このプロトコルは、イメージングや分子生物学的実験を行う目的でマウスの冠状細胞を分離する方法を共有するために準備されています。
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この記事について
サマリー
要約
内皮細胞は、血管の内壁を裏打ちし、血管緊張、血管透過性、および新血管形成の調節に重要な役割を果たしています。内皮細胞の機能障害は、虚血性心疾患を含む多くの心血管疾患の発症および進行に関与しています。冠動脈内皮細胞の機能と特徴付けを調べるために、細胞の単離は、最初のステップであり、それはその後の実験を行うために、高純度と量を必要とします。このプロトコルは、成体マウス冠動脈内皮細胞を単離するための効率的な方法を説明します。マウスの心臓を切開し、小片に刻んだされます。ディスパーゼおよびコラゲナーゼIIを使用して、心臓の消化の後、細胞を洗浄し、抗CD31抗体に結合された磁気ビーズと共にインキュベートしました。内皮細胞とビーズを数回洗浄し、様々な用途で使用する準備ができている、イメージングおよび分子生物学的experime含めていますNTS。効率的な分離は、90％以上の純度で1心あたり約10 4個の細胞が得られます。
概要
様々な心血管疾患および代謝性疾患のマウスモデルは、患者に見られるものと類似している生理学的および分子的変化を負います。さらに、マウスの遺伝的変化は、私たちが疾患の発症と進行における特定の遺伝子の病原性の役割を調査することを可能にする強力なツールです。今日では、細胞型特異的遺伝子ノックインまたはチェックアウトマウスは簡単に多くの研究室で生成され、特定の細胞型におけるmRNAおよびタンパク質レベルの測定は、マウスは本当に遺伝的に変更されたかどうかを決定するための最初のステップであるされています。
内皮は、内皮細胞（EC）のラインの内側血管壁の薄い単層です。内皮細胞は、血管緊張、血管透過性、および新しい血管の形成1,2の調節に重要な役割を果たしています。内皮機能障害は、多くの病的状態および内皮機能の変化の顕著な特徴は、様々な車につながる可能性がありますdiovascular疾患3,4。生理学的および病態生理学的条件下での内皮細胞の機能を研究することが重要です。
電気部品5-8と分離法が使用される組織および種に応じて最適化する必要がある単離するためのいくつかの方法があります。異なる組織からのECは、それらの表面マーカーおよびタンパク質発現9に対して異質の高いレベルを表示するためです。内皮細胞の成功の分離は、しばしば挑戦することと訓練と実践のい....
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プロトコル
マウスでの研究は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って行きました。
注：セクション1、2および3は、セットアップとして、実験の前日に行われるべきです。
1.準備ソリューション
- CD31バッファー（50ml）で
- 50ミリリットルチューブに50ミリリットルの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。 0.05 gでウシ血清アルブミン（BSA）および0.037 gでエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を秤量し、50mlチューブに追加し、粉末が溶解するまで約1時間回転するチューブを置きます。 、pHを7.4に調整し、新しい50ミリリットルチューブに0.2μmのフィルターでろ過し、使用するまで4℃で保存してください。
- HEPESを有するハンクス平衡塩溶液（HBSS）（500mL）で
- HBSS溶液に10mMのHEPESを作り、よく混合するHEPESの1.1915グラムを追加します。 pH値を測定し、7.4に調整します。 4におけるフィルタと店舗˚C。
- 1×クレブス溶液（1 L）
- 1リットルのフラスコに蒸留水を倍増する10×クレブス液[ 表1]の100ミリリットルを追加します。 2.1グラム重炭酸ナトリウムおよび2グラムD-グルコースを計量し、フラスコ....
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結果
マウスの心臓から冠動脈内皮細胞の正常な分離は、典型的には、石畳の形状と90％以上の純度で約10 4個の細胞が得られます。内皮細胞の純粋な集団のために、注意が汚染のない無菌環境を確保するためのプロトコル全体で取られるべきです。細長い細胞または集団内の拡大された細胞の出現は、他の細胞型、平滑筋細胞および線維芽細胞の混入を示します。内皮細胞の純度試験は、内皮細胞表面マーカー、BS-レクチン及びacLDL（ 図1）で細胞を染色することによって行われます。両方の色を呈する陽性細胞のパーセンテージはMCECで90％以上でした。このような結果は、技術が正常に実行されたことを示しています。
| PBS（10×）（1 L） | |||
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ディスカッション
研究において最も広く使用されている内皮細胞は、その利便性と培養の容易さのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）です。しかし、多くの研究は、他の特定の臓器10からの内皮細胞の単離によって達成生理学的モデルの可用性を必要とします。内皮細胞は、心臓組織内の細胞の非常にマイナーな人口を構成しています。それらの単離および培養は非常に困難であることを証明することができます。
このプロトコル内の3つの重要なステップがあります。最初は、血液をよくフラッシュすることです。血液中の白血球は、細胞表面マーカーとしてCD31を発現し、CD31抗体の結合についてのECに対して競合するように、これは、必要です。他の内皮細胞は、血液中に存在することができるように、フラッシングは、このような細胞による汚染を防止するために不可欠です。第二の重要な工程は、分離プロセスを通じて無菌環境を維持することです。任意の汚染RESU達成細胞の数の劇的な減少でLTS。最後に、第三の重要なステップは、そうしないとは分離の効率を低下させるように、CD31の緩衝液のpHを調整することです。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、国立衛生研究所（A.牧野へHL115578）からの助成金によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | フィッシャー | BP120-500 | |
| HBSS | フィッシャー | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| 重炭酸ナトリウム | シグマ | S5761 | |
| D-(+)-グルコース | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads パンマウス IgG ビーズ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11035 | |
| ラット抗マウスCD31抗体 | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション/フィッシャー | ・LS004176 | |
| ・グリセロール | フィ | ッシャーBP381-1 | |
| イゲパル | グマ | I3021-50ml | |
| ホスファターゼ阻害剤カクテル | シグマ | P0044-1ml | |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | シグマ | P8340-1ml | |
| ヘパリン | シグマ | H3149-100KU | |
| FBS | フィッシャー/メディアテック | MT35010CV | |
| D-バリン | シグマ | V1255-5G | |
| EGS | コーニング | 356006 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | フィッシャー/メディアテック | MT-30-002-CI |
参考文献
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al.
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再版と許可
