遺伝子に結合し、採餌行動の個人差を測定するために開発されました。幼虫の経路長は、遺伝子スクリーニングのために、最小限のコストで、大規模なサンプルサイズの収集を容易に簡単に得点形質です。ここでは、最初Sokolowskiで使用される幼虫の経路長アッセイのための現在のプロトコルの詳細な説明を提供します。プロトコルは、再現性、試験動物を扱う行動分析を実行し、データを分析する方法について説明します。アッセイは、環境の供給操作前にアッセイを行うことにより、環境変化に応じて行動の可塑性を測定するために用いることができる方法の例も提供されます。最後に、適切な試験デザインだけでなく、変更することができます環境要因このような食品の品質などの幼虫の経路長、発達年齢と一日の効果が議論されています。

概要

1910年にトーマス・ハント・モーガンの研究室での白の遺伝子の発見以来、ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエ （ キイロショウジョウバエ）は 、様々な生物学的プロセスの分子および生理学的基盤の研究のためのモデルとして使用されてきました。 D.の人気ショウジョウバエは、主に遺伝的ツールのかなりの量と多様に由来する。 ショウジョウバエの小型、ハンドリングと短い世代時間の相対的な容易さはそれを遺伝学研究のための理想的なモデルをレンダリングします。同様に重要なのは、哺乳動物を含む、より複雑な生物によって発現される表現型の多くを実証するためのショウジョウバエの能力です。これは、生物とその環境との間の界面に立つような行動のような複雑な表現型が含まれています。ミバエ上のような、行動の研究では、遺伝子と環境が行動を仲介する方法の我々の理解に大きく貢献してきたように1。

D.の最初の研究の一つショウジョウバエ幼虫の行動は供給しながら幼虫²の路長を測定することにより、幼虫の採餌戦略の個人差を調査しました。経路長さは5分以内に、酵母の単一幼虫が移動した総距離として定義しました。彼らの採餌行動に変えトロントの自然集団から両方の実験室株とハエや経路長の個人差への遺伝的要素がありました。二つの幼虫の採餌モーフは、定量路長分布から説明された、彼らはローバーとシッターと呼ばれていました。シッターより食品基板上にしながら、より広い領域を横断しながらローバーズ長い路長を示します。この経路長のアッセイを用いて、デベルら ^3は chromosome- 2（24A3-24C5）上の離散位置にこれらの個々の動作の違いを基になる採餌（ための）遺伝子をマッピングしました。 D.メートル遺伝子のための elanogasterは後で^4をクローン化およびcGMP依存性プロテインキナーゼ^5、 ショウジョウバエの生理学および行動の変調器および他の生物⁶であることが明らかになりました。

ここでは、元々 Sokolowski ²で開発された幼虫の経路長アッセイのための現在のプロトコルの概要を説明します。アッセイのいくつかの側面が長年にわたって変更されていますが、デザインのコンセプトはいません。また、 ショウジョウバエの幼虫の採餌行動の個人差に遺伝的要因と環境貢献を評価するためのアッセイの可能性を説明するためのデータを提供します。幼虫の経路長アッセイは、単純、効率的、しかも強固です。一人は、4時間で容易に500幼虫までテストすることができ、その結果は再現性の高いレベルで得ることができます。 元々局在化するために開発され、それは遺伝子スクリーニング、量的形質遺伝子座のマッピングにおいて、および研究に使用することができ遺伝子ごとの環境（GXE）の相互作用の。また、そのシンプルさと再現性は、学部教育のための素晴らしいリソースにします。

プロトコル

1.幼虫の収集のためのブドウプレート及び持株ボトルを準備

1. 保持ボトルを作るために、空気供給用のフライバイアルプラグをフィットするのに十分な大きさ6オンスフライ培養ボトル、（ 図1D）の一方の側に穴をカット。
2. （寒天、グレープジュースを沸騰させることによってブドウジュース培地（1.8％寒天、45％のグレープジュース、2.5％酢酸、2.5％エタノール）の250ミリリットルを用意し、水の大部分は、70ºCまで冷却、ブドウプレートを作成するには）を冷却しながら、その後、酢酸とエタノールを追加し、水で体積に持ち出すかき混ぜます。
3. グレープジュース媒体の表面は、蓋（ 図1A）のリップ上記ドームするまで35×10ミリメートルペトリ皿の蓋を埋めるために（針なし）注射器を使用してください。
4. 4ºCで多湿や密閉容器に保管してブドウのプレートを使用するまで（最長2週間まで）。

食品プレートの調製

1. 標準的なフライ食品のレシピを準備します。
   注：トンへ10％ショ糖、1.3％寒天、0.8％酒石酸カリウムナトリウム、0.1％のリン酸一カリウム、0.05％塩化ナトリウム、0.05％塩化カルシウム、0.05％塩化マグネシウム：路長のEST飼育食品の品質の影響は、我々は、低栄養フライ食品を使用しました0.05％硫酸第二鉄、5％酵母及び水0.5％プロピオン酸;そして、高い栄養フライ食品：1.5％スクロース、1.4％寒天、3％グルコース、1.5％のコーンミール、1％の小麦胚芽、1％大豆粉、3％の糖蜜、3.5％酵母、0.5％のプロピオン酸、0.2％Tegosept 1水中の％エタノール。両方の食品についてプロピオン酸、Tegoseptとエタノールを加える前に^50°Cの解決策とクールをオートクレーブ。
2. 100×15ミリメートルペトリ皿にフライ食品の40ミリリットルを注ぎます。
3. 4ºCで多湿や密閉容器に保管して食品のプレートを使用するまで（最長2週間まで）。

3.試験板を準備します

1. 、10と58×25センチ、厚さ​​6mmの黒色プレキシグラス板を準備する1ミリメートルの深円形井戸、直径10センチ、2×5（d）に配置されました幼虫でテストするESIGN（ 図1C）。
   注：上記のプレキシグラス板の3以上が利用可能な場合に最大30幼虫は一度にテストすることができます。代替的に、幼虫は、ペトリ皿、直径10cmで試験することができます。このオプションは、はるかに面倒であり、テストされる幼虫の下の数字を可能にします。
2. プレキシグラス試験板に酵母ペーストを拡散するため、黒39×8センチ、厚さ​​6mmのプレキシグラススプレッダーを取得します。
3. 事前に底部から蓋を分離することにより幼虫路長を記録するために100×15ミリメートルペトリ皿の蓋を準備します。

4.親の集団を設定します

1. アッセイ全体を通じて一定の飼育条件を保つ（ 例えば 、25ºC、湿度60％と12：12光：標準フライ食品に暗サイクル）。
2. 同じ飼育条件に親の人口を上げます。
3. 150人の女性と50 - - 100集める75人の男性を、最適な産卵のために5±1日のためにそれらを熟成。
4. Fを許可しますemalesと男性は、標準的なフライ食品と6オンスフライ培養瓶中で一晩交尾します。
5. マスキングテープ（ 図1E）との上部に、転送が保持瓶にハエやブドウのプレート（ 図1B産卵を促進するブドウプレート上の新鮮な酵母ペーストを少量。）を確保します。
6. 大人はブドウ板に卵を産むことができるように下部にあるブドウプレートで、上下逆さま（ 図1F）に立ってボトルを残します。
7. 24時間後に最初のブドウのプレートを捨て、保持ボトルに新しいブドウプレートを配置します。これは、幼虫が翌日に収集されるから、ブドウのプレートになります。
   注意：グレーププレートは、セットアップ彼らは早期に次の日をクリアすることができるようにプレートを設定された後に幼虫22時間でクリアする必要があります（。 例えば 、12 pmにプレートを設置し、10で明確には翌日午前）。女性が源泉徴収し、股関節された可能性がある卵を避けるために、最初のブドウのプレートを破棄することをお勧めしますtは開発が進んでいる可能性があります。

5.ブドウプレートからL1（第一齢）幼虫を収集

1. 60×15ミリメートルペトリ皿に彼らが設定した22時間後にボトルや場所からブドウのプレートを取り外します。
2. 保持ボトルに新鮮な酵母ペーストで新しいブドウのプレートを置きます。
3. クリアと解剖プローブを使用して、シードされたブドウのプレートからすべての幼虫を捨てます。
4. インキュベートは、標準的な条件で4時間、ブドウのプレートをクリア。
5. 4時間後、ブドウプレートから1株あたり100 L1幼虫を選択し、食品のプレート上に配置します。
   1. （食品を穿孔し、幼虫を埋めずに）優しく食品に幼虫を置き、食品プレート全体に幼虫を分散することにより、混雑を避けます。
6. 試験動物は、放浪の開始前に約10時間になるまで、食品のプレートをインキュベートします。
   注： - 孵化後96時間25ºCでは、一般的にさまよう10時間前に72に相当します。 exacインキュベーション時間のトン量は各菌株のための幼虫の初期セットを収集し、放浪の開始までの時間数を記録することによって、実験を開始する前に決定されるべきである（放浪幼虫は、食品の側面と蓋の上に食べ物の外に移動しますプレート）。
   注：必要であれば、同じ親は3幼虫収集するために使用することができる - 5.5手順4.7を繰り返すことによって、テストの4日。株は、パスの長さに対する試験順序効果を避けるために日を横切って設定され、テストされる順序を変更します。同じ「コントロール」株をテスト/日の影響を制御するために、試験のそれぞれの日は、株。
7. 多くの株を試験している場合は、後で適切な時点で各系統のテストを可能にするために、幼虫の設定および収集時間をずらします。

6.幼虫パスの長さのテスト

1. 2の比率（重量対容量）：1で水にドライアクティブパン酵母を溶かします。完成した酵母ペーストは、PAより薄くすべきですncakeのバッターは、ペーストのうちスプーンを持ち上げるような方法で、それが滴下し、すぐに溶けたペーストの表面にリボンを残します。
   注：酵母ペーストの一貫性が重要であり、実験を通して一定でなければなりません。正確な酵母：水の比は、ブランドと酵母のバッチに応じて調整することが必要になる場合があります。
2. 静かにペイントブラシを使用して、食品のプレートからテストされる最初の株の幼虫を選びます。
3. ペトリ皿に幼虫を収集し、静かにすべての食品を除去するために水で洗ってください。
   1. すばやく1で幼虫を洗う - 実験室で2 mlの水と穏やかDAB幼虫の乾燥試験板上に幼虫を配置する際に任意の水を移送避けるために拭いてください。ストレスを避けるために、湿ったが、水に沈めていない幼虫を保ちます。
4. 側の3つのテストプレート側に配置し、各試験板のための5分のタイマーをセットします。
5. 試験板の上部に酵母ペーストを適用し、スプレッダーを使用して、薄層に広げ各試験板上の酵母ペーストのERすべてのウェルは、酵母の均一な層を持つように。
6. 静か各プレート上の最初の幼虫を配置した後、5分タイマーを開始し、各ウェルの中央に1幼虫を置きます。注：三プレートは500幼虫の合計まで、30 /歪み/試験日のサンプルサイズを得、一度に行うことができます。
7. 各ウェルの上にシャーレのふたを置きます。
8. タイマーが切れると、プレートから幼虫を除去することなく、恒久的なマーカーを用いて、酵母に残さ路長のトレースを開始。幼虫と同じ順序でトレース路長は、試験プレート上に置きました。
   1. 幼虫は、プレート上に配置したのと同じ速度でトレースを行います。後でデータ分析で一貫性を保つため、すべてのパスの長さのために同じマーカーを使用します。永久的なマーカーが推奨されます。
9. 繰り返しは、試験される各株について6.8.1に6.2を繰り返します。 PAに対する飢餓の影響を避けるために、試験の直前に食品から各菌株を選択してください番目の長さ。

7.食品剥奪

1. 幼虫は試験前に奪わ食べ物であるとされている場合は、 例えば （前のステップ6.2〜6.3に記載されているように幼虫を集めるが、絶食時間の所望の量。幼虫が4時間奪わ食品であるとされている場合は、前幼虫4時間を収集試験時間）。
2. 二つのグループに洗浄幼虫を分割し、5ミリリットルの標準的な食品とペトリ皿で​​5ミリリットルの1％寒天と対照群と60×15ミリメートルペトリ皿に食べ物を奪わグループを配置。
3. （そうでなければ幼虫は食べ物を検索するときに出てクロールすることができます）ペトリ皿の反転蓋の上に重量を配置します。
4. 以前に確立された食品の剥奪期間インキュベートし、ステップ6.9から6.2に記載されているようにテストを続行します。
5. 多くの株を試験する場合、絶食は、適切な時点でそれぞれの株の試験を可能にするために開始時刻をずらします。

8.データ解析

注：このセクションでは、他のソフトウェアを使用することができるが、経路長の処理のためのImageJ ⁷またはフィジー^8を使用して^、データ分析のための方法が記載されています。

1. （蓋は、エタノールで洗浄し、さらにパスの長さの記録のために再利用することができる）のホワイトペーパーをペトリ皿の蓋からトレースされたすべてのパスの長さを転送するライトテーブルを使用してください。
2. 用紙の1に50ミリメートルストレートな基準線をトレースします。
3. 300dpiの解像度で路長をスキャンし、ビットマップまたはTIFF画像ファイルとして保存します。
4. 「プロセス」タブ>「バイナリ ">"バイナリメイク」を選択し、画像ファイルを開きます。そして、「プロセス」タブで、「バイナリ ">"骸骨にする」を選択します。これは関係なく、トレースの厚さの、1ピクセル幅のラインを生成します。
5. 各パスの長さがありませんクロスオーバーを有する連続1行で表示さていることを確認します。
6. 「ストレート李を使用して任意の交差点を分離neのツールワンド」（トレース）ツール」とライン白（パスの連続性を着色をして確認することができます」、パス全体が黄色に強調表示されます（ 図2）。
7. 「Analyseを "タブ> [設定の測定値を選択して、「境界」と「表示ラベル」を選択します。
8. 「Analyseを "タブ>"設定スケール」を選択し、「規模の削除」を選択します。
9. 、「結果の表示」と「クリア結果テーブル」：画像上で、「Analyseを "タブ>" Analyseを粒子」を選択し、「アウトライン表示」を選択し、唯一の基準線を選択します。注：出力が50mmスケールラインに対応する画素の数を表示します。
10. 「Analyseを "タブ>"スケールを設定」と「既知の距離」の「ピクセル単位の距離」の画素数と対応する距離（50ミリメートル）に記入を選択します。
11. 最後に、1遺伝子型aのすべてのパスの長さの図面を選択時間taは、「Analyseを "タブ>" Analyseを粒子」を選択し、「表示：アウトライン」を選択し、「結果の表示」と「クリア結果テーブルを」。
    1. エリアを選択し、白いそれを充填することによって選択された領域内の任意の書かれたラベルや明白な余分なマーキングを（彼らが路長として認識されます）を削除します。
12. 視覚的に周囲が正しく確認した保証するために、「アウトライン」出力ファイルを検査します。出力は、選択中の各パスの長さの描画のためのミリメートルでのパスの長さが表示されます。これは、簡単にスプレッドシートにエクスポートし、任意の統計ソフトウェアを用いて分析することができます。

結果

ローバーとベビーシッター株および経路長の絶食の効果の経路長の差は、図に示されています。 。ローバーが遠くシッターよりも旅行で、;（ 図_{3A。F（1,421）=} 351.89、P <2.20×10 ^-16）3データは、テストの3日連続にわたって収集は重要な歪み効果を示しました。食品試験前に4時間を奪われた幼虫を、;歪み効果に加えて、重要な食品の治療効果（ 図3A _{F（1、421）=} 461.62、P <×10 ^-16 2.20）もありました供給された幼虫よりも有意に低いパス長さを有します。さらに、ANOVAはローバーとシッターが異なる程度に食物欠乏に応答した意味、治療の相互作用_{（F（1,423）=} 9.78、P = 2×10 ^-3）ことにより、大幅...

ディスカッション

ここで概説路長アッセイは、 ショウジョウバエの幼虫の採餌行動の堅牢かつシンプルな手段を提供しています。プロトコルは、Sokolowski ²に記載された一般的な方法論を使用しますが、以来、効率性と実験のコントロールに関してで改善されました。我々の知る限り、この方法は、幼虫の経路長を測定するための唯一の利用可能な方法です。経路長のプロトコル^{2、3、15、16}の元のバージョンは、ブラシで塗布酵母ペーストの薄い層、及びロッドを拡散後ガラスをペトリ皿上に幼虫を試験しました。プロトコル^10、17の最近のバージョンは、ここで説明したプレキシグラス板を使用することに移行しました。ペトリ皿やガラススプレッダーを使用することは、非常に長いパスの長さが得られたとローバーとシッターの表現型との違いを悪化させた酵母の非常に薄い層、の利点を提示しました。プレキシグラス板の使用は、全体のより短い経路長をもたらしたが、RO版シッターの差は維持されたと同じように再現可能。プレキシグラス板の使用がはるかに少ない面倒ですが、ペトリ皿法で得られた長い路長は、遺伝子³ <...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6オンス フライカルチャーボトル	フィッシャーサイエンティフィック	AS355
フライバイアルプラグ	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mmペトリ皿	ファルコン	351008
100 x 15 mmシャーレ	フィッシャー	875712
60 x 15 mmシャーレ	VWR	25384-168
解剖プローブ	Almedic	2325-58-5300
イースト・	ラボ・サイエンティフィック	FLY-8040-20F