ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

サマリー

胆汁液は、潜在的に重要なバイオマーカーを含む細胞外小胞/エクソソームの貴重な供給源です。このプロトコルは、miRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離するための堅牢な方法を表しています。

要約

最後の3年間のエキソソームの研究は大幅にバイオマーカーとその治療用途の同定および特徴付けに向けて範囲を拡張しました。

エキソソームは、最近、マイクロRNA（のmiR）を含有することが示されています。 MIRS自体は、診断目的のための貴重なバイオマーカーとして生じています。診療所や病院での検体採取が非常に可変であるように、全体の胆汁からのmiRNA分離は、実質的に変化します。簡単な方法で収集され胆汁サンプルから、ロバスト正確で再現性のmiRNAプロファイルを達成するために胆汁からエキソソームを単離し、特徴づけるために、高品質のプロトコルの開発を必要としました。方法は、いくつかの遠心分離および単離されたエキソソームをペレット化し、最終的な超遠心分離ステップで濾過工程を必要とします。電子顕微鏡、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーおよびマルチパラメータナノ粒子の光学分析、電子の品質を検証するための重要な特性評価ステップである利用可能xosomes。これらのエキソソームからのmiRNAの単離のために、 線虫（Caenorhabditis elegans）のような種から非特異的、合成miRNAで溶解液をスパイク、 すなわち 、CEL-のmiR-39は、RNA抽出効率の正規化のために重要です。この方法以下の胆汁液からのエキソソームの単離に成功したmiRNAは-80℃で数年間保存胆汁サンプルからプロファイリングできます。

概要

他の生物学的流体、すなわち、母乳、血漿または尿のように、胆汁はエキソソーム、脂質の豊富な小胞^1-4が含まれ^てい^ます 。エキソソームは、誘導または受容細胞^5、6、彼らの正常な機能^4、7-9の一部である可能性があります細胞間コミュニケーションの形で生物学的機能を変化させることができます。エキソソームは、診断¹⁰のためのバイオマーカーの貴重な情報源を提供することができmiRNA種を含むことができます。 miRNAプロファイルは、疾患^11-14の様々な診断および予後マーカーとして、近年かなりの注目を集めています。

miRNA自体は、おそらく死細胞により放出され、脱落細胞の量が大幅に基礎疾患によって影響を受けることができ、生物学的流体中に見出すことができます。エキソソームのmiRNAプロファイルは、必ずしも元のセル^{6、10、15から17}のmiRNAプロファイルを反映していない、まだエキソソームは、親CEの特徴であるかもしれないのmiRNAの署名を運ぶことができます腫瘍細胞が好きでしょう。腫瘍由来エキソソームは、肺腺癌、前立腺癌および他の腫瘍^8、16、18の患者の血漿中で同定されています。

この方法の目的は、彼らの前処理手順の大部分は独立したヒト胆汁標本からのエキソソームの信頼性の高い堅牢な単離であります。このような胆管¹⁹と胆管の疾患の潜在的な診断のためのmiRNAの信頼できる情報源としての胆汁を利用するために開発されました。これは、エキソソームを単離するために、速度の増加に伴って、遠心分離のいくつかのステップで構成され、他の生物学的流体に適用できる可能性があります。

プロトコル

内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ERCP）によって患者から胆汁を取得する治験審査委員会によるヒト被験者の治験実施計画書の承認を必要とします。ここで提示すべての作業は、ジョンズ・ホプキンス大学の治験審査委員会によって承認されました。

胆汁から1.エキソソームの単離

1. 内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ERCP）を実行します。仰臥位で患者を置き、挿管。
   1. 患者の口を通って十二指腸を通過し、十二指腸の第二部に挿入し、主要な乳頭を識別します。
   2. 選択トリプルルーメンは0.035インチ（0.9ミリメートル）親水性ガイドワイヤが事前にロードされた括約筋切開刀挿入することにより、総胆管にカニューレを挿入。
   3. 機会に、右肝管から胆嚢管を区別することが困難な場合があるため、左肝管に透視下でガイドワイヤを進め、次に進めます安定した位置を取得するための胆管への括約筋切開刀5センチメートル。
   4. ルアーロックを介してガイドワイヤポートに10ミリリットル注射器を取り付け、ガイドワイヤを外し、負圧の10ミリリットルを使用して胆汁を吸引します。
   5. ガイドワイヤーを再挿入し、胆管系を不透明化するために注入口を介して造影剤を注入することにより、ERCPを続行するために胆汁を含む注射器を取り外します。
   6. 氷上で15ミリリットルチューブに回収胆汁を移し、遠心分離ステップを続行する準備ができるまで氷上に保ちます。
      注意：自分自身とサンプルを保護するために手袋を着用してください！それはA型肝炎ウイルス粒子を含有することができるように感染の潜在的な供給源として胆汁トリート！
   7. 氷上でのサンプル（複数可）してください。いずれかの10分間、4℃で500×gでステップ1.2または遠心分離機を続行し、さらに使用するまで-80℃で凍結します。
      注：数年前からこの方法で保存された試料は、日常的に良い結果¹⁹で使用されています。
2. 微量遠心管に胆汁の400μLを移し、4℃で10分間、300×gでの遠心分離により細胞および細胞破片を集めます。
3. ピペットで上清を除去し、さらに破片の上清をクリアするために4℃でさらに20分間、16,500×gで新鮮なマイクロ遠心チューブと遠心分離機にサンプル（複数可）を転送します。バイオハザード廃棄物にチューブを捨てます。あるいは、代わりに、超遠心機でサンプルをスピン。
4. 上清を収集し、左から200nmよりも大きい任意の粒子を除去するために結合の良好な流量と低タンパク質を持っている0.2μmのポリエーテルスルホン（PES）膜フィルターを通してシリンジで生物学的安全キャビネットの中でそれをフィルタリングします。
5. ピペット管を超遠心し、チューブが完全な2/3以上になるようにPBSを追加するために濾過した上清。チューブはそれより少ない液体が含まれている場合、チューブが遠心分離中に崩壊します！チューブは、洗浄オートクレーブと数回再使用することができます。
6. ペルら4℃で70分間120,000×gで超遠心分離を通じてエキソソーム。時々小さな黄色のペレットを参照するには、超遠心分離管の底部での遠心分離を見た後、これらはエキソソームです。
7. 慎重にデカントすることによって上清を捨て、10％v / vの最終濃度に漂白剤を添加することにより、廃棄物を消毒し、20分間放置。
8. 下流の実験のために、いずれかの適切な溶液の小体積のペレット（複数可）を処理（ すなわち、放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）タンパク質の単離、のmiRの単離のためのRNA溶解緩衝液のための緩衝液）またはリン酸の50〜150μl中に再懸濁バッファリング生理食塩水、将来の使用のために-80℃で保存することができるいずれか（PBS）（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）またはタンパク質の抽出など ）またはエキソソームTEMによって調製またはナノ粒子の光学分析の特徴付けのために使用さ。

2.エキソソーム同定透過型電子顕微鏡（TEM）またはCryoEM

1. ピペッティングにより100μlのPBSで細胞外小胞を再懸濁します。初めての分離を行う場合は特に理想的には、-20℃で保存するか、またはされていません-80℃〜エキソソームを使用します。
2. 2分間の400メッシュの炭素被覆Parlodionの銅グリッドに20μlのアリコート（約2μgの）を吸着し、室温で乾燥させます。
3. 乾燥製剤に慎重に滴を配置することにより、室温で5分間、1％（v / v）のグルタルアルデヒド（EMグレード）にエキソソームを修正しました。
4. 5分間、水で2回グリッドを洗浄した後、30秒間、1％リンタングステン酸（PTA）で染色電気自動車を対比。
5. 20,000の倍率で開始し、粒子の大きさを決定する際100,000に増加80キロボルトの加速電圧で電子顕微鏡で画像を取得します。
   注：ホルムバール炭素でコーティングされた200メッシュの銅やニッケルグリッドと対比染色李上に重ね着のような他のプレップ10~15分間KE 1％または2％酢酸ウラニルも可能です。
6. （：3比1）CryoEMのために、60μlのプロテ​​インGの金を10nmと20μlのアリコート（約2μgの）を混ぜます。これは、エキソソームの直径を決定するのに役立ちます。
7. グロー放電さC-フラットホーリーカーボングリッド上にサンプルを転送し、ブロッティングにより、過剰な液体を除去します。直ちに液体エタンにそれらを浸漬することにより、グリッドをフリーズします。
8. 液体窒素中cryoholderにグリッドをマウントします。
9. 20,000と100,000の倍率で200kVで画像を取得します。

マルチパラメータナノ粒子の光学分析による3エキソソーム同定

1. ピペッティングにより100μlのPBSで孤立エキソソームを再懸濁します。
2. いくつかの異なる比で600μlのPBS中のエキソソームを希釈（のような1時50分、1：100、1：300、1：600および1：1200）。
3. manufactuに応じてリアルタイムで適切な機器およびソフトウェアを用いてレーザー光散乱によってエキソソームを可視化RERのプロトコル^20。
4. 粒子が見えるようになるまで、粒子が滑らかに見えるようにフォーカスを調整し、撮影モードでカメラのレベルを上げます。
5. 標準モードでは、粒子はまだ見ることができる最低レベルにカメラを減少しながら、必要なカメラのシャッターとゲインを調整する場合は、これを達成します。
6. 視覚ユニットをフラッシュし、PBSで希釈調整しない場合は、20から100の粒子が画面に表示されていることを確認して下さい。
7. その後、30-60間の秒にキャプチャ持続時間を調整します。ビデオがキャプチャされた後、全ての粒子が画面上で確認されるまでの処理パラメータを調整し、ビデオファイルを処理します。

ウエスタンブロット4.エキソソーム特性評価

1. 氷冷放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）の100μl中の胆汁2-5 mlで溶解エキソソームペレットピペッティングによりプロテアーゼ阻害剤でバッファリングし、ダウン徹底的に30秒間激しく溶解物を混ぜます効果的にタンパク質を可溶化する渦に。
2. ほとんどの時間必要ではないが、完全な溶解を確実にするために10秒ごとに、2パルスと氷上でサンプルのパルス超音波処理を使用します。
3. 5分間、4℃で15,000×gで遠心分離することによって不溶性物質をペレット化し、清潔なチューブに上清を移します。
4. 選択の方法、製造業者のプロトコルに従って（ すなわち 、ビシンコニン酸（BCA）、クマシー、修正ローリー、660 nmのタンパク質アッセイなど ）でタンパク質濃度を決定します。同様の方法は、実験間で比較することができる結果を達成するために一貫して使用される方法は、長いほど重要ではありません。
5. 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル（PAGE）のウェルに5分間95℃で試料を加熱した後、負荷Laemmli緩衝液中でサンプル当たり50μgのタンパク質。
6. 1.5時間PAGEゲル上でサンプルを電気泳動し、ナイロン膜上に分離されたタンパク質を移します。
7. B次いで、希釈した抗CD63及び抗TSG-101のようなエキソソーム特異的抗体を用いてインキュベートし、1時間、0.1％のTween 20（TBS-T）を用いてトリス緩衝生理食塩水中の5％脱脂乳で膜（複数可）をロックします1の：500 4℃で、好ましくは、O / N。
8. TBS-T 3×10分を有する膜を洗浄し、その後、室温で1-2時間、TBS-T中の5％脱脂乳にHRP結合二次抗体と一致する、適切でインキュベートします。
9. 膜（複数可）TBS-Tで3×5分間洗浄し、製造業者のプロトコルに従って、化学発光試薬で特定のタンパク質を検出します。
10. イメージフィルムか、製造元のプロトコルに従ってデジタルイメージングシステムを有する膜。

単離されたエキソソームから5マイクロRNAの単離

注：胆汁エキソソームからmiRNAの単離は、市販のキットに基づいて修正されたmiRNAの単離を用いて行われるが、他の任意のRNA単離方法を用いるまたは適合させることができます。

1. 300＆を追加＃181;リットル（400μlの胆汁から単離された）エキソソームペレットに溶解/ビル・バッファは、渦、ピペットまたは完全に均一溶解液を得るためにエキソソームを溶解するために、針/注射器を通過します。
2. miRNAのホモジネート添加剤の1月10日（30μL）ボリュームを追加し、ボルテックスまたはチューブを数時間を反転させてよく混ぜます。
3. 氷上で10分間ミックスをインキュベートします。
4. 酸性フェノールのボリュームを追加します。最初のホモジネート（300μl）を等しいクロロホルムを。
5. 5フェムトモル/μlのCEL-のmiR 39および30から60秒間渦の5μlを添加します。
6. 水（上）と有機（下）の相を分離するために、室温で万×gで5分間遠心分離します。
7. 転送量に注意しながら、慎重に新しいチューブにピペッティングし、転送することにより、上相を吸引します。適切な有機廃棄物容器内の有機相を捨てます。
8. 低分子RNAを濃縮するためには、回収された水相に100％エタノールの1/3量を追加し、徹底的にTUをボルテックスまたは転倒混和します数回です。
9. 一度に700μlのまでピペットフィルターカートリッジへのライセート/エタノール混合物、。
10. 万XGの最大で15秒間のカートリッジを遠心分離やフィルターを通して混合物を渡すために真空を適用します。
11. ろ液を収集し、溶解液/エタノール混合物は700μLを超えた場合、新しいチューブにフロースルーを転送し、すべてのろ液を収集するための手順を繰り返します。これらのフィルタは、低分子RNAを欠くRNA画分を含み、これらのより大きなRNAを回収するために使用することができます。
12. 総ろ液にRT 100％エタノールの2/3量を加え、ボルテックスで混和します。
13. ピペット第二のフィルタカートリッジにろ液/エタノール混合物。一度に印加できる最大容量は700μlである前にのように。
14. 万×gで15秒間遠心分離またはステップ5.10で説明したように真空を適用します。
15. フロースルーを捨て、ろ液/エタノール混合物のすべてがフィルタリングされるまで繰り返します。
16. 700を適用します81;フィルターカートリッジへリットルのmiRNAの洗浄液1、5〜10秒間遠心分離または真空を適用し、フロースルーを捨てます。
17. ステップ5.16で行われるように500μlの洗浄溶液2/3でフィルターを洗ってください。
18. 、ステップ5.16のように洗浄溶液2/3の500μlの二回目の洗浄フロースルーを廃棄し、バックコレクションチューブにフィルターを置き繰り返します。
19. フィルタからすべての残留流体を除去するために、万×gで1分間フィルターカートリッジをスピン。
20. 新鮮なコレクションチューブにフィルターカートリッジを移し、フィルタの中心に熱い（95℃）ヌクレアーゼを含まない水100μlを適用します。
21. RNAを回収するために最大速度で20〜30秒間、アセンブリをスピン。
22. 溶出液を収集し、直ちに使用するか、または-80℃で保存します。

結果

エキソソームは、通常の顕微鏡検査によって検出またはフローサイトメトリーするには小さすぎるので、電子顕微鏡またはナノ粒子の光学分析を行う必要があります。ナノ粒子の光学分析は、それはまた、定量的であり、サイズ分布および濃度を提供する電子顕微鏡に勝る利点を有します。計器は、サンプルにガラスプリズムを介して細く絞ったレーザビームを導入しています。孤立した小胞のブラウン運動は、EMCCD高感度カメラを介して捕捉し、フレームごとに追跡されます。ナノ粒子は、分析（NTA）ソフトウェア測定胆汁エキソソーム調製物のサイズ、モード分布を計算するために、フレームには、このブラウン運動のフレームを追跡する。 図1は、ヒト胆汁サンプルから単離したエキソソームの典型的なNTA分析の結果を示します。

代替的に、電子顕微鏡を利用することができます定量化せずにもかかわらず、単離された粒子のサイズを確認する。 図2Aは、...

ディスカッション

確実胆汁から単離したエキソソームを利用するためには、引き換えに、高品質のサンプルを得るために、一貫した高品質の単離方法を用いることが重要です。本論文で定義された方法論は、ヒト胆汁からエキソソームとのmiRNAを単離するための十分に確立された方法です。これは、最低でも電子顕微鏡やナノ粒子の光学分析とウェスタンブロットを含むべきである単離されたエキソソームの特性のいくつかの重要なステップを強調しています。

エキソソームの単離の中で最も重要なステップは、少なくともそれがmiRNAの安定性に来るとき、できるだけ早く新鮮な胆汁を処理することです。対照的に、単離されたエキソソームは、室温で保存するか、または複数の凍結融解サイクルを受けた場合であっても非常に安定であるが、室温で全胆汁の長期貯蔵または単一の凍結融解サイクルを大幅miRNAの量を減少させることができます。限り、問題のサンプルは-80°C、エキソソームの成功分離およびmiRで保存されているように胆汁のNAは、サンプル中のmiRNAシグネチャーを同定するための優れた再現性よく行うことができます。当初は、適切なmiRNAの整合性を確保する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 &マイクロ;m ポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルター	コーニング	431229
薄肉ポリアロマー超遠心チューブ	ベックマン・コールター	331374
SW40Tiローター	ベックマン・コールター
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)ソフトウェア	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
Complete Protease Inhibitor	Roche Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871