このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

8.4K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/54026

⸱

2016年6月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

この記事について

サマリー

患者由来の多形性膠芽腫の異種移植片は、3Dヒトバイオゲル培養システムを使用して生きた微小腫瘍に小型化することができます。このin vivo様3D腫瘍アッセイは、薬物反応試験やキノミクス解析を含む分子プロファイリングに適しています。

要約

患者由来の異種移植片の使用は、がんの生物学と薬物反応性に関する重要な洞察を提供しました。しかし、それらは時間と費用がかかり、労働集約的です。これらの障害を克服するために、多くの研究グループががん細胞のスフェロイド培養に目を向けています。腫瘍スフェロイドまたは凝集体は有用ですが、in vivoで見られるような細胞-マトリックス相互作用を複製しません。そのため、細胞外マトリックスの足場を利用した3次元(3D)培養アプローチは、より現実的な研究モデルシステムを提供します。皮下または頭蓋内の異種移植片から開始して、腫瘍組織は癌幹細胞ニューロスフェアに似た単一細胞懸濁液に解離します。その後、これらの細胞をヒト由来の細胞外マトリックスである3Dヒトバイオゲルに埋め込み、多数の微小腫瘍を作製します。興味深いことに、微小腫瘍は高い生存率で約1ヶ月間培養することができ、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)などの標準的な細胞毒性アッセイを用いた薬物反応試験や、カルセイン-AMを用いた生細胞イメージングに使用することができます。さらに、免疫組織化学によって分析したり、アレイベースのハイスループットキノミクスプロファイリングなどの分子プロファイリングのために回収することもできます(これについてもここで詳しく説明します)。したがって、3D微小腫瘍は、従来のアプローチよりもin vivo腫瘍生物学をより密接に再現できる、汎用性の高いハイスループットモデルシステムを表しています。

概要

最も一般的な原発頭蓋内悪性脳腫瘍は、グレードIII星状細胞腫およびグレードIVの多形性膠芽腫 （神経膠芽腫またはGBM）です。米国1-3でGBMに対する現在の治療と15ヶ月-これらの腫瘍は、12の間の中央値1年生存率と予後不良を提供しています。マルチモダリティ療法は、テモゾロミド（TMZ）およびキナーゼを標的とする薬剤を含む外科手術、放射線、および化学療法が含まれます。キナーゼシグナル伝達は、頻繁に上皮成長因子受容体（EGFR）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）の増加、シグナリング、増加したホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）とにおける増幅を有する腫瘍のサブセットまたは活性化変異を含む、GBMで調節不全されます血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、ならびに他のキ ​​ナーゼ駆動経路4-6を介して血管新生シグナル伝達を支援する腫瘍。 in vitroおよびin vivoモデルで現在は頻繁にこれらの代表的な変化を失います 7。さらに、遺伝的プロファイリングは、遺伝的およびエピジェネティックな変化は常に標的剤、ほとんどのキナーゼが直接作用するタンパク質活性のレベルで変化を予測せず、他の作用機序を持つ治療法がどこに作用することができるという事実を反映している可能性が予想される利益を提供していません間接的に。

無限に継代することができる伝統的な不死化細胞株は、長いによるメンテナンスや再現が容易に薬物検査のための標準となっています。しかし、このモデルは、高速、元の腫瘍から大きく異なる細胞を増殖させるための選択の高い栄養素（人工）成長環境に苦しんでいます。このように、患者に存在するように、より複雑な腫瘍生物系を反映する、より現実的なモデル系を開発することにかなりの関心が集まっています。腫瘍異種移植片は、マウスで増殖させた原発腫瘍（「xenoline、「患者由来の異種移植片またはPDX）専らから直接開発しますそれらは、より確実に臨床的成功を予測することが8以上の反射生物学にもかかわらず感じられるようにデは、特に癌治療の設定で複数の反射モデル系は、これらのモデルは、高価であり、確立し、維持するのが困難です。さらに、それらは、ハイスループット試験に適していません。より良い、より正確に原発腫瘍の分子変化を反映して、遺伝子マーカーの代理、キナーゼ活性の直接的尺度を使用して、これらのモデルをしないプロファイルおよびテストするために生物学的モデルを開発する必要性が、明らかです。

よく、二次元（2D）単層培養とは異なり、3次元または多分析モデルは、より生理学的に関連するエンドポイント9-11を提供することができることが認識されます。一般的な3D培養手法は、マトリックスコートしたマイクロキャリアおよび細胞スフェロイド形成を伴います。腫瘍スフェロイドは、スピナーフラスコのpHEMA板と懸滴技術を使用して細胞凝集を介して生成することができます。トンの制限事項HESEアプローチは、次のとおりです。安定したスフェロイドを形成するためにいくつかの細胞のための不能、混合細胞型と成長と課題の変動を。あるいは、合成（ハイドロゲル、ポリマー）およびマウス肉腫から動物由来エンゲル・ホルム-スウォーム（EHS）行列多く、ウシコラーゲン）行列は3D培養のために開発されてきた12-14を研究しています。マウスEHSマトリックスは、広く使用されるが、in vitroおよびin vivo 15細胞の増殖および分化を促進することが知られています。

3D腫瘍生物学を複製するためには、人間のバイオマトリックスシステムは、博士のRaj Singh氏らによって開発された。16。 天然の、成長因子を含まないヒトのバイオゲルは、複数の細胞型の長期培養をサポートする3D培養の足場（ビーズ、ディスク）を可能にします。 3Dヒトバイオゲル培養設計のシリーズは、腫瘍増殖、接着、血管新生および浸潤特性を研究するための確立されています。利点と人間のバイオゲルのプロパティ共通に比べて、マウスEHSゲルは、表1および表2にまとめます。

ソース： 人間Amnions（プールされた組織）
病原体を含まない、IRB-免除/承認
ECMの性質： 非変性バイオゲル （GLP-生産）
キー
コンポーネント： 		COL-I（38％）、ラミニン（22％）、COL-IV（20％）、COL-III（7％）、エンタクチンおよびHSPG（<3％）
GF-フリー： 検出不可能 EGF、FGF、TGF、VEGF、PDGF（非血管新生性、非毒性）

表1：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルのプロパティ。

人間バイオゲル EHSゲル
人間の自然な行列再構成されたマウスの行列
制御された細胞増殖＆分化細胞増殖＆分化を促進することができます
生理学的遺伝子発現可変遺伝子発現
3D組織様培養モデルプレートベース培養モデル

表2：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルの利点。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

注：すべての異種移植療法の評価は、施設内動物管理使用委員会により承認されたプロトコルに神経膠芽腫のための同所性腫瘍モデルを使用して行きました。

患者由来のGBM異種移植細胞の1の単離

  1. 試薬の調製
    1. 5 mg / mlとし、滅菌フィルターの濃度になるように滅菌水にコラゲナーゼIを再構成しています。 -20℃で1ミリリットルの分量を保存するには、（最終濃度は、100ミリリットルの酵素溶液中の50μg/ mlです）。
    2. 2mlの100μgの上皮成長因子（EGF）を溶解し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 100μlの（5μgの/100μl）を10ng / mlの最終濃度のために-20℃でアリコートで保管してください。
    3. 2ミリリットル滅菌PBS中の100μgのFGF-βを溶かします。 100μlの（5μgの/100μl）を10ng / mlの最終濃度のために-20℃でアリコートで保管してください。
    4. 神経基本メッドの1 500ミリリットルのボトルに以下を追加します。完全NBMを準備するIA（NBM）：ビタミンAなしの10ミリリットルのB-27サプリメント、5ミリリットルN2サプリメント、100μlのEGF、100μlの線維芽細胞増殖因子（FGF） - 基本、5ミリリットルアムホテリシンB、0.5ミリリットルゲンタマイシン、5ミリリットルL-グルタミン。
    5. 組み合わせることによって、新鮮な酵素溶液を準備します98.5ミリリットルのPBS、1ミリリットルのコラゲナーゼ-1、0.5ミリリットル10×トリプシン/ EDTAおよび0.22μmの細孔のフィルターで濾過滅菌します。
    6. 準備または少量の滅菌ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、カルシウムまたはマグネシウムなしで、7％ウシ胎児血清（FBS）および1×PBSで/ F12細胞培養培地を得ました。
  2. 腫瘍の脱凝集
    注：以前に触知可能な腫瘍塊からに右脇腹に腫瘍細胞を注射し、許可された無胸腺NU / NUマウスは、この手順のために必要です。ここに示した例では、我々は、患者由来の異種移植GBM細胞、JX10とJX12 17を使用していました。
    1. 2％クロルヘキシジンを噴霧することにより、作業領域を殺菌し、作業領域のウィットを設定使い捨てチャック、鉗子、メス、ガラスシャーレ、酵素液、PBS、およびクロルヘキシジンなどの時間に必要な機器/用品（ 図2Aを参照してください）。
    2. フランク腫瘍を保有するマウス/マウスを安楽死させます。 30％のCO 2を用いて、CO 2の20％/分の変位速度を目指します。マウスは呼吸停止を示した後、約1分（典型的には3分の合計）のためのCO 2流れを維持します。マウスをチャンバーから除去され、頸椎脱臼は、二次安楽死確認として実行されます。皮膚を消毒するために、3％クロルヘキシジンで動物をスプレーします。
    3. マウスは着実に保持しながら、作る半円形の皮膚切開〜腫瘍塊に頭蓋始めとする周りのマウスの腹に向かって切開し、＃11の刃で滅菌使い捨てメスを用いて腫瘍塊（脇腹移植した腫瘍）から1.5センチメートル尾方端。
    4. 切開の尾方端に優しい牽引して指を用いて腫瘍塊上の皮膚を反映した後、皮膚に押し腫瘍に触れることなく最適なアクセスを持っている腫瘍を上昇させる面 ​​（ 図2Bを参照してください）。
    5. （ 図2Cを参照してください）腹膜壁からと皮膚からそっと無料腫瘍塊をピンセットで鈍的切開を使用してください。
    6. 滅菌ガラスシャーレ（ミンチ時の破壊を防止するためにプラスチック製の食器を使用しない）に鉗子を用いて腫瘍塊を移し、適切に死体を捨てて、脇にこれらの機器を配置します。
    7. 壊死組織と腫瘍をカバーする膜状のホスト結合組織の腫瘍組織を創面切除する（＃11ブレード、半湾曲した鉗子でメス）滅菌機器の新しいセットを使用してください。
    8. 攪拌棒を備えた無菌通気、トリプシン処理フラスコ中で15ミリリットル酵素溶液を置き、フード中でゆっくり攪拌し始めます。
    9. （注ぐまたはPBSでそれらを洗浄するために注射器を使用してもよい）、過剰な血液を除去するために滅菌PBSで5回 - 滅菌ガラスシャーレでは、3を収穫した腫瘍を洗います。ゆっくり料理やピペットを傾けたり、洗浄材料を吸引。ミンチFinely 2＃11手術用メスの刃を使用して（ 図2Dを参照してください）。
    10. 3回 - 優しく上下ミンチ腫瘍およびピペットに2を酵素液の14ミリリットルを追加します。転写混合物は、フラスコをトリプシン処理、ガス抜きし、20分間ゆっくり撹拌します。ステップ1.2.11でトリプシンを中和するために、それぞれに1.5ミリリットルのFBSを添加することにより、5 50mlコニカルチューブを準備します。
    11. 20分後、トリプシン処理フラスコから細胞溶液の14ミリリットルを収集し、FBSを1チューブに追加します。フラスコ、攪拌を継続する14ミリリットルの新鮮な酵素溶液を追加します。
    12. 遠心分離機は、室温で8分間、150×gで細胞を採取し、上清を捨てます。 、ペレットに完全NBMの45ミリリットルを加え穏やかに混合し、血清をすすぐために遠心分離を繰り返します。 5ミリリットル完全NBMでペレットを再懸濁し、氷上に保持します。
    13. 氷の上の単一のコニカルチューブ内のすべての収穫細胞を組み合わせ、5収穫の合計のための細胞収穫の手順を繰り返します。
    14. 50ミリリットルコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーを配置します。準備トン彼を通してDMEM / F12 + 7％FBSを10mlを通過した後、10mlのPBSで洗浄することにより、ストレーナを細胞。
    15. ゆっくりと、それは（ 図2Mを参照）を介して滴下することができ、ストレーナに細胞懸濁液を追加します。静かに任意の真空を破壊し、懸濁された細胞が自由に通過できるようにする新しい各添加の間にセルストレーナーのタブを持ち上げ（ 図2Nを参照してください）。
    16. 上記のように濾過した細胞懸濁液を遠心します。完全NBM 10mlに再懸濁し、0.04％トリパンブルーおよび血球計数器を用いて、生存細胞の総数を決定するためにカウントされます。 microtumor世代まで、氷上で細胞を保持します。

2.代替組織脱凝集プロトコル

  1. 自動化された組織の解離および分解システム。
    1. プログラム「腫瘍_02_02」と押してスタートを選択して、32秒間実行し、携帯解離に分解チューブを置きます。トランスファーチューブを40分間37℃のインキュベーター中で、場所をローテータします。
    2. 遠心分離は、室温で8分間、150×gで細胞を懸濁し、上清を捨てます。細胞を遠心分離しながら、細胞懸濁液を処理するための試薬を設定します。 10ミリリットルの無血清NBMと軽く粉砕物の懸濁液を追加します。
    3. 30×10 6生細胞（〜0.3ミリリットル） -遠心分離の後、〜10を含む細胞ペレットを得ました。 （ 図2Oを参照してください）10ミリリットルの無血清NBM中でペレットを再懸濁しました。 （ステップ3.2.2を参照）排除アッセイにより生存細胞を決定します。

3. Microtumorジェネレーション

  1. 試薬の調製
    1. 内部プロトコルごと（3 mg / mlとでHDHG）1.1.4のように完全なNBMを準備し、中和高密度人間バイオゲル（HuBiogel）を準備します。同様のバイオゲルマトリックスを使用することもできます。
  2. Microtumor生産と文化
    1. 氷の上で完全NBMにおける単一細胞懸濁液としてたて解離PDX細胞を得ます。
    2. セルのsuを混ぜますトリパンブルー溶液（PBS中0.4％）との等体積とspensionは、トリパンブルー排除18により、細胞数および生存率を決定するために、血球計を用いて分析します。 50,000個の細胞を生成するのに必要なボリュームを削除/ microtumorここで、体積=（50,000細胞/腫瘍*＃腫瘍）/（生存細胞は/ 1ミリリットルをカウント）し、新鮮なコニカルチューブに配置します。
    3. 室温で、8分間、150×gでの遠心分離により細胞を濃縮します。上清を捨て、FBSで1部の細胞と4部HDHGの最終比で氷冷HDHG溶液で細胞ペレットを再懸濁します。
    4. 微小腫瘍（2ミリメートルビーズ50,000個の細胞を含む各）を生成する（疎水性コーティング付き）96ピン鋼板上にピン細胞HDHG混合物あたり10μLを分配するために、電子マルチチャンネルピペットを使用してください。
    5. ビーズをゲル化するために15分間組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、加湿）の内部3D腫瘍ビーズを置きます。
    6. ゲル化した後、（10μを微小腫瘍を転送;電子マルチチャンネルピペットおよびカスタムピン・デバイスを使用して完全NBM含むカスタム懸濁培養チャンバー（50ml）で、または大量培養皿（10センチリットル））。
    7. 1後 - 組織培養インキュベーター中で2日間、50μlのNBM /を含む96ウェル培養プレートに伝達微小腫瘍は十分広口分注ピペットを使用して、様々なアッセイおよび分析プロトコルを実行します。
  3. 微小腫瘍の薬物治療とメンテナンス
    1. 薬物検査のための最終的な濃度を選択します。
      注：薬は、2D培養で有効性を知られている中用量濃度として2倍のIC 50を選択し、5用量レベルの合計の上下に3倍連続希釈液を選択した場合。例えば、IC 50は、2D培養での薬物について9μMである場合、2μM、6μM、18μM、54μM、および薬物検査のための最終的な濃度として162μMを選択します。
    2. ジメチルsulfoxiから完全NBM中で2回薬物投与溶液を準備しますド（DMSO）ストック。 5用量、3倍連続希釈物を調製し、1％DMSO媒体に投薬溶液を希釈します。
    3. 0.5％の最終DMSO濃度を達成するために、ウェルアッセイプレート中で50μLを含むmicrotumorに投薬溶液50μlを加えます。 3.3.1で決定された各薬剤の投与量で各反復（ 例えば、4）のために繰り返します。
    4. 14日- 1、37℃、5％CO 2、加湿した組織培養インキュベーター中で培養を維持します。上記のようにメディアや薬液をリフレッシュすることにより、週二回フィードの文化。

4.形態および微小腫瘍の表現型分析

  1. 標準的な生細胞染色を用いて微小腫瘍における細胞形態を決定します。
    1. DMSOにカルセインAMの1 mMストックを準備します。 -20℃で小分けし、店舗。
    2. 希望の文化間隔（1、7、および14日）で、最終濃度1μMのために96ウェルプレートに（のCa / Mgを含まない）PBSで調製したカルセインAM溶液を添加。
    3. インキュベート37℃、2X、4Xの蛍光顕微鏡を用いて5％CO 2、加湿インキュベーター、そして画像、20分および10×（励起450 - 490nmのバンドパス、発光：515 nmのロングパスダイクロイック500 nm）を。
  2. Microtumor成長/増殖アッセイ
    1. 12 mMストックを準備する（カルシウム/マグネシウムなし）、PBS中のMTT粉末を溶かします。滅菌フィルター、アリコートし、-20℃で保存。
    2. 所望の培養間隔（1,7、および14日目）に、100μlの培養体積あたりの96ウェルプレートにMTT溶液20μlを加えます。組織培養インキュベーター中で2時間インキュベートします。
    3. 0.01 M HCl中10％SDSの新鮮な溶解液を調製し、プレートに培養体積に等しい量を追加します。一晩37℃のインキュベーター中で密封されたプレートをインキュベートします。
    4. マルチプレートリーダーを用いて570nmで吸光度を読み取ります。
  3. Kinomic分析のためのMicrotumor準備
    1. プロ100Xの各100比：4℃に予備冷却した後、1を加えることにより溶解緩衝液を調製しますテインホスファターゼ阻害剤（PPI）と100×タンパク質プロテアーゼ阻害剤（PI）。よく混合し、氷上に保ちます。
    2. 転送3 1.5ミリリットルマイクロチューブのそれぞれに2微小腫瘍。上清を除去し、4℃で30分間、各チューブおよび溶解にPPIとPIを含む溶解緩衝液40μlを添加します。
    3. ピペットサンプルを激しく腫瘍ビーズを破壊します。 kinomic分析まで-80℃で4℃、店舗のサンプルで10分間16,000×gで遠心分離します。

微小腫瘍の5 Kinomicプロファイリング

  1. タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）プロファイリング
    1. プロファイリング上の位置＃2のシリンジに4°C負荷PKバッファー（2.7ミリリットルのdH 2 Oで300μlの10倍PKバッファーストック）に解凍した試薬（10×プロテインキナーゼ（PK）緩衝液および2％ウシ血清アルブミン（BSA））プラットフォーム。
    2. キナーゼアッセイのソフトウェアプログラムを開き、PTKプロトコルファイルおよびプレスを読み込む「START」、SOFTW内のサンプルに注釈を付けますチップをスキャンした後のプログラムです。場所チップアレイあたり2％ウシ血清アルブミン（BSA）のプラットフォームと負荷25μLをプロ​​ファイリング上に、その後はステップを遮断するソフトウェア制御プロトコルを開始するためにLOADを押してください。
    3. 10mMのアデノシン三リン酸（ATP）を作るために54μlののdH 2 Oで100 mMのATPの株式の6μMに希釈します。ソフトウェアは3 番目 、および最終洗浄工程（画面に表示）開始すると、溶解液15μgのがのdH 2 Oで28μlに育て持参ミックスし、配列に追加します。
    4. （最大12サンプル用）PTKマスターミックス（MM）を準備します。 （すでに60μlの10倍のBSAを含む）のジチオスレイトール（DTT）を再構成し、PTK-MM1チューブに、6μlのDTT、および60μlの10倍PKソリューションを追加するために、32.6μlののdH 2 Oを追加します。
    5. その後、126 PTK-MM1のμlを、60μlのPTKの添加剤などを追加表示されキナーゼアッセイソフトウェアの「ロード」プロンプトになるまで待って60μlの10 mMのMM2へのATP（4.5μlのPY20 FITC抗体を等分し、以前に含まれています）と混ぜます。各サンプル溶解液チューブとピペットミックス5回にこのPTKマスターミックスの16μLを加えます。
    6. カバーガラスがきれいであることを確認し、その後、35μlの溶解液/アレイ、近いカルーセル蓋、プレスLOADボタンごとにマスターミックスを追加します。
  2. セリン/スレオニンキナーゼ（STK）プロファイリング：
    1. 融解試薬（10×PKバッファ、10×STK緩衝液、2％BSA）4℃です。シリンジ位置＃2にシリンジ位置＃1 1:10およびSTKバッファー（2.7ミリリットルのdH 2 0で300μlの）にロードPKバッファー（2.7ミリリットルのdH 2 0で300μl）を。
    2. キナーゼアッセイコンピュータソフトウェアプログラムを開き、STKプロトコルファイルとプレスSTARTを読み込み、チップをスキャンした後、プログラム内のサンプルに注釈を付けます。アレイあたり2％BSAのプラットフォームと負荷25μLをプロ​​ファイリングし、手順を遮断するソフトウェア制御プロトコルを開始するために、LOADを押して上に置きチップを。
    3. 54μlのをdH 2 Oで100 mMのATPの6μMを希釈最後の（ 第3）洗浄ステップミックスの間に溶解物を2μgのと、のdH 2 Oで32.6μlに持ち出す混合し、配列に追加します。
    4. STK-MM1チューブに70μlの10倍PKを追加します（7μlの100×BSAを含有する）、その後、STK-MM1チューブに42μlののdH 2 Oを追加：STKマスターミックスを作成します。
    5. その後、キナーゼアッセイソフトウェアの「ロード」プロンプトになるまで待ち：STK-MM1に18μlの10 mMのATPを追加し、各サンプル溶解液に9μlのMM1を追加します。よく混ぜます。
    6. カバーガラスがきれいであることを確認し、配列、近いカルーセル蓋、およびプレス荷重あたり35μlの溶解液/マスターミックスを追加します。
    7. ファイナル（ 第3）洗浄工程の間に DMAB管に1.05μlのSTK-FITC二次抗体を追加（3.03μlのSTK一次抗体ミックスが含まれている）、DMABに39.6μlのABバッファを追加し、DMABに356.0μlののdH 2 Oを追加し、各アレイにDMABに30μlを添加し、プレス荷重。
  3. Kinomicデータ19,20の分析
    1. 解析ソフトウェアを開き、画像解析アプリケーションをロードします。セ択画像PTKまたはSTKデータ、選択の資料番号マッチしたアレイレイアウトファイル（STKのためのPTKのための86312および87102）用のバーコードとタイムスタンプ付きの配列全体の画像を含むフォルダ、および負荷は、以前、アレイアノテーションファイルを生成しました。
    2. すべての画像の正しいグリッディングを確認し、アプリケーションをスケーリング露光時間を実行します。統計的に露出/スロープLOG2変換された値を比較し、予備洗浄運動曲線19-21で検証します。
    3. 上流のキナーゼ22,23のための条件との間に変更されたkinomicプロファイルを照会する上流キナーゼ予測ソフトウェアを実行します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

我々は、3Dバイオゲル培養系は、複数の細胞型の長期的成長と機能をサポートしていることを示しています。この共同プロジェクトでは、患者由来のGBM xenolines（PDX）は微小腫瘍の数百を製造するために使用されています。解離した細胞（3×10 5）またはニューロスフェア（40 - 50）バイオゲルビーズ（2mm）に包埋し、迅速なゲル化した後、それらはNB-媒体充填カスタムバイオリアクター中で培養されます。細胞生存性（カルセインAM）、増殖プロフィール（MTT）、およびkinomicアクティビティアレイベースの分析を測定しました。 PDXの微小腫瘍は> 3週間の多細胞組織と高い生存性（> 80％）を維持しました。我々は、このin vivoでの様生物学は、3D細胞-マトリックスアーキテクチャのメンテナンス（2Dまたはスフェロイド文化を持つことはできません）が原因であると考えています。また、3D腫瘍はおそらく、コラーゲンI 14がないため、脆弱なゼラチン状タンパク質足場と製造が困難であることが観察されま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップは、主に世代をmicrotumorに関連するだけでなく、薬剤投与とメンテナンス。 microtumorビーズが壊れやすく、簡単に引き裂かれたので、細心の注意をアッセイおよびメンテナンスの発達段階の両方で必要とされます。エラーがこれらのプロセスのいずれかの間に発生した場合は、実験的な解釈は、拡張機能や実験の不必要な繰り返しやデータのさえ排除を引き起こし、妥協することができます。

特にmicrotumor開発プロセスの修正およびトラブルシューティングは、microtumorビーズを作るのに使用するためのカスタム疎水性ツールの設計と製造が含まれていました。このツールは、微小腫瘍のより速く、より正確な製造を可能にします。さらに、微小腫瘍の維持に小さな修正は培地を交換し、細胞を投与するプロセスをスピードアップするのに役立ちました。これらの変更のいくつかが含まれるが、マルチチャネルを使用して、これらに限定されないました96ウェルプレートから培地を除去し、交換する電子ピペットと予備混合新鮮な薬剤ソリューションを投与し、対応する2ミリリットルの96ウェルプレートで2倍の...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

R.S.とR.S.S.は、Vivo Biosciencesの従業員です。J.C.A.は、UABキノメ・コアから一部資金提供を受けています。

謝辞

（：C.ウィリー、CA185712-01 PI）、脳腫瘍SPORE賞（PD：GYギレスピー、P20CA 151129から03）とSBIR契約（PI：R.シン、N43CO-2013から00026）NIH R21グラントによってサポートされています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コラゲナーゼ-I Sigma-AldrichCO130
トリプシン EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 SupplementLife Technologies17502-0481x 最終濃度
B-27 サプリメント ビタミン A なしLife Technologies12587-0101x 最終濃度
組換えヒト FGF-basicLife TechnologiesPHG026610 ng/ml 最終濃度
組換えヒトEGFLife TechnologiesPGH0315 10 ng/ml 最終濃度
L-グルタミンCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM 最終濃度
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 µg/ml 最終濃度
ペニシリン ストレプトマイシンオメガサイエンティフィックPS-20100 U/ml ペニシリン G, 100 & マイクロ;g/ml ストレプトマイシン最終濃度
ゲンタマイシンLife Technologies15750-06050 ng/ml 最終濃度
MTTLife TechnologiesM6494を PBS で 5 mg/ml まで調製し、滅菌ろ過、ウェル
SDSFisherBP166MTT 溶解バッファー用に調製し、0.01 M HCl、5%
HClFisherA144SI-212MTT 溶解バッファー用、0.01 M (SDS 付き)、5 mM (井戸内
Calcein AMLife TechnologiesC1430mM (DMSO ストック)、2 &マイクロ;PBS染色液中のM、1 &マイクロ;Mはよく
止まった's プロテインホスファターゼ阻害剤カクテル Pierce ThermoScientific784201:100 比率 (MPER)  
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce ThermoScientific877861:100 比 in MPER
哺乳類タンパク質抽出試薬 (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231セイン AM & 化合物
Ca/Mg ロンザを含まないリン酸緩衝生理食塩水の溶解17-517QMiliQ 超純水で 1x に希釈し、滅菌ろ過 (細胞培養用)
Dulbecco's Phosphate-Buffered 生理食塩水 Ca/MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CV1x に希釈 MiliQ 超純水 (事前固定洗浄用)
10% 中性緩衝ホルマリンプロトコル032-060
トリパン ブルーピアス ThermoScientific15250-061
高密度 HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt's Protein Phosphatase InhibitorPierce78420
Halt's Protein ProteaseInhibitor Pierce87786
哺乳類タンパク質抽出試薬 (MPER)Thermo Scientific78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chipPamGene86312
PTKキナーゼバッファーPamGene36000300 µl 2.7 ml dH2O、PTK試薬キット用カタログ番号
ATPPamGene36000PTK試薬キット用カタログ番号
PY20- FITC標識抗体PamGene36000PTK試薬キット用カタログ番号
PTK添加剤PamGene32114
PTK-MM1チューブ(10x BSA)PamGene36000PTK試薬キット
用カタログ番号セリン/スレオニンキナーゼ(STK)アレイプロファイリングチップPamGene87102
STKキナーゼバッファーPamGene32205STK試薬キット用カタログ番号
STK一次抗体ミックス(DMABチューブ)PamGene32205STK試薬キット用カタログ番号
FITC-標識二次抗体PamGene32203
STK-MM1チューブ(100x BSA)PamGene32205STK試薬キット用カタログ番号
STK抗体バッファーPamGene32205カタログ番号 STK試薬キット用
機器
#11 ブレード、滅菌済みフィッシャー3120030
#3 メスハンドル、滅菌済みフィッシャー08-913-5
100 mm ガラス製シャーレフィッシャー08-748D
半湾曲鉗子フィッシャー12-460-318
トリプシンフラスコフィッシャー10-042-12B
マグネチックスターラーフィッシャー14-490-200
3/4 "攪拌子フィッシャー14-512-125B-D
細胞ストレーナー Fisher#352340
B-D 50 ml 遠心分離管Fisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 キノミクス解析ソフトウェア PamGene
Evolve キナーゼアッセイソフトウェアPamGene
UpKin アプリソフトウェア (アップストリームキナーゼ予測)PamGene
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
ロータリー細胞培養システム (RCCS)SyntheconRCCS-D10 ml ディスポーザブル HARV
で 1 mg/mL を 中 ) 1 カル で

参考文献

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

3D MTT
Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。