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方法論記事

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

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DOI:

10.3791/54032

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2016年5月18日

 , 
1Department of Infection and Immunity, London School of Hygiene & Tropical Diseases

この記事について

サマリー

この原稿は、アフリカのトリパノソーマの生物発光株を使用して、後期感染の追跡を可能にする方法を説明し、in vivoライブイメージングを使用して中枢神経系内の感染をリアルタイムで視覚化する方法を示しています。

要約

ヒトアフリカトリパノソーマ症(HAT)は、寄生虫が中枢神経系(CNS)に侵入する初期の血液期と後期の2段階で現れる多段階の疾患です。後期のin vivo研究は、従来の方法論では寄生虫の存在を決定するために脳の除去を必要とするため、制限されています。

生物発光イメージングは、ルシフェラーゼトランスフェクションされた病原体をリアルタイムで可視化することを可能にする、非侵襲的で高感度な光学イメージングです。マウスに末期疾患を引き起こす能力を持つトランスフェクションされたトリパノソーマ株を使用することにより、感染の過程を通じて単一の動物におけるCNS感染の動態を研究することができ、全身感染の動きと播種を観察することができます。

ここでは、アフリカのトリパノソーマ症の生物発光モデルを使用してCNS感染を研究するための堅牢なプロトコルについて説明し、オプションのダウンストリームアプローチでさらに分析できるリアルタイムの非侵襲的観察を提供します。

概要

Human African Trypanosomiasis (HAT)、または睡眠病は、Trypanosoma brucei spp1のベクター媒介原生動物寄生虫によって引き起こされます。現在の症例の推定数は毎年7,000人未満であり、アフリカ大陸内で約7,000万人が寄生虫感染のリスクにさらされています。この病気は、治療せずに放置すると致命的となることが最も多く、血液中に寄生虫が存在する初期の血リンパ段階から、寄生虫が中枢神経系(CNS)に侵入し、初期段階のトリパノソーム薬による治療を受けられなくなる後期に進行します2。後期HATに対する現在の薬物療法は、複雑で長期にわたる治療レジメンと重篤な副作用の両方があり、耐性が報告されているため、新しい薬物療法の研究が不可欠です3,4。

伝統的なマウスモデルにおける後期ヒトアフリカトリパノソーマ症(HAT)の研究は長く複雑であり、寄生負荷を監視するために脳組織の除去が必要とされています5。トリパノソーマ症の研究モデルとしては、動物感染株 T. b. brucei が用いられており、感染後 21 日で後期に発症します (dpi)。マウスモデルで野生型の非生物発光性寄生虫感染をモニタリングするには、末梢血フィルムまたは定量的PCRが寄生虫の負荷を決定する唯一の方法です。脳内の寄生虫の負荷については、マウスを淘汰し、脳を切除し、組織に対してqPCRを実施する必要があるため、感染後期の複数の時点で寄生虫を追跡することは不可能になります。これにより、中枢神経系(CNS)内のリアルタイムの感染を追跡できなくなります。

In vivo 生物発光イメージング(BLI)は、マウスモデルにおける寄生虫の播種と疾患の進行を高感度で非侵襲的に検出することができ、実験全体を通して一匹の動物で追跡することができます6。BLIは、ルシフェラーゼ触媒反応によって生成される可視スペクトルの光の放出に基づいています。次に、放出された光子は、電荷結合素子(CCD)カメラ7によって検出される。この目的のために、病原体はルシフェラーゼタンパク質を発現するように遺伝子改変され、基質であるルシフェリンは注射によって関心のある時点で導入されます。この方法の主な利点は、同じ動物を最小限の悪影響で数回画像化できる縦断的研究を実施できることです。取得した生物発光シグナルを定量化できるため、病原体負荷がわかります。

赤方偏移生物発光T. b. bruceiの最適化と検証により、非侵襲的な手順による後期感染の調査が可能になり、血液膜顕微鏡よりも早く寄生虫を検出し、後期トリパノソーマ症におけるCNS感染と薬物スクリーニングの研究に必要な動物の数を大幅に削減しました8,9.このプロトコルでは、生物発光トリパノソーマによるマウスの感染と、疾患の進行とCNS浸透の定量化のためにin vivoで寄生虫を視覚化する方法を実証します。

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プロトコル

倫理
すべての作業は、英国内務省動物（科学的手続）法1986と衛生＆熱帯医学動物福祉のロンドン・スクールと倫理審査委員会の承認の下で行いました。このレポートに続いているガイドラインに到着。

生物発光トリパノソーマブルセイのインビボ通路に1

  1. Tの凍結保存された株式（と呼ばれるstabilate）を削除B。トリパノソーマ株 GVR35-VSL-2（MTAを通じて衛生＆熱帯医学のロンドン・スクール教授のジョン・ケリーから入手可能）9液体窒素から、室温に平衡化することを可能にします。グルコース生理食塩水（PBS-G）は、pH 8.0（1L PBS + 15グラムのブドウ糖）10を滅菌リン酸緩衝で2×10 4トリパノソーマ/ mlにstabilateを希釈します。
    注：T. B。トリパノソーマ GVR35-VSL-2は、ヒトに対して非感染性であり、SAPOは、実験を行うための施設をライセンスが必要です。
  2. インジェクション電気ショック療法0.2ミリリットル20〜25グラムのメスのCD1マウスは、25 G針で腹腔内経路（IP）経由トリパノソーマを希釈しました。これは、「ドナーマウス」です。特定病原体フリー（SPF）-cageおよび飼料を自由摂取に感染したマウスを置きます。
    注：CD1マウスは近交系株及びT.ですB。トリパノソーマ GVR35感染はこの株でよく特徴付けられています。しかし、このプロトコルはまた、近交系または遺伝的に改変された株にも適用可能であるが、毛皮の色がイメージング6,9の感度に影響を与える可能性があることに留意することが重要です。
  3. 採血により末梢寄生虫を監視します。プラスチック製の制止にマウスを置き、21 G針や瀉血に静脈穿刺によって尾から血液の5μLを取り、赤血球を溶解し、より簡単にカウントを可能にするために、0.85％滅菌塩化アンモニウムで1/10を混ぜます。
  4. ノイバウアー血球計数器で希釈した血液をカウントします。
    1. 両室に希釈した血液をロードします。全体の中央グラムを数えます一方のチャンバのID は、nトリパノソーマを得ました。血液中のトリパノソーマの濃度= N×10 4トリパノソーマ/ mlで、任意の希釈倍率を調整し、2室の平均値を計算します。
      注：後約5-7日後、感染、末梢寄生虫は、2×10 4トリパノソーマ/ mlの濃度で感染を行うために十分に上昇する必要があります。
  5. トリパノソーマレベルが必要なマウスの数のために十分に高い場合には、1.6のステップに進みます。 1つのドナーマウスにおいて6×10 4トリパノソーマ/ mlの寄生虫血症レベルは、10匹のマウスの感染のために十分です。
    注：統計的に有意なグループサイズは、N = 6匹のマウスの各処置群8を必要としています。感染症の他のモデルでは、電力の計算は、適切なグループサイズを決定するために適用される必要があるであろう。
  6. （約5〜10分間28-30℃で）熱ボックスに置きマウスは、尾静脈を拡張することを可能にします。終末麻酔を誘導するために、25 G針では20mg / kgのペントバルビタールの静脈内投与します。マウスは軽くない引っ込め反射がないことを確認するためにフットパッドを押すことによって麻酔されていることを確認。
  7. ビジューチューブに5000 USP単位/ mlで5ミリリットルのヘパリンを等分し、1ミリリットル注射器に取り付けられた針の内外二回吸引することによりヘパリンで治療する21 G針。
  8. ヘパリン処理した21 G針および1mlシリンジを取り、胸郭の下中央に針を挿入することにより、麻酔をかけた通路マウスの心臓穿刺を行う（血液のビーズは、針の基部にプールされます）、静かにプランジャーに引き戻します心臓の室を崩壊させないように。血液の0.7ミリリットルの最小値を収集します。
  9. 上記のステップ1.1のようにPBS-G pHが8.0で2×10 4トリパノソーマ/ mlの接種物を生成するために感染した血液を希釈します。
    注：この時点で、残りの血液を8％グリセロールと混合することによってstabilateを生成するために凍結保存することができ、20％の熱不活性化胎児CALF血清（ハイFCS）および72％感染した血液。ゆっくりと液体窒素に移す前に、-1℃/分の冷却速度を達成するために、遅い凍結冷凍コンテナを使用して、-80℃で凍結します。

実験マウスの2.感染

  1. 静脈を拡張するために優しく暖かいに加熱ボックスにCD1雌マウス（〜21〜25グラム）を配置します。プラスチック製の拘束に温めマウスを置き、マウス当たり4000トリパノソーマと同等の尾静脈に25 G針、静脈内に接種物を希釈した0.2ミリリットルを注入。出血を止めるために、その後、注射部位に圧力をかけます。
    注：腹腔内感染症は、感染の有効なルートであり、10以前の研究で使用されてきたが、我々は、静脈内経路よりも、この少ない再現性を発見しました。
  2. SPF-通気ケージに3のグループでの感染マウスとケージをランダム。対照として、野生型の非生物発光寄生虫、TとCD1雌マウスを注入B。ブルセイ GVR35 た（n =3）。
  3. ブラッドフィルム顕微鏡を介して感染を監視します
    1. 静脈穿刺または瀉血からスポット5μlの血液をスライドガラス上に血液塗抹標本行う（第2のガラススライドを使用して静かに薄膜を生成するために、スライド全体に一滴の血液を押します）。空気乾燥にスライドを許可します。
    2. dH 2 Oでリンスする前に10分間ギムザで100％のメタノールと染色で血液塗抹標本を修正し、空気乾燥させ。 100Xの目的の下で10視野（FOV）内のトリパノソーマの数を数えます。
      注：血液撮影が早くも1日、感染後のような、動物全体の非侵襲的イメージングと一緒に行われます。動物の数を処理するときにサンプルを室温で保存し、後にカウントすることができるように、トリパノソーマ定量化のこの方法は、血球計計数よりも好ましいです。

3.生物発光イメージングは​​、感染を追跡します

注意：感染を監視するには、全体のアニメーションアル非侵襲的イメージングを使用することができます。

  1. 30 mg / mlとでダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中のD-ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼ基質のストック溶液を準備します。フィルタは、滅菌し、-20℃でアリコートで凍結します。
    注：D-ルシフェリンは光に敏感である、したがって箔にアリコートを包むことにより、光から保護します。それは活動11に影響を与えることができるように繰り返しルシフェリン凍結融解しないでください。
  2. 室温にD-ルシフェリンのアリコートを温めます。 （nonbioluminescent野生型寄生虫株に感染対照マウスを含む）ケージから各マウスを取り外し、25 G針を腹腔内（DPBSで希釈）温めD-ルシフェリン150mgの/キロを注入。 /分2.5 Lで2％のイソフルラン/ O 2混合物で麻酔を誘導するために約5分間イソフルランチャンバー内にマウスを置きます。
    注：彼らは麻酔下にあるときにマウスを不動になります。ここで使用される撮像装置では、3匹のマウスを一度に処理することができます。マウスはanesthetある場合30分より長く化された、眼科用人工涙軟膏乾燥からマウスの眼を防止するために適用することができます。
  3. ここで説明したイメージャの場合は、ソフトウェアを開き、製造元の指示に従ってソフトウェアを使用してマシンを初期化します。カメラや加熱されたプレートは温度に達した後の画像を取得します。
    注：この機器は、通常、一晩バックグラウンドキャリブレーションを実行するためにマシンを可能にする、オフにされていません。それが再起動する必要がある場合には、それは最初の校正チェックを実行する必要があります。
  4. （3.5を参照）イメージャに麻酔したマウスを置きます。任意の明るい生物発光信号の滲み出し最小限にするためにマウスとの間に大きな黒のセパレータを使用してください。露光時間のセットを使用して画像マウス。 1、3、10、30、60および180秒、メディアビニング、1 F /ストップ、オープンフィルタ、およびビューE（12.5 X 12.5 cm 2）でのフィールドを持ちます。
    注：野生型nonbioluminescent GVR35寄生虫に感染した対照マウスは、backgrを提供しますound生物発光値。このモデルとルシフェリン動態実験（ 図6）から、我々は10分で生物発光信号のピークは投与後とイメージングは、約3匹のマウスのための5分を取ることを見出しました。麻酔マウスを撮影するときに考慮し、このタイムスケールを取ります。
  5. マウスの完全な画像化を確実にするために、腹側、背側及び側面図を得るために回転させます。シーケンシャル動物間イメージングのためのオリエンテーションのための一貫性を維持します。
  6. 撮影後、マウスはSPF-ケージに戻る前に観察下麻酔から回復することができます。
  7. 21日目、感染後まで7日毎にマウスを画像化を続行します。動物全体にわたる生物発光信号が着実に増加があるはずです。
  8. D21、画像および血液フィルムでのマウス前述したように、腹腔内に40mg / kgのジミナゼン・アセチュレートをマウスに投与量。この薬は、末梢寄生虫がクリアされますが、血液braiを横断しませんn個の障壁は、したがって、CNS感染のより良い可視化を可能にします。
    注：ジミナゼンのaceturateは早期ナガナ病を治療するために使用される十分に確立された薬物です。
  9. D28とD35で撮影し、監視を続けます。

4. CNS感染を確認

  1. D35では、上記で詳述したように、画像マウス（3.1〜3.4ステップ）。
  2. 撮影後、さらなる分析のために血液を採取し、ステップ1.6から1.8で詳述したようにマウスが麻酔と放血させるマウスから回復することができます。
  3. 臓器から血液をクリアすると、時間間隔にわたって脳の領域から除去されている可能性があるルシフェリンのラベルを再導入するために、心臓を経由して：心臓穿刺に続いて、20ミリリットルのPBS（灌流液にルシフェリンの3 mg / mlでの追加オプション）でマウスを灌流ステップ4.1から。
  4. 静かに脳を可能にするために、湾曲したハサミを使用して、頭蓋骨の周囲ベースから切断し、頭蓋骨の上部を持ち上げて、脳を削除緩やかに湾曲鉗子を用いて持ち上げることができます。
  5. 適切なルシフェリンを確保するために、撮像前に臓器を超える15 mg / mlとルシフェリン50μlの黒いプラスチックピペットのセクションに摘出した脳を置き切除した脳に追加されました。上記のように設定を使用してイメージ。これは、脳半球への感染の局在化を実証します。
    注意：以前に8に記載のように下流摘出脳の寄生虫の定量化は、定量PCRにより行うことができます。他の代替ダウンストリームアプリケーションは、固定後の脳組織内の寄生虫を識別するために、組織学または免疫組織化学が含まれる場合があります。

生物発光イメージングの5定量

注：生物発光は、イメージングソフトウェアを用いて関心領域（ROI）を用いて定量化し、バックグラウンド生物発光のために補正することができます。

  1. ROIツールを使用して、動物全体の定量aの長方形のROIを作成しますNDマウスの尾の付け根に鼻の先端をカバーするために、マウスの画像の上にそれを配置します。すべての動物、すべての時点について、同じサイズのボックスを使用します。脳のための投資収益率を見ると、画像中のマウスの頭部領域の上に配置する、同じように円形のROIを使用。
  2. 必要であれば、感染を視覚的に表現するために同じスペクトル上に表示されるように画像を調整します。
    注：ここで使用されるソフトウェアは自動的に最小値と最大光子カウントのために調整画像ごとにカラーマップを生成します。一連の画像間の視覚的な比較を可能にするために、カラースケールは、すべての画像に同じ値に設定する必要があります。
    1. （経験的に決定される）ツールパレット上で最高の生物発光と「画質調整」タブで画像を使用して、対数スケールを選択し、適切なカラースケールの最小値と最大値。実験を通してすべての画像にこのスケールを適用します。

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結果

このプロトコルは、Tを用いたマウスの感染後の疾患の進行を追跡するために方法を示しますB。トリパノソーマ 、人間のアフリカトリパノソーマ症のためのモデルが。1治療およびイメージングのステップのためのタイムテーブルを実証し、実験プロトコルのタイムラインを示す図 。 図2は 、末梢寄生虫を定量するために使用される固定ギムザ染色血液塗抹標本のビューの一般的なフィールドを示していますトリパノソーマおよび赤血球に存在しています。動物における感染症の発症は、各時点で撮像された同一の動物を用いた実験の過程で感染した動物を示す図3のように生物発光を測定することによって追跡することができます。感染の経過を通じて、生物発光の増加は、BLIの高い領域（赤として表現して信号は、より散在性と強くなるように、第1の21日間ですべての動物で観察することができます脾臓エリア内）ヒートマップスケールから。 図1は

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ディスカッション

生物発光Tの開発B。トリパノソーマ GVR35株は、初期から後期までトリパノソーマ感染の可視化を可能にします。以前の感染モデルは、血液フィルム顕微鏡からリアルタイムに、寄生虫は、脳にある場合、後期を検出することができなかった、および寄生虫負荷12を決定するために、感染マウスからの脳の淘汰及び除去を必要としました。単一のマウスが感染の全体を通して追跡することができ、感染の迅速な定性的評価は、いずれかの段階で観察することができるように生物発光は、インターマウスのばらつきを低減します。生物発光イメージングの高感度方法は、低レベルの感染は顕微鏡〜9 mlの検出可能な5×10 3トリパノソーマ/に比べて撮像して検出可能なわずか100としてトリパノソーマで、血液フィルムの顕微鏡よりも先に識別することができます。また、実験を通して同じ動物を、以下のことは排除します各時点について別々の動物群の必要性は非常に動物の使用量を低減すること、です。

ここに記載の撮像プロトコルは、非侵...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

我々はTを提供するためのジョン・ケリーとマーティン・テイラー（衛生＆熱帯医学のロンドン・スクール）を感謝しますB。トリパノソーマ GVR35-VSL-2およびin vivoイメージングのアドバイス博士アンドレアZELMER（LSHTM）。この作品は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団グローバル・ヘルス・プログラム（助成金番号OPPGH5337）によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PBSSigma, UKP4417tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UKG827099.5% (molecular) grade
Ammonium chlorideSigma, UKA943499.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)Sigma, UKH0878
Hi-FCSGibco, Life Technologies, UK10500-064500 ml
DPBSシグマ、英国D4031滅菌フィルター
フロスティ・ナルゲン氏、英国
ギムサ・シグマ、英国G5637
D-ルシフェリン・パーキン・エルマー、英国
シグマ、英国115144-35-9
酢酸ジミナゼンシグマ、英国D7770分析グレード
IVIS ルミナIIPerkin Elmer, 英国その他のバイオイメージャー 例えば Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2Perkin Elmer, 英国独自の Perkin Elmer IVIS 機器用ソフトウェア; 他の機器は、独自の
1 ml シリンジフィッシャー サイエンティフィック、英国10142104
20 ml シリンフィッシャー サイエンティフィック、英国10743785
25 G ニードルを持つ場合がありますGreiner Bio-oneN2516
21 G ニードルGreiner Bio-oneN2138
Twin-frosted microscope slideVWR, UK631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tubeStarLab, UKI1415-1000
7 ml Bijou tubeStarLab, UKE1412-0710
マウス拘束具Sigma, UKZ756903私たちの拘束具は社内で作られました、これは同様のモデルです
ジ

参考文献

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