Method Article

の開発と特性評価インビトロ微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca 2+]私と一酸化窒素の生産

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

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1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

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Primary Human Umbilical Vein endothelial cells (HUVECs)は、マイクロ流体ネットワークデバイス内で合流するように増殖しました。内皮細胞結合とF-アクチンの分布が示され、アデノシン三リン酸(ATP)に応答した細胞内カルシウム濃度と一酸化窒素産生の変化が個々の細胞レベルでリアルタイムで定量されました。

Abstract

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インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型を示しています。マイクロ流体デバイスの開発は、二十年以上のエンジニアに受け入れてきたが、それらの生物学的用途が限定されたまま。より生理学的に関連する生物学的用途によって検証試験管内微小血管モデル内のフィールドを進め、in vivoでおよびin vitroの研究で間のギャップを埋めることが重要です。ここで、我々は長期的な灌流能力を備えたマイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管網の開発のための詳細な手順を提示します。また、共焦点と従来の蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムでECの[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の生産におけるアゴニスト誘発変化の定量的測定のためのアプリケーションを示しています。形成された微小血管ネット連続灌流との仕事は、ECの間でよく発達した接合部を示しました。 VEカドヘリン分布を静的培養EC単層よりも無傷の微小血管で観察されたものと近かったです。 EC過渡増加するATP誘発性の[Ca 2+] iとNO産生を定量的培養微小血管の機能性を検証し、個々の細胞レベルで測定しました。このマイクロ流体デバイスは、電気部品が近いin vivoでの従来の静的な2D培養に比べ細胞培養環境を作るよく制御され、生理学的に関連する流れ、下に成長することができます。マイクロチャンネルネットワーク設計は、非常に汎用性があり、製造プロセスが簡単で、再現性があります。デバイスは、容易に高解像度の画像化を可能にする共焦点又は従来の顕微鏡システムに一体化することができます。培養された微小血管ネットワークが初代ヒトのECにより形成することができるので、最も重要なのは、このアプローチはどのように調査するために有用なツールとして機能します病理学的に患者サンプルから変更された血液成分は人間のECに影響を与え、臨床問題への洞察を提供します。それはまた、薬物スクリーニングのためのプラットフォームとして開発することができます。

Introduction

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インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型1,2を示しています。マイクロフルイディクス技術は、所望の流れ条件の下で成長し、特に血管のECのために、培養細胞のための機会を提供する幾何学的に拘束されたマイクロスケール（サブミリメートル）チャネル3を介して正確に制御された流体を可能にします。これらの機能は、従来の静的な2D細胞培養物よりもin vivoでの細胞培養条件近づけます。彼らは、マイクロ流体デバイスは、血管系の種類をモデル化するために使用され、機械的および/または化学的な刺激に対するEC応答を研究する際に非常に重要です。

静的な細胞培養、生物医学Fにおける適応とマイクロフルイディクスのアプリケーションの上にマイクロチャネルネットワークによって実証利点にもかかわらずieldは限られたままです。最近のレビューによって報告された、この分野（85％）の出版物の大半は、エンジニアリングジャーナル4に残っています。マイクロ流体デバイスの性能は、ほとんどの生物学者は、このようなトランスウェルアッセイおよびこの小型化されたデバイスへのマクロスケール培養皿/ガラススライドのような現在の技術からスイッチするための十分な説得力はなかったです。マイクロフルイディクスは、前方にこのフ....

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Protocol

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1.マイクロ流体デバイスの製造

  1. SU-8 50マスター型の標準的なフォトリソグラフィ製作
    1. スピンコーティングする前に、シリコンウエハを清掃してください。 15分間イソプロピルアルコール（IPA）、続いて15分間アセトンで裸の2インチのシリコンウエハをすすぎます。 1時間150℃のホットプレート上に配置することによって、ウエハを脱水。脱水後、室温でウエハを冷却します。
    2. SU-8フォトレジストをシリコンウェハをコートをスピン。ウェハ上に2ミリリットルSU-8フォトレジストを追加します。 30秒毎分300回転/秒の加速度で1000rpmで、続いて10秒間100回転/秒の加速で500回転にウェハをランプアップします。 （補足ビデオ1を参照してください）
    3. プリベーク30分間、95℃で10分間、次いで、ソフトベーク65℃のホットプレート上のウエハ。
    4. スピンコートされたフォトレジストにフィルムマスクから設計パターンを変換するためにUV露光を使用してください。フィルムマスクのような薄い透明フィルム上にパターンを印刷します。の上にフィルムマスクを配置フォトレジストをコーティングし、スピンとを300mJ / cm 2の線量でUVにさらします。 （補足動画2を参照してください）
      注：このプロトコルでは、マイクロチャネルネットワークのパターン（4幅100μmの娘チャネルに分岐する159ミクロン幅の....

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Results

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このセクションでは、このプロトコルを使用して開発した培養微小血管網で得られた結果の一部を示しています。マイクロチャネルのパターンは、3レベルの分岐ネットワーク（ 図1A）です。この設計では、4幅100μm娘チャネルに再び2 126ミクロン幅チャネル、および支店に159μmの広い母のチャネルブランチ。 3次元数値シミュレーションは、このマイクロチャネルネットワーク内のせん断応力の3つの異なるレベルを示し0.35μL/分の流速（ 図1B）、下のせん断応力分布を推定するために行きました。マイクロチャネル内の層流は、乱れまたは二次流の存在なしに流体力学的に安定であることが予測されます。 SU-8マスター型は、標準的なフォトリソグラフィ工程（ 図1C）で作製した後、PDMSデバイスは、マイクロチャネルねを複製するために、ソフトリソグラフィ技術によって作製しました透明、通気性足場（ - E 図1D）にtworkデザイ.......

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Discussion

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この記事では、の[Ca 2+] iおよびNO産生が、マイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管ネットワーク、ECジャンクションおよび細胞骨格F-アクチン分布の特徴付け、およびECの定量的測定の開発のための詳細なプロトコルを提示します。灌流マイクロ流体デバイスは、生体内微小血管の形状とせん断流動条件の近いシミュレーションを可能にするin vitroモデルを提供します。培養された微小血管ネットワークは、初代ヒトECを用いて形成することができるので、この方法は患者のサンプルから変更された血液成分を培養微小血管への患者の血液サンプルの直接灌流により人間のECにどのように影響するかを病理学的に調査し、臨床への洞察を提供するための有用なツールとして機能することができます問題。微小血管開発人間のECは、ヒトおよび動物の組織との間の薬物応答の潜在的矛盾を回避するために、薬物スクリーニングのために使用することができます。

ve_contentは ">このプロトコルに示したマイクロ流体デバイスの基板は、ガラスカバースリップ（150-180ミクロ.......

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Disclosures

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著者らは、開示することは一切競合する利益や利害を持っていません。

Acknowledgements

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この作品は、国立心肺血液研究所によってサポートされていましたHL56237、糖尿病および消化器の国立研究所腎臓病研究所DK97391-03、国立科学財団（NSF-1227359およびEPS-1003907）を付与します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
アセトンフィッシャー サイエンティフィA929
生検パンチミルテック33-31 AA
ウシ アルブミンMP バイオメディカル810014
ウシ脳抽出物 (BBE)ロンザCC-4098
カバースリップフィッシャー サイエンティフィック12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 二次抗体ライフテクノロジーA-11055
DPBS、カルシウム、マグネシウムなしGibco14190-250
DRAQ5 (核染色) Cell Signaling Technology4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
ウシ胎児血清Gibco16000-044
フィブロネクチンGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
ブタ皮からのゼラチンSigma-AldrichG1890-100G
ゲンタマイシン (50 mg/ml)Gibco15750-078
ガラスカバースリップフィッシャーサイエンティフィック12-548B
ガラスパスツールピペットVWR14672
豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩Sigma-AldrichH3393-10KU
HEPES 緩衝生理食塩水ロンザCC-5024
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)LonzaCC-2517
Isopropyl alcohol (IPA)VWR89125
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4.6 mM)FisherScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM)フィッシャーサイエンティフィックM63-500
グルコース (5.5 mM)フィッシャーサイエンティフィックBP350-1
NaHCO<サブ>3 (5.0 mM)フィッシャーサイエンティフィックS233-500
ヘペスソルト (9.1 mM)Research Organics6007H
ヘペス酸 (10.9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Culture MediumLife Technologies10372-019
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡科学15710
ファロイジン(F-アクチン染色)Sigma-AldrichP1951
リン酸緩衝生理食塩水 Life technologies14040-133
ポリジメチルシロキサン (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
ScalpelExel Int29552
Scotch tape3M34-8711-3070-3
Silicon waferVWR14672
SU-8 photoresistMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 開発者MicroChemY020100
組織培養フラスコSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
トリプシン中和剤溶液GibcoR-002-100
トリプシン/EDTA 溶液 (TE)GibcoR-001-100
チューブコールパーマーPTFEマイクロボアチューブ、0.012 "ID x 0.030" OD
VE-cadherinサンタクルスバイオテクノロジーSC-6458
機器の名前会社カタログ番号コメント/説明
バイオセーフティ層流フードNuAireNU-425クラスII、タイプA2
CCDカメラ浜松オルカ
共焦点顕微鏡ライカTCS SL
デシケーターBel-ArtF42022
ホットプレートウェネスコHP-1212
インキュベーターForma Scientific3110
Isotemp ovenBarnstead3608-5
リソグラフィーベンチKarl SussMA6 接触式リソグラフィー
光学顕微鏡NikonL200 ND &CCDカメラ用Diaphod 300
シャッターサッター機器ラムダ10-2
プラズマクリーナーPVA TePla/Harrick プラズマM4L/PDC-32G
スピンコーターBrewer ScienceCee 200X
シリンジポンプシステムハーバード装置703005
ソフトウェア名会社名カタログ番号コメント/説明
CADソフトウェアAutodeskAutoCAD 2015
CFDシミュレーションソフトウェアCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
画像はNOプロダクションで取得および分析します ユニバーサルイメージングメタフロー
ック ス

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

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Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

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