同系マウスメラノーマ細胞の注入は、肺におけるそれらの転移能を決定するために、

サマリー

転移は癌の病原性に深い役割を果たしており、死亡者の推定90%を占めています。 この臨床現象に対する治療薬の有効性を決定するのに役立つマウスの転移性黒色腫モデルのプロトコルを報告します。

要約

ヒトの癌による死亡の約90%は転移に関連しています。 転移の有病率と相対的な害にもかかわらず、治療または予防のための治療法は不足しています。 本研究では、この現象の研究に有用なマウスの肺転移の確立方法を報告する。 B57BL/6JマウスにB16-BL6を注入することは、メラノーマ転移に最も多く用いられるモデルの一つです。 循環腫瘍細胞の一部はマウスの肺に定着し、「実験的」な転移性病巣を作り出します。 このモデルでは、がん転移の発症に対する治療薬の相対的な効果を測定することが可能です。 治療済みマウスと未治療マウスの列挙された肺病巣の違いは、転移中和の有効性を示しています。 しかし、治療薬の検討に先立ち、転移性病巣の定量解析に最適なB16-BL6細胞の注入数を決定する必要があります。 細胞の注入が多すぎると、転移性病巣が過剰になり、適切な定量が損なわれ、抗がん治療の効果が圧倒される可能性がありますが、注入が少なすぎる細胞は、治療と対照の比較を妨げる可能性があります。

概要

転移は悪性腫瘍の患者の死亡の主要な原因です。癌細胞の転移性播種の過程はよくわかっていないが、隣接組織への浸潤を含む、いくつかの段階、リンパ管および血管系への血管内、循環系内の生存と転座、転移部位の血管から血管外漏出が関与すると表示され、適応新しい新しいサイトの微小環境、および二次性腫瘍の増殖および形成することにより、新しいサイトでの植民地に^。1、これらの生物学的事象のそれぞれは、転移性腫瘍細胞の形質転換、普及および生存を伴います。例えば、細胞外マトリックスとの正常な相互作用と相まって間葉表現型への腫瘍細胞の上皮表現型の変換は、隣接する組織に侵入し、身体の他の部位に転移することを可能に^。2,3さらに、これらの転移細胞循環血流内で生き残るためには、ホストからの免疫監視を回避する必要があります。本体内に離れた部位に移植された場合^4,5最後に、腫瘍細胞が増殖し、二次腫瘍を形成するために、それらの微小環境に適応しなければならない^。6,7ので転移は、がん患者の間で共通の現象であるが、転移性腫瘍細胞は、治療的介入の影響を受けやすい脆弱性の複数の領域を持っています。

メラノーマの免疫原性の性質、および免疫療法の最近の関心を考えると、黒色腫のためのモデルがますます便利です^。8米国だけでも、メラノーマは年間推定9000人の死亡の原因である。黒色腫転移の⁹一般的な場所は、骨、脳であります、肝臓、および肺。遠隔部位への転移の大部分は、血流を介して起こります。血液中の循環腫瘍細胞は、免疫クリアランスを回避遠位臓器の毛細血管床に到達しなければならないし、正常に自分自身を確立するために、血管の内皮細胞を介して侵入する^{。4-7,10、11}

転移の一般的および病原性の現象を模倣するために、マウスB16-BL6細胞株を作成しました。親のC57BL / 6メラノーマ細胞株B16-F0の被相続人は、B16-BL6は、膀胱膜浸透のための6連続した選択に続いて（B16-F10の結果）は、静脈内注射からの肺転移のための10の連続した​​選択範囲の最終産物です。 ¹²このように、静脈内注射、特にとき、マウスにおける転移巣の確立のための信頼性の黒色腫細胞株である^。13

B16 / BL6細胞の移植および増殖を可能にするために、二つ以上の週間続くB57BL / 6マウスの尾静脈へのB16-BL6細胞の十分な量の注射後、転移病巣は、肺に形成します。解剖顕微鏡による安楽死や検査の際、数個々の病巣の存在を定量することができます。注入されたB16-BL6細胞の数は、肺の表面に形成された病巣の数と相関し、これは、今度は、用量転移効果を確立するために使用することができます。このモデルは、既知の転移性細胞は、調査の肺、肝臓、または他の器官の迅速かつ予測可能な広がりとの確立を容易に、血流に直接導入される「実験的転移」として知られています。これは、しばしば、皮下、腫瘍細胞が移植されている「自然転移」とは対照的であり、転移は有機癌細胞を流し由来する^。14,15

マウスの尾静脈にB16 / BL6細胞の適切な量を注入することが重要です。あまりにも多く、および肺は、転移で覆われると、隣接病巣が互いに区別できないであろう。少なすぎると、治療薬の影響が原因で本来のバリに識別できないだろう注射の間ations。 C57BL / 6マウスの肺の病巣の最適な数を得るためには、アカウントに個別の識別性をながら、肺の表面上に確立された転移巣の量を注入した細胞の数を相関させる必要があります焦点。このプロトコルは、C57BL / 6マウスに対する転移性マウス黒色腫モデルのデモンストレーションを行います。

プロトコル

倫理文：研究におけるマウスの使用は、それが基本的な生物学のまたは疾患の最終的な治療に向けた人間の理解を進める可能性があるインスタンスでのみ許容されます。

1.注文

1. 購入雌のC57BL / 6マウス（6歳 - 8週間）、群当たり5匹のマウス。マウスのための数日間は、調整することができます。

B16-BL6細胞の調製

1. 無菌フード内で37度のインキュベーターと場所から細胞培養プレートを取り外します。プレートは、B16-BL6マウス黒色腫細胞と約70％コンフルエントであるべきです。大きなコンフルエント細胞に転移能を変化させることができます。
2. 1分間放置し、プレートあたり1ミリリットル0.05％のトリプシン-EDTAを追加し、トリプシン培地溶液を吸引除去します。
3. プレート当たりトリプシンの1ミリリットルを加え、10分間インキュベーターにプレートを返します。
4. 無菌フードにインキュベーターからプレートを移動させた後、無血清ローズウェルパーク記念研究所Mediuの4ミリリットルを追加各プレートにメートル（RPMI）。
5. 滅菌、電動式ピペットを用いて細胞を収集します。細胞を破壊するために、非常にわずかな角度で押したチップを用いて、プレートの底から細胞を取り出します。そうでなければ排出針を詰まらせる可能性があり、細胞塊の十分な分離を確実にするために数回繰り返します。思い出すと50mlコニカルチューブに移します。
6. 細胞密度を決定するために、血球計数器を使用してください。一定のB16-BL6細胞の総数を維持し、無血清RPMIの量を決定すること0、0.065、0.015、0.25、0.5万個の細胞/ mlの最終濃度に到達するために必要。
7. 同様に15ミリリットルコニカルチューブに50ミリリットルチューブ内のメディアを分取。 5分間、2250×gでコニカルチューブを遠心。メディアをデカント。無血清RPMIの適切な量を追加し、血球計数器を経由して所望の細胞密度を確認します。追加のRPMIを追加するか、回転し、それに応じて小さくVOLUME-に再懸濁することによりdensities-調整します。
8. アリコート500μlの氷の上で標識された1.8ミリリットルチューブにそれぞれの細胞懸濁液。

3.尾静脈注射

1. 尾が保持しているマウスを、取り、マウスレストレーナーにリア最初にそれを導きます。制止のメインチャンバー内の胴体により、外側尾で、拘束の終わりに向かってマウスを引っ張ります。マウスが安全になるまでプッシュし続け、拘束具、プランジャーを挿入します。
2. 外側尾静脈のいずれかが上を向いていることを90度、マウスを回転させます。アルコールパッドを使用して、積極的に尾静脈が最も表示されている場合は特に、マウスの尾の側面を清掃してください。
   注：良い照明はB57BL / 6Jマウスでの効果的な尾静脈の可視化のために不可欠です。加熱ランプまたは加熱手術パッドは、必要ではないが、また、尾静脈の容積を増加させることによって助けます。
3. 無菌培養フードで2万個の細胞/ mlのチューブからの細胞培養培地を300μlを収集します。秒をフリック、針を反転IDEとシリンジから気泡を排出するために、プランジャーを押します。 250μlの最終容量をもたらすことが文化-RPMIを取り出します。
4. 非利き手でマウスの尾を拡張します。非利き手の人差し指と親指で押し下げ、尾の先端部に上昇尾の近位端部と尾を持ちます。
   注：このように、尾静脈を横位置に保持され、尾部のより遠位部分の可能な一致するエントリと、拘束面に平行です。
5. そもそも分下向きの角度で、遠位端に向かって、尾静脈に針を挿入し、さらに挿入時に尾静脈の角度に合わせて、針を調整（針に注射器の相対的なプランジャー端を下げます） 。
6. 尾静脈に針約1cmを挿入します。挿入後、着実に針を保持し、プランジャーをプッシュし始めます。
   注針が尾静脈内にあり、針の端部がNである場合にotのは、メディアが静脈に妨げられることなく流れるべき遮ら。効果的な注入は、静脈からの血液クリアランスによって特徴付けられます。そこに抵抗がある、またはバブルは、注射中の部位で形成し始める場合は、針を除去し、尾静脈に沿ってより近位の場所で再試行してください。
7. 静脈から針を外し、それを捨てます。任意の出血を止めるために進入部位に対するガーゼを保持します。
8. 拘束からプランジャーを取り外し、受信者のケージにマウスを置きます。
9. 他のすべての濃度について繰り返します。
   注：肺病巣確立は約2取る-細胞株と焦点の所望の大きさに応じて変動して、3週間を暫定で^9に 、マウスは、過度のあえぎのように、早期の安楽死を保証可能性が症状を監視する必要があります。

4.肺病巣を数えます

1. CO _2を CO ₂チャンバー内に配置し、100％に曝露することによって、マウスを安楽死させますは5分間分あたりチャンバ容積の10から30までパーセントで導入しました。頚椎脱臼で従ってください。
2. 発泡スチロールの上でマウスをスプレイ。手術用はさみを使用して、胸骨に沿って外科的切開を作成します。
3. 胸骨切開の上からと胸郭を露出させ、マウスの肩に向かって分岐の両方、二つの追加の切開を行います。
4. 肺と心臓を露出し、胴体から胸郭を削除するには、2カット、胸骨の側面に沿って各してください。
5. 手術用ピンセットで心を持ち、マウスから心臓や肺を解放し、食道と気管をカット。より良い視覚化のために、10倍の倍率で、解剖顕微鏡の下に置きます。
6. 肺から心臓を解剖し、胸腺を除去し、2つだけ肺を残します。
7. 解剖範囲の下の肺では、肺の病巣をカウントし始めます。各病巣は、肺の表面上に円形、茶色の出しゃばりとして表示されます。
   1. ためにマウスとの間の整合性は、葉の表面に病巣の数をカウントし、その葉を反転します。 4ローブの各操作を行うと、個別に簡単にカウントすることができます。
8. 遺体を捨て、そうでない場合は、保存して、IHCを行った場合、肺を修正。

結果

目視検査の際に、表面の病巣の変化は明らかです。解剖顕微鏡下で腫瘍の数を計数すること注入腫瘍細胞の数と得られると数えられる病巣の数の間の直線関係を生じるはずです。注射用細胞の最適な数を使用して、彼らは、図1Aの500,000個の細胞/ mlであるように、目標は、肺が完全に覆われていないものであり、彼らは62,500細胞/ mlと125,000個の細胞であるとしてあまりにもまばら/、カバーされていませんミリリットル。これはまた、線形相関（ 図1B）によって定量可能です。

尾静脈注射したB16 / BL6細胞から得られた図1肺病巣。 （A）肺病巣は、茶色の円形の塊（矢印の下で代表病巣）としてC57BL / 6マウスからの肺の表面に可視化することができます。洞穴のように（各画像上）注射し、細胞培養の性が増えるので、（各画像の下）、肺病巣を生じた対応する数がありません。注入した細胞の密度が最も高いマウスからの肺は、肺病巣の最大の視覚的なカバレッジを持っています。スケールバーは20mmでを表す。細胞培養密度に対して肺病巣の相対的な（B）列挙。血球計によって決定されるように125,000細胞/ ml以上のほぼ直線的な関係が存在する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

尾静脈注射からの循環腫瘍細胞の一次成長のサイトを回避し、時折遠隔地の毛細血管床で自分自身を確立し、血流やリンパ系のような経路を通って移動するの転移を表す。上記の¹⁴のプロトコルは二次のモデルとして機能します転移。注入されたB16-BL6細胞の最適な数では、実験者は、癌細胞の転移に投与された薬剤または免疫細胞集団、ポスト中和の相対的な効果を決定することができます。

このプロトコルには限界があります。循環腫瘍細胞が転移する能力のために選択され、従って、非免疫原性である、主要組織適合性複合体クラスの下位レベルの1分子を有している^。12さらに、転移の多数の突然のクラスタ化導入は、患者における一般的なシナリオとは異なっていますここで、転移性腫瘍細胞の少数原発腫瘍の場所から長期間にわたって放散します。また、静脈内導入した腫瘍細胞は、組織培養物からではなく、原発腫瘍の起源です。したがって、これらの細胞は、細胞接着、遊走、免疫認識および受信者の臓器の確立の変化に起因する二次転移とは違っている^。15,16

代替プロトコルは、原発腫瘍の発生や得られた「自発的な」肺転移の分析のためのB16 / BL6の皮下注射であろう。これらの「自発的」転移がより密接に人間の患者のものと一致する、彼らの "実験"の対応よりも多くの不均一性を含んでいることが分かってきました。プロトコルは、転移の実験化合物の影響を決定する能力に制限されます。外側尾静脈注射で、血流中に注入黒色腫細胞の数は、hを介して近似することができます。emocytometer。 「自発的」転移と、しかし、肺病巣を生じたの数に追加の変数を追加し、腫瘍の間に大きな不均一性がある^。16

結論として、尾静脈B16-BL6マウス黒色腫モデルは、転移の治療または免疫療法の影響を決定するための単純なモデルを表します。静脈循環腫瘍細胞を注射することによって、研究者は、患者が後転移を、ある程度まで、複製することができます。癌患者における転移性腫瘍細胞の破壊的な影響を考慮すると、このモデルは、転移の多段階プロセスを理解するための強力なツールです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプシン	コーニング	MT25052CV
RPMI 1640 ミディアム	コーニング	MT15040CM
フェーズ コントラスト 血球計算計	Hausser	02-671-54
マイクロファイン IV インスリン シリンジ	BD	14-829-1D
滅菌アルコール準備パッド	フィッシャーブランド	22-363-750
マウス レストレーナー	Braintree Scientific	NC9999969	Restrainの選択はマウスの年齢/サイズによって異なります
Heating Pad	Harry Schein	NC0012697	オプション