パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Summary

光学的透明化技術は、組織の可視化方法に革命をもたらしています。このレポートでは、より一貫性があり、より安価な結果をもたらす元のClear Lipid交換アクリルアミドハイブリダイズド硬質イメージング適合組織-hYdrogel(CLARITY)プロトコルの修正について説明します。

Abstract

>jove_content<伝統的に、組織の可視化は、対象の組織を連続的に切片化し、画像化することを必要とし、各組織切片をユニークな非線形変形にさらし、中枢神経系(CNS)における細胞の形態、分布、および接続性を評価する能力を劇的に妨げていました。しかし、光学的透明化技術により、組織の可視化方法が変わりつつあります。これらのアプローチにより、無傷の臓器調製物を深く調査することができ、健康や疾患における組織の構造構成について非常に深い洞察を得ることができます。CLARITY(CLARITY)は、光散乱脂質を自由に拡散させながら重要な生体分子を結合するマトリックスを提供することで、この目標を達成します。脂質の除去とそれに続く屈折率のマッチングにより、組織は透明になり、3次元(3D)で容易に画像化されます。それにもかかわらず、元のCLARITYプロトコルで使用されていた電気泳動組織透明化(ETC)は、成功裏に実装するのが難しい場合があり、独自の屈折率マッチングソリューションを使用すると、この技術を日常的に使用するのに費用がかかります。このレポートでは、組織の完全性を向上させるためのパッシブCLARITYと、前述の屈折率マッチングソリューションである2,2′-チオジエタノール(TDE)を組み合わせた、シンプルで安価な光学クリアリングプロトコルの実装を示しています。

Introduction

完全な神経解剖学的構造を画像化する能力は、健康と病気における脳を理解するために非常に価値があります。従来、3Dイメージングでは、軸方向の分解能を提供し、深部の解剖学的構造を視覚化するために、組織切片化が必要でした。このアプローチでは、高解像度のデータセットを生成できますが、高度な画像再構築技術が必要であり、非常に手間がかかります。その結果、少量の組織^1〜3のイメージングに限定されてきた。一方、光学セクショニングは、蛍光標識された組織の高解像度3D画像の作成に適しています。光学セクショニングは本質的に 3 次元であるため、3D イメージ ボリュームを生成するために広範な計算は必要ありません。 しかし、光散乱や組織の不透明度により、組織を光学的に切片化できる深さは制限されます。イメージングの深さは、レーザー走査型共焦点顕微鏡では約150μm、2光子励起顕微鏡では800μm未満に制限されています^4-8。

>jove_content<これらの制限を克服するために、最近いくつかの光学的透明化技術が開発され、その後、無傷の組織の深い顕微鏡イメージングを可能にするためにさらに改良されました。固定組織を透明にするためのベンジルアルコールと安息香酸ベンジル(BABB)の使用は、最も初期のアプローチの1つでした⁹。しかし、このアプローチは、サンプル中の蛍光の消光と高有髄構造の不完全な透明化によって制限されていました¹⁰。3D Imaging of Solvent Cleared Organs(3DISCO)などのこの技術の改良により、非常に迅速かつ完全な組織クリアが可能になりましたが、依然として蛍光シグナル、特に黄色蛍光タンパク質(YFP)¹⁰の急速な損失に悩まされています。Sca/e¹¹やSeeDB¹²などの水性清澄化溶液は、蛍光シグナルを保持しますが、高髄組織を完全には清浄にしません。クリアで遮るもののない脳イメージングカクテルと計算分析(CUBIC)は、以前に開発された水性クリアリングソリューション¹³の制限を克服するように見える有望な新しい光学クリアリング技術です。他の光学的クリアリング技術とは対照的に、Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel(CLARITY)¹⁴は、多孔質マトリックスに脳を埋め込み、タンパク質、核酸、および小分子に構造的完全性を提供しながら、脂質を非結合のままにします。その後、脂質は電気泳動で除去され、光学的にクリアされた脳が得られます。これは、簡単に視覚化でき、一般的に利用可能な技術を使用して同様に簡単にプローブできます。

電気泳動組織清算(ETC)は、CLARITYでハイドロゲル包埋組織から脂質を除去するために使用されますが、ETCを一貫して実施することは困難であり、電気泳動の対象となる組織は組織の歪み、褐変、蛍光の喪失、抗体反応性を示す可能性があります。受動的な脂質の透明化はこれらの制限を回避しますが、清算時間を増やす必要があります^15-17。パッシブクリアリングでは、利用可能なETC装置の数に制限されないため、多数のサンプルを並行してクリアすることもできます。パラホルムアルデヒドの濃度を減少させ、ハイドロゲルからビスアクリルアミドを排除すると、より大きな組織拡張を犠牲にして、透明化の速度が大幅に向上した¹⁶。元のCLARITY技術で使用されていた屈折率マッチングソリューションに代わる安価な代替品が開発されました^17-19。2,2'-チオジエタノール(TDE)は、脂質除去中に発生する組織拡張の一部を逆転させる安価で迅速な脳クリアリング剤^です18。このレポートでは、ハイドロゲル包埋組織の受動的透明化と、元のCLARITY技術に対する屈折率マッチングソリューションとしてのTDEの使用を組み込んで、マウス中枢神経系の光学的透明化のための再現性が高く安価なプロトコルを作成します。

Protocol

すべての実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行われました。 THY1-YFP、PLP-EGFPおよびPV-TdTomatoマウスをこれらの実験に使用したが、蛍光タンパク質を発現している任意のマウスは正常にクリアして画像化することができます。

1.組織標本

注意：パラホルムアルデヒド（PFA）とアクリルアミドが毒性と刺激物です。ドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）で、これらの試薬を利用する実験を行います。

1. （ - 3分〜2）呼吸が停止するまでのイソフルラン〜1ミリリットルで安楽死室で動物を生け贄に捧げます。
2. （ - 10分5）血液が組織からクリアされるまで、心臓内に4℃で灌流液（ 表1）でマウスを灌流するために〜5ミリリットル/分に設定し、蠕動ポンプを使用してください。
3. 固定液を灌流液を変更します（ 表1）4℃で首と尾が大幅に補強されるまで（5から10分）。
4. 灌流を終了し、動物を刎ねます。慎重に最初の頭蓋骨を周囲の結合組織を除去した後、頭蓋骨の腹面から骨を除去し^、20で説明したように、（ 図1a）は、脳を持ち上げて、頭蓋骨から脳を解剖します。
   注：小脳の片葉小節のローブと嗅球を周囲の骨の除去に特別な注意を与えます。
   1. 優しく脊髄と脊柱の間の微妙な、鋭いハサミの先端を挿入し^、21で説明したように、離れて個々の脊柱セグメントを切断することにより脊柱から脊髄を解剖。
5. プラスチックマウス脳マトリックス中に配置し、マトリクスの刃で正中線に沿って切断することにより脳を二等分します。
6. 50ミリリットルの遠心分離槽を分離する各半球および脊髄を追加ヒドロゲル溶液（ 表1）~40 mlのエス。この点から前方のすべての後続のステップ中に蛍光団を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーしています。
7. 穏やかに7日間（〜30 rpm）で振とうしながら4℃でヒドロゲル中にサンプルを含むチューブをインキュベートします。

2.重合

1. 遠心管にサンプルと〜ヒドロゲルの25ミリリットルを維持し、ヒドロゲルの〜25ミリリットルを廃棄します。
2. キャップを外し、デシケータージャーに遠心管を配置し、真空に瓶を接続することにより、試料を脱酸素。溶液およびフォームの泡の出てくるために溶存ガスを可能にするために、少なくとも10分間真空を適用します。静かに気泡を取り除くために振ります。
3. 3分 - 2を超える100％の窒素ガスでデシケータージャー内に真空を交換してください。圧力が（デシケータージャーのトップを開くことができたら）等化したら、すぐに酸素の再導入を防止するためのチューブをキャップ。
4. ポリマー重合が完了するまで、3時間37℃の水浴中で試料と管を配置することによってヒドロゲルをIZE。重合ヒドロゲルは、ゲル状のコンシステンシー（ 図1b）にかかります。注意：上部の未重合ヒドロゲルの少量が許容されます。
5. サンプルから過剰なヒドロゲルを切り取った後、遠心分離管から重合サンプルを除去するために、へらを使用します。
6. 無料のワイプリントにサンプルを置き、静かにサンプル上の重合ヒドロゲルの薄層だけを残し、擦れ、その上に組織を圧延することにより、残りのヒドロゲルを削除します。

3.脂質除去

注：脂質クリア組織は壊れやすいので、取り扱いに注意して。チューブを排出する際にサンプルが失われないようにセルストレーナーを使用してください。また、試料は、屈折率整合プロセス中に逆転させることができる膨張が、クリア処理を通じて膨潤します。

注意：SODIUMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およびホウ酸が刺激されています。ドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）とそれらを利用した実験を行います。

1. きれいな50ミリリットルの遠心分離管に重合したサンプルを移し、緩衝液（ 表1）をクリアする45ミリリットルを追加します。穏やかに振とうしながら45℃（〜30 rpm）でインキュベートします。化学廃棄物への使用クリアリングバッファをオフに注ぐ、新鮮なクリアリングバッファの〜45ミリリットルを添加することにより、最初の7日間毎日バッファを変更します。蛍光団を保護するためにアルミホイルで覆われたサンプルを含む遠心管を保管してください。
2. 3日 - 最初の7日後、すべての2〜40°Cと交換決済バッファーでサンプルをインキュベートします。すべての脂質が可溶化され、組織は透明（ 図1c）に達するまでクリアし続けます。マウス脳半球のための6週間と2 - - 脊髄のための4週間これは4になります。
3. 組織がクリアされると、転送新しい50mlの遠心管に試料及び残留SDSを除去するために、24時間にわたって穏やかに振盪（約30 rpm）しながら40℃でPBST（ 表1）で4回洗浄します。

4.分子染色

注意：4 '、6-ジアミジノ-2-フェニル二塩酸塩（DAPI）は、刺激性であり、それを利用した任意の実験はドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）を用いて行われるべきです。

1. きれいな15mlの遠心チューブにサンプルを移し、1×PBST、pH7.5中に1μg/ mlのDAPIで埋めます。 24時間室温（RT）でインキュベートします。蛍光団を保護するためにアルミホイルで覆われたサンプルを含む遠心管を保管してください。
2. 少なくとも6時間/洗浄を室温でPBSTで3回洗浄します。

5.屈折率整合

注意：SH 2,2'-チオジエタノール（TDE）は、刺激性であり、任意の実験は、それを利用しますドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）を行うことがウルド。

1. きれいな15ミリリットルの遠心分離管にサンプルを移し、1×PBS、pH7.5中30％（v / v）のTDEで満たします。 24時間穏やかに振とうしながら40℃（〜30 rpm）でインキュベートします。
2. 1×PBS、pH7.5中63％（v / v）のTDEとの交流30％TDE。穏やかに24時間振盪しながら40℃でインキュベートします。
   注：サンプルは、ほぼ元の大きさに戻って縮小します。
3. 平らな、きれいな表面上のサンプルの厚さよりもわずかに大きい均一な直径を持つシリンダーに再利用可能な接着剤の一部をロールバックします。
4. 40ミリメートルのガラスボトムディッシュにオープンエンド円（上部に小さな開口部を持つ〜25ミリメートル、内径）で再利用可能な接着剤シリンダーを置きます。訂正がなされる必要がある場合は、ガラスからシリンダーを取り外し、カミソリの刃で切断しました。
5. によって、再利用可能な接着剤とガラスとの間にシールを作成するために、P1000のピペットチップを使用してシリンダーの外側リムの周りにそれを転がします。
6. 場所〜100μlの63％のガラス皿の上にTDEと再利用可能な接着剤の円内のガラス表面を覆うように周りに広がります。
7. へらを使用して、慎重に気泡を形成しないように注意しながら、円の真ん中にサンプルを配置します。
8. サンプル上に直接63％TDEの別の100μLをピペットで、その後すぐに再利用可能な接着剤の上に40ミリメートルの円形のカバーガラスを配置します。
9. カバーガラスが試料と接触したまでインデックス、中央、及び両手の薬指を使って、慎重に円形の周囲を押します。
10. ゆっくりと、表面に支え直立位置にガラスボトムディッシュをもたらすソリューションは、上部に小さな開口部に到達するまで、ピペットを用いて63％のTDEを追加します。無料のソリューションは、ガラス上に滴下しないようにピペットチップをオフに乾燥するためにワイプ糸くずを使用してください。チャンバー内の気泡を回避するために、ピペットのすべての方法を空にすることはありません。
11. に小さな開口部は、円を囲み、閉鎖チャンバーを作成するために、シリコンエラストマーを追加します。それは撮影前に乾燥するのを5分待ってください。

6.顕微鏡

注意：共焦点、単一平面照明と光シート顕微鏡で使用されるレーザーは非常に強力であり、失明を引き起こす可能性があります。レーザーを利用した任意の実験は、広範囲の訓練の後、大きな注意し、適切な眼の保護を行うべきです。

1. レーザー走査共焦点顕微鏡のステージ上の内部サンプルとイメージング室を配置します。
2. イメージングソフトウェアを開きます（材料の表を参照してください）​​。アルゴン励起レーザーをオンにするには、その後、プログラムのレーザアイコンの上部にある[設定]タブをクリックします。レーザーの電源を入れて、30％にスライドスケールを移動させるために、アルゴンの横にあるボックスをチェックします。選択された位置まで温め、ゆっくりとポインタを守ってください。
   1. 上部の取得]タブに戻ります。大きなボックスに「ビーム経路の設定＆＃34; /負荷に行くボックスを設定保存し、画像YFP（527 nm）のに適した波長チャネルを選択するドロップダウンメニューを選択します。
3. チャネルの設定]ボックスの下：「現在のオブジェクトの目的」というラベルの付いた赤いハイパーリンクを配置することにより、イメージングのために適切な目標を選択します。タブをクリックすると、すべての利用可能な目標を開き、選択がタレットを自動的に回転します。
   1. 使用目的（ 例えば 、10倍）大きい作動距離（組織の厚さよりも大きいが、画像化される、 例えば11 mm）とし、大きな開口数（ 例えば 、0.3）を有する面内画像の解像度を最大にし、最小限にします光学部の厚さ。
4. 1,024×1024または目的の横方向の解像度の限界に適した値に、「フォーマット」と呼ばれる、取得行列を設定するには：「解像度XY」ウィンドウのドロップダウンメニューの左の欄には、開きます。 （可能な限り低いズーム倍率を設定し、例えば 、1。7）。
5. 同じウィンドウでは、それに応じて個別に標識されたメニューをドロップダウンすることにより、8ラインの平均値と1フレーム平均パラメータを設定します。高い信号対雑音比と迅速な取得のための小さな値の大きい値を使用してください。
   注：8ラインの平均値と1フレームの平均は約4時間で、マウスの脳半球の高品質な画像を取得します。
6. ステージコントロールを使用してサンプルを探します。代表的なフィールドが表示されたら、ゲインとオフセットを設定します。
   フルオロフォア、ゲインとオフセットは、組織の種類に基づいて、実質的に変化し、および/または画像化される解剖学的特徴：注意してください。 YFPの場合、オフセット用のゲインおよび-1.0から-1.5まで、760から780に値を設定します。
7. 「タイルスキャン」を選択し、関心領域の境界を選択します。 zスタックの設定上限値と下限値を取得します。目的の光学部の解像限界に基づいて、光学部の厚さを設定します。
   注：目的の光学部の解像限界は、主に、その開口数によって定義されます。ほとんどの顕微鏡制御ソフトウェアが自動的に使用されている目的のために適切な値を計算します。約11ミクロンとなる0.3の開口数の10倍の対物レンズのため。
8. 取得を開始します。
   注：これは、複数の時間がかかることがあります。
9. 関心の特定の領域から高倍率の対物レンズを使用して、より高い解像度の画像を収集します。

Results

脳の構造組織の可視化形態との接続が健康と病気で脳機能にどのような影響を与えるかを理解するために重要です。光学決済技術は、私たちが凝集的形態との接続性を研究することができ、無傷の組織における3次元の画像細胞集団にことを可能にします。

細胞の亜集団のための特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を発現するマウスは、脳内の神経接続の複雑なパターンを離れていじめるために1つを可能にします。これらのマウスは、脳（ 図2aおよびb）は、投影大脳皮質と海馬に存在する神経細胞、ならびに他の構造体のサブセットにおいてYFPを発現するので、THY1-YFPトランスジェニックマウスは、光学的透明文献において広く使用されてきました。さらに、YFP ⁺皮質層Vのニューロンは、s内の皮質脊髄路を通って突出しますpinalコード（ 図2c＆D）、皮質ニューロン¹⁵

Discussion

ハイドロゲル包埋組織（パッシブCLARITY）の受動クリアは組織の大部分をクリアするための簡単​​で安価な方法です。このアプローチは、専用の設備を必要とせず、容易に温度制御シェーカー中で行うことができます。数週間のスパンで、このような脳全体または脊髄などであっても大規模な、非常に有髄組織は、顕微鏡検査のために透明性と適切ななります。このレポートは、CNS組織の清算に焦点を当てているにもかかわらず、受動CLARITYは、任意の組織に適用することができます。

光学決済技術の相対的な長所と短所は^、文献^13,17,22で、以前に議論されてきたが、ほとんど明らかに²³にレイアウトされています。受動CLARITYは、多数のサンプルが同時にクリアされ、再現性が非常に重要である実験のために適しています。組織に追加の支持を提供するために、ヒドロゲルを使用することは、Mを容易に組織のプロービングultiple。この報告書では、小分子量染料、DAPIは、実証されたが、抗体検査の複数のラウンドは、このアプローチでも可能です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Fisher	BP399-1	緩衝液
32% パラホルムアルデヒド (PFA)	電子顕微鏡科学	15714-5	灌流およびヒドロゲル
2,2'-チオジエタノール (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	屈折率マッチング溶液
40% アクリルア	ミド Bio-Rad	161-0140	ハイドロゲル
2% ビスアクリルアミド	Bio-Rad	161-0142	ハイドロゲル
VA-044 開始剤	和光純薬工業(株)	VA044	ヒドロゲル
ホウ酸	Sigma-Aldrich	B7901	クリアリングバッファー
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	フィッシャー	BP166-5	クリアリングバッファー
水酸化ナトリウム	フィッシャー	55255-1	バッファー
アジ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	52002-100G	防腐剤
トリトン X-100	シグマ・アルドリッチ	X100-500G	緩衝液
ヘパリン	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	灌流
硝酸ナトリウム	フィッシャー	BP360-500	灌流
DAPI	分子プローブ	D1306	核染色
99.9% イソフルラン	フェニックス	57319-559-06	麻酔薬
ヒドロコロリン酸	フィッシャー	A1445-500	緩衝液
ガラス底皿	Willco	HBSB-5040	Willco皿
再利用可能な接着剤	ボスティック	371351	ブルータック
シリコンエラストマー	ワールド精密機器	KWIK-CAST	Kwik-Cast
糸くずの出ないワイプ	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
マウス脳マトリックス	Roboz	SA-2175	切片組織
マトリックスブレード	Roboz	RS-9887	切片組織
蠕動ポンプ	コール・パーマー	77122-24	pefusion
レーザー走査型共焦点顕微鏡	ライカ	SP5	顕微鏡
イメージングソフトウェア	ライカ	LAS	AF顕微鏡