顕微鏡骨転移の効率的かつ選択的モデリングのためのイントラ腸骨動脈注入

サマリー

この原稿は、骨を含む後肢組織にがん細胞を特異的に送達し、実験的な骨転移を確立する技術である腸骨内動脈（IIA）注射の詳細な手順を提供します。当初は乳房腫瘍モデルで確立されましたが、このプロトコルは他の種類のがんにも簡単に拡張できます。

要約

腸骨内動脈(IIA)注射は、動物に様々な癌細胞の転移性病変を導入するための効率的なアプローチです。広く使用されている心臓内および脛骨内注射と比較して、IIA注射にはいくつかの利点があります。まず、大量のがん細胞を特に後肢の骨に送達できるため、時空間的に同期した初期段階のコロニー形成イベントが提供され、播種した腫瘍細胞の堅牢な定量と迅速な検出が可能になります。第二に、局所組織に損傷を与えることなくがん細胞を循環器に注入するため、骨のコロニー形成プロセスを混乱させる炎症性および創傷治癒プロセスを回避できます。第三に、IIA注射は非骨臓器の転移性増殖をほとんど引き起こさないため、動物が他の重要な転移に屈するのを防ぎ、緩慢な骨病変の継続的なモニタリングを可能にします。 これらの利点は、単一がん細胞から多細胞微小転移への進行の検査に特に有用であり、これはこれまでほとんどとらえどころのないものでした。IIA注射は、生物学的イメージングや骨組織学の最先端のアプローチと組み合わせることで、骨転移に関連するさまざまな研究目的に適用することができます。

概要

転移は、固形腫瘍による死亡の90％以上を占めています。骨は、様々な癌の種類、特に乳癌および前立腺癌の転移によって影響を受ける最も一般的な臓器です。クリニックで診断すると、骨転移は通常、すでに多くの場合、神経学的症状を伴う、骨に溶骨性または骨芽細胞の変化のいずれかで進行した段階に入ってきました。

主に明白な溶骨性骨転移^1-3に焦点を当てた以前の研究は、しかし、我々は現在、溶骨性プロセスの開始前に、骨の中に微小転移の理解が限られています。これは、少なくとも部分的には、適切な実験モデルとアプローチの欠如にあります。乳癌の遺伝子操作されたマウスモデルは、多くの場合、肺に転移するが、はるかに少ない効率的に骨⁴へ。同様に、同所移植された腫瘍はほとんどいくつかの骨の熱帯4T1乳腺carcinomで、自発的な骨転移を発症しませんサブクローンおよびMSPは、例外^5-7としてPyMTトランスジェニックマウスモデルを過剰発現しました。イントラ脛骨掘削は骨^8-10に癌細胞を提供することができますが、それはまた、局所組織への損傷および炎症を招きます。現在の乳癌細胞株の心臓内注射は、骨定着^11-13を調査するための主要なアプローチとなっています。癌細胞は、左心室の中に導入された後、しかし、限られた割合は、最終的にそれが困難な定量化方法で微小転移を追跡すること、骨および骨髄に到達します。

本研究では、選択的に局所組織への損傷を引き起こすことなく、骨及び骨髄中の癌細胞を濃縮、後肢組織に癌細胞を送達するために、技術、すなわち内腸骨動脈（IIA）注入^14を確立^します 。なぜなら骨特異性のため、このアプローチは、無痛性癌細胞は最終的に、ANの前にコロニーを形成するのに十分な時間を可能にしますimalsは、他の重要な臓器における原発腫瘍または転移に屈します。このような生物発光イメージング、免疫蛍光染色および骨組織形態計測などの他の種々の技術と組み合わせると、IIA注入は、特にマルチセルに単一の癌細胞からの進行を追跡するために、骨転移に関連した研究目的の広い範囲のために有用である可能性があります微小転移。特に、我々はIIA注射は、癌細胞と骨微小環境における周囲のセルの様々なタイプの間の相互作用を可視化することを可能にすることを実証しました。

プロトコル

全ての動物作業はベイラー医科大学の動物のケアのガイドラインに基づいて行われました。

1.細胞の調製

注：異なる癌細胞株は、研究目的に応じIIA注入のために使用することができます。我々は、乳癌細胞株を使用しているMCF7、4T1、4T07、MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-436および研究における前立腺癌細胞株C4-2。我々は通常、我々の研究のために、GFPおよびホタルルシフェラーゼ標識癌細胞の両方を使用し、GFP-ルシフェラーゼ標識MCF7細胞株から、ここでいくつかのデータを示しています。

1. 5％CO ₂中、37℃で、10％FBSおよび0.1mg / mlのペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM中で細胞を維持します。
2. 0.25％トリプシン/ EDTA溶液を用いて90％のコンフルエンス - IIA注射前に、80℃で細胞をトリプシン処理。細胞計数のために10ミリリットルのPBSで細胞を細胞を2回洗浄し、再懸濁するために冷PBSを使用してください。 5分間、800×gでPBS、遠心セルを削除します。
3. 細胞を再懸濁氷冷PBS中で5×10 ⁶細胞/ mlの濃度で。
4. 1マウスのIIA注射のために100μlのGFP-およびホタルルシフェラーゼ標識癌細胞を使用してください。
   注：したがって、各動物によって受信されたセルの数が5×10 ⁵であり、この数は、細胞系の侵襲性に基づいて変更される必要があり得ます。
5. 氷上で細胞懸濁液を保管してください。
   注：これは、注射のために準備が整うまで、振動は、細胞凝集を数分ごとに防止するために必要とされ得ます。 （例えば、MDA-MB-231のような）いくつかの細胞株について、（ 例えば 、45μmの細胞ストレーナーを通過する）、よりストリンジェントな手順は、凝集を防止するために必要とされてもよいです。血管の詰まりが組織の壊死を引き起こし、そのための実験を混乱させる場合がありますのでご了承ください。

2.動物の準備

1. 動物の疼痛管理のために、手術前にマウスに栄養補助食品に劣らず24以上時間を5ミリグラム/ kg /日のカルプロフェン（または他の鎮痛剤）を得ました。管理します手術前に0.1mg / mlのブプレノルフィン皮下に60分の線量。注：オプションの手順余分エストラジオールを提供するために、動物の背面にエストラジオールパレットを注入することです。これは、ER +癌細胞（ 例えば 、MCF-7細胞^）9のグローを加速していきます。
2. 腹腔内注射により - （100ミリグラム/キログラム80）とキシラジン（10 -12.5 mg / mlで）ケタミンで6週齢のマウス（約20グラム） - 4を麻酔。
3. つま先のピンチと呼吸数とピンクの粘膜の50％減少（ 例えば、マウスの耳皮膚と足の皮膚）の観察による20グラムのマウスの鎮静の適切なレベルを確認してください。手術中にこれらのバイタルサイン15分毎に監視してください。注：動物のいかなる動きは、動物が十分に麻酔をかけ、手術の準備ができていることを示しています。
4. 乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
5. 下腹部、特に右鼠径部ここで手術や注射が意志の上でマウスを剃ります場所を取ります。
   注：無胸腺ヌードマウスを使用している場合、これは不要です。
6. 、その背中の上でマウスを置く彼らの自然な位置に足を広げ、テープ付き携帯解剖段ボールにつま先を貼り付けます。
7. 70％イソプロピルエタノールに浸した滅菌綿棒で右鼠径部を拭き、ベタジン外科手術用スクラブで数回続きます。

3.総腸骨静脈と動脈の場所と分離

1. 長い4 ^番目と第3ハンドルで開催された無菌の、＃10炭素鋼メスの刃を使用して、右下腹部にある5 ^番目の乳首は1.2センチメートル- 1.0の皮膚切開を行います。その後、切開部位を除いて動物の体をカバーするために、滅菌外科用ドレープを使用します。
2. 標準ベンチトップ解剖顕微鏡に動物を移動します。注射のために4倍の倍率を使用してください。
3. 解剖顕微鏡の4倍の倍率下では、脂肪組織とperitoneu間の鈍分離鉗子を挿入mおよび腸骨血管および神経を露出させるために両側に外側の組織を押し（ 図1参照 ）。
   注：正中動脈枝の下部から大動脈の間の動脈は総腸骨動脈と呼ばれています。注入が行われる場所です。
4. 船に近い血管と神経の間（膜のような）結合組織、突破するためにストレートの微細鉗子のペアを1つ使用します。
5. 左手にまっすぐ細かい鉗子を切り替えます。右手を使用して、角度の付いた微細な鉗子のペアをつかみます。結合組織が破壊されたのと同じ位置に右手の鉗子を挿入します。そして船の下を通って右側の鉗子を貼り付けます。
6. 同時に、通過して右手の鉗子を導くために船の左側の結合組織に左手の鉗子を挿入します。
7. 右側の鉗子が船の下に到達したら、周囲のTIから血管を分離しようもう少しssue、その後、右側の鉗子の上にそれらを保ちます。
8. 右側の鉗子に4-0絹縫合糸の先端を提供するために左側の鉗子を使用し、その後、船の下を通って静かに、ゆっくりと縫合糸を引っ張ります。注意：今の両方の共通の静脈と動脈血管が縫合糸によって持ち上げられ（ 図2を参照）。

4.インジェクションとポスト噴射ケア

1. 31 Gインスリン注射器で注入のための細胞を準備します。注射あたりPBSに100μlの細胞懸濁液を使用してください。注入された細胞は、血液の流れを詰まらせ、ブロックしないように、細胞を分離し、凝集を避けるために、上下に数回をピペットとすることを確認します。
2. 左手に角度のついたピンセットで、縫合糸の指導に沿って船の下に鉗子を入れ、その後、鉗子の2つのアームを開き、鉗子を軽く開催された血管を持ちます。
   注：鉗子の2つのアーム間の間隔がiになりますnjectionサイト。
3. 注射の準備ができて、上向きの針のベベルと、右手に100μlの細胞懸濁液と31 G針を保持します。
4. （血液が針の先端を入力します）動脈内腔に針を挿入します。次に、細胞を注入することで、ゆっくりと細胞懸濁液を押してください。細胞懸濁液を容器に赤血球を離れてプッシュします。血管を壊したり、細胞懸濁液を漏れ出ないようにしてください。
5. 注入が完了すると、そっと針を引き戻すと、出血を止めるために、左側の鉗子で船を保持し続けます。その後、縫合糸を引き離します。
6. 左側の鉗子を引き離し、かつ迅速に出血を止めるために動脈切開領域を押して綿棒を使用しています。
   注：通常5から10分間連続的圧力は、出血を止めるのに十分です。
7. 停止し、出血すると、手術領域の皮膚のエッジを閉じるには、皮膚の接着剤を使用しています。耳タグを作成し、注入された細胞の分布を調べるために、シグナリング生物発光を確認してください。
   注：成功した注射は、 図3に類似した画像になります。
   1. イントラ眼窩洞経由して75ミリグラム/ kgのマウスの濃度でPBS中100μlの15 mg / mlとルシフェリンの注射により生物発光シグナルを確認してください。
      1. イントラ眼窩注射のために、マウスの目の両側に指を入れて眼球が若干、目のフレームから飛び出し眼球と鼻の間に28 Gインスリン注射針を挿入し、ゆっくりとルシフェリンを注入する注射器をプッシュするために圧力を使用。
         注： - 硬組織（骨）を押す前に、3ミリメートル正しい位置で、針は2の深さに到達することができるはずです。
      2. （ 図3参照 ） を 5分以内に60秒- 10ためのインビボ動物全体のイメージング用のイメージング・システムにマウスを置きます。
         注：オプションの手順余分エストラジオールを提供するために、動物の背面にエストラジオールペレットを移植することです。これは、ER +癌細胞（ 例えば 、MCF-7の成長を加速します細胞^）15。
8. それが目覚めるまで暖かい加熱パッド上でマウスを残します。 、手術後の期間中の裂開や痛みの兆候を腫れ、出血を監視します。痛みの兆候まで、疼痛管理のために与えられた鎮痛カバレッジ（carprofin栄養補助食品が提案）とのケージに戻ってマウスを置きます。手術後7日の間、動物に細心の注意とケアを払ってください。

5.監視転移成長

1. 組織形態計測：
   1. 5日目、および以前^14に記載^{されている}よう^にパラフィン包埋それらを施す-収穫腫瘍はその後3 pH7.0の14％EDTA溶液でそれらを脱灰、24時間、4％パラホルムアルデヒド中で骨を固定する、骨組織を有します。
   2. セクションパラフィン埋め込む骨3μmの厚さで組織し、以前に^14を説明したようにヘマトキシリン/エオシン染色の標準的な組織学的方法を実行します。
2. Immunohistochemis試してみてください。
   1. 被験者パラフィン包埋腫瘍担持骨は、先^14に記載^{されている}よう^に様々な目的のために染色免疫組織化学するスライド。簡潔には、それぞれ、抗オステリックス抗体および抗アルカリホスファターゼ（ALP）抗体によるMCF7癌、抗GFP抗体による細胞、および免疫染色骨形成細胞（前骨芽細胞および骨芽細胞）免疫染色。

結果

図1は、解剖学的位置及び総腸骨動脈（赤）および静脈（青）の関係を示す図です。

図2は、解剖顕微鏡下で腸骨血管や神経の相対的な位置を示しています。 図2Aに示されているように、血管と神経が腹腔壁の下に右であり、皮膚切開がなされ、腹膜が押しのけた後に明らかにすることができます。総腸骨静脈は左にあり、動脈に比べて大きく、暗いです。動脈が真ん中にあり、ピンク色に見えます。これは、静脈よりも薄いが、厚い筋肉壁を有しています。静脈と動脈が平行と密接に相互に接続されています。遠く右には白腰仙神経である。 図2Bは 、4-によって周囲の結合組織、筋肉や神経から分離し、持ち上げ総腸骨血管を示しています0絹縫合糸。総腸骨静脈、動脈、および腰仙神経も示されています。

ディスカッション

唯一の腸骨動脈は、癌細胞に注入の対象ではありますが、私たちは、周囲の組織からの両方の腸骨静脈と動脈の分離をお勧めします、とのバンドルとして一緒にそれらを持ち上げるために。静脈と動脈が広く互いに接触するためである、と静脈血管壁が薄く、壊れやすいです。がん細胞のみを動脈に注入されているがため、成功した注射のために、それは、一緒に2つの容器を保持するために時間と労力を節約できます。 4-0絹縫合糸を、 図2に示すように、このプロセスを支援するために使用される。縫合糸はまた、発生した止血を助けることができます。

IIA注入のほとんどのステップは、解剖顕微鏡下で実行される必要があります。マウスの血管は手続きがやりがいになりますどの、柔らかくて小さいです。我々の経験では100％ - しかし、十分な練習の後、成功率は90に到達することができます。

この技術では、研究者であってもよいです伝統的に「非転移性」と思ったものを含めて自分の好きな癌細胞モデルの骨のコロニー形成モデルを確立するBLE。 MCF-7細胞...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 μM細胞ストレーナー	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen		の獣医ケアからの管理アイテム	疼痛管理
のためのブプレノルフィン		の獣医ケアからの規制アイテム	疼痛管理のために
エストラジオールペレット	アメリカの革新的な研究	SE-121
ケタミンとキシラジン	BCM
獣医軟膏	BCMの獣医ケアからの規制アイテム	目の乾燥を避ける
			毛皮付きマウス
イソプロピルエタノール	ACROS	67-63-0
ベタジン外科用スクラブ			の獣医ケアからの規制品
	テッド・ペラ社	549-3CS-10	マルチプル
No. 3 ハンドル	テッド・ペラ社	541-31	オートクレーブ滅菌
滅菌外科用ドレープ	サイ・インフュージョン・テクノロジー	PSS-SD1
ストレート鉗子	ロボズ手術器具	RS-5132	オートクレーブ滅菌が必要
ストレートファイン鉗子	ファインサイエンスツール	11253-20	オートクレーブ滅菌が必要
エッジファインファイン鉗子	ファインサイエンスツール	11253-25	オートクレーブ滅菌が必要
4-0 Vicryl シルク縫合糸	ジョンソン&ジョンソンヘルスケア	J214H
31 Gインスリンシリンジ	BD	328418	複数の
Qチップ綿棒(滅菌)	VWR国際研究所	89031-272
皮膚接着剤	ヘンリーシャインアニマルヘルス	31477手術	部位の皮膚閉鎖用
耳タグアプリケーター	ファインサイエンスツール	24220-00
耳タグ	ファインサイエンスツール	24220-50
D-ルシフェリン	ゴールドバイオテクノロジー	ラック	光を避けて氷の上に置く
28 G インスリン注射器	BD	329410	眼窩内注射用
パラフォルマデハイド	アルファ エーザー	30525-89-4	組織固定用
EDTA	OmniPur	4050	骨組織の脱カルフィケーション用
名称	会社名<	strong>カタログ番号	コメント
>Equipment
Dissection 顕微鏡	ライ	カ S6E stereo
IVIS Lumina II イメージングシステム	アドバンスド・モレキュラー・ビジョン
名前	会社	カタログ番号	コメント
抗体
Anti-GFP抗体(JL-8)	Clontech	632381
抗ALP抗体		Abcam ab108337
Anti-Osterix抗体	Abcam	ab22552