過剰な細胞外マトリックスタンパク質の沈着を伴う持続的な線維症は肝硬変を引き起こします。アルコール乱用は、重度の肝疾患の主な原因の1つです。エタノールによるゼブラフィッシュの線維性肝臓モデルを確立し、アルコールによる傷害に対する肝細胞の再生促進のメカニズムと戦略を研究しました。
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この記事について
サマリー
要約
細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の蓄積が続く持続的な肝線維症は、肝臓の細胞能力の喪失をもたらし、肝細胞機能障害を伴う肝硬変を引き起こします。複数の肝障害の中で、アルコール乱用は肝不全や肝細胞癌などの重大な健康問題を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、アルコールに応答して肝細胞を再生する内因性細胞源の同一性は適切に調査されていません。さらに、アルコール誘発性損傷に対する肝細胞の再生を効果的にモデル化した研究はほとんどありません。私たちは最近、ゼブラフィッシュでエタノール(EtOH)誘導性線維性肝臓モデルを確立したことを報告しました。そこでは、肝前駆細胞(HPC)が線維形成刺激の存在下でほぼ完全な肝細胞喪失時に肝細胞を生じさせました。さらに、このモデルを用いた化学スクリーニングにより、肝細胞の再生を促進する複数の低分子を同定しました。ここでは、EtOH誘導性線維性肝臓モデルの開発手順と、ゼブラフィッシュにおけるこのモデルを用いた化学スクリーニングの実施手順について詳しく説明します。このプロトコルは、肝細胞が線維性肝臓でどのように再生するかの分子的および細胞的メカニズムを描写するための重要なツールになります。さらに、これらの方法は、in vivoでの慢性肝疾患の新しい治療戦略の発見を促進する可能性があります。
概要
肝臓の主要な実質細胞型である肝細胞1、の顕著な再生能力にもかかわらず、慢性肝不全、肝前駆細胞（HPC）依存性再生2につながる、この能力を損ないます。
慢性肝障害は、主にアルコールの乱用、慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染3及び非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）4から誘導されます。それは、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の蓄積に関連している持続的な肝線維症につながります。永続化ECMの蓄積はその後、高い罹患率と死亡率との肝硬変で、その結果、線維性瘢痕組織5を形成することにより、無傷の肝アーキテクチャを歪めます。多くの試みがprofibrogenicサイトカインおよび活性化筋線維芽細胞6を阻害することに焦点を当て、主に線維化反応を緩和するために行われてきました。後者は主にH（肝星細胞に由来しますSCS）、肝臓の瘢痕形成4に責任原則肝非実質細胞。それにもかかわらず、持続的な線維形成侮辱の存在下で肝細胞を再生成するのHPCを含む内因性の細胞源を刺激する再生治療は、さらなる調査を待ちます。
肝線維症の多くの実験モデルは、哺乳動物において記載されています。四塩化炭素（CCl 4）の繰り返し注射が広くマウスおよびラットモデル
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プロトコル
ゼブラフィッシュは上昇し、国立衛生研究所の基準を満たしており、ジョージア工科大学施設内動物管理使用委員会により承認された標準プロトコルを使用して飼育しました。
ソリューションの調製
- 胚/幼虫のゼブラフィッシュを維持するために、（同義的に「胚培地」で使用される）20 Lの卵の水を準備します。蒸留水250ミリリットル中に1.5グラムのCaSO 4と6グラムインスタント海の海の塩を溶解させます。 20 Lの蒸留水で満たされたカーボイに注ぎ、かき混ぜます。
- 1 L 1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）ストック溶液（20倍）を準備します。 1 Lの蒸留水に0.6グラムのPTU粉末を溶かします。作動液として0.003％の最終濃度は、20 mlの胚培地当たりストック溶液1mlを加えます。
注意：PTUは、吸入または皮膚暴露後の全身毒性を引き起こす可能性があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 - 1 Lのエチル3- aminobeを準備nzoateメタン（トリカイン）ストック溶液（20倍）。蒸留水で4グラムのトリカイン粉末を溶かします。 1 Mトリス緩衝液（pH 9）を加えることによりpHを7に調整し、蒸留水で1Lの最終容量をもたらします。 -20℃で50ミリリットルにアリコートとストア。使用前に解凍します。
注意：トリカインは、感覚の喪失を誘導することができます。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従....
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結果
図1は、幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発を示しています。 EtOH中にゼブラフィッシュの幼生を露出させるためのプロトコルを最適化するには、まずエタノールの毒性を評価しました。 2.5日 - 受精後（DPF）の幼虫をEtOH濃度1％、1.5％、または同時24時間のエタノール/ MTZ処理に続いて24時間2％を暴露しました。ほぼすべての幼虫が1％EtOHを以下にさらされながら、2％エタノールへの曝露は、高い死亡率の原因となった、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質のまれな堆積と最小限の線維形成変化を示しました。これらの結果に基づいて、幼虫は、24時間（2.5〜3.5 DPF）とを同時に24時間（3.5〜4.5 DPF）（ 図1A）のためのMTZで処理するために、1.5％EtOHで前処理しました。エタノール/ MTZ-処理した幼虫は、トランクと尾の上向きの曲率、心膜浮腫、スイム膀胱を膨らませるの失敗など、形態異常を示しました。 （ 図1B）。
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ディスカッション
私たちも、私はコラーゲン線維状の型を含むECMタンパク質の実質的な量の存在下では、HPCのが肝細胞として再生するために自分の能力を保持していることを示唆し、エタノール/ MTZ-扱わ回復肝臓におけるHPC媒介肝細胞の再生を観察しました。エタノールのみ処理はHPCの活性化15を誘導しなかったMTZのみ処理は、大幅にECMタンパク質の沈着を増加させませんでした。合わせたエタノール/ MTZ処理を利用することにより、我々は線維性肝臓でHPC-駆動再生を調査することができました。肝細胞のほぼ完全な除去はHPC-駆動肝細胞の再生を誘発するように、クラスタ化されたNRCSにより肝細胞特異的蛍光の欠如の基準に基づいてMTZ処理した幼虫と大幅に減少肝体積を整理することが重要です。動物は自由に飲んだりintragaを必要とすることを可能にする必要がないように魚では、鰓や皮膚の血管は、アルコール24を吸収します哺乳動物のモデルのようにstric注入。私たちは水を循環させることなく、別々のタンクでEtOH-、その後のMTZ処理された成魚を収容しました。毎日新鮮なエタノール溶液に魚を転送し、EtOH.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作品は、私たちは、原稿の重要な読書のためのアレムGiorgisに感謝CHSにGTEC（2731336および1411318）、NIH（K01DK081351）、およびNSF（1354837）からの助成金によって部分的にサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 硫酸カルシウム半水和物 (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| 硫酸マグネシウム (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-ピペラジンジエタネスルホン酸 (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)- N,N,N′,N′-四酢酸 (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| エタノール | Sigma-Aldrich | E7023 | 200プルーフ |
| ホルムアルデヒド | ッシャーサイエンティフィック | F79-500 | |
| メトロニダゾール (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠 | Amresco | E404 | 1錠を100 ml蒸留水に溶かす |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| ウシ血清アルブミン | フィッシャーサイエンティフィック | BP1600 | |
| トリトンX-100 | フィッシャーサイエンティフィック | BP151 | |
| 低融点アガロース | Amresco | BP165 | |
| 幹細胞シグナル化合物ライブラリ | Selleck Chemicals | L2100 | 10 DMSO |
| ActiProbe-1Kライブラリ | Timtec | ActiProbe-1K | 10 DMSO |
| SB | 415286 Selleck Chemicals | S2729 | DMSO で 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | DMSOで10 mM |
| 抗コラーゲン I 抗体 | Abcam | ab23730 | 1:100 で使用して免疫染色、魚と反応 |
| AlexaFluor 647 ロバ抗ウサギ IgG (H+L) | 分子プローブ | A31573 | 1:200 で免疫染色に使用 |
| 封入剤 (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm ペトリ皿 | VWR | 25384-088 | |
| 24-wellプレート | VWR | 10062-896 | |
| 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11255-20 | デュモン #55 |
| スライド | ガラス VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| カバー ガラス | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| ラップ | フィッシャー サイエンティフィ | 22305654 | |
| アルミ箔 | フィッシャー サイエンティフィック 1213100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| バイブロトーム | ライカ | VT1000 S | |
| 実体顕微鏡 | ライカ | M80 | |
| 落射蛍光顕微鏡 | ライカ | M205 FA | |
| コンフォコール顕微鏡 | ツァイス | LSM700 |
参考文献
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
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