インフィールドアプリケーションの設計およびアプタマー金ナノ粒子基づく比色アッセイの開発

サマリー

インフィールドの用途のための小分子の検出のためのアプタマー - 金ナノ粒子の比色アッセイの設計および開発を検討しました。さらに、スマートデバイス測色アプリケーション（アプリ）が検証された、アッセイの長期保存は、フィールドでの使用のために設立されました。

要約

インフィールドの用途のための小分子の検出のためのアプタマー - 金ナノ粒子（AuNP）比色アッセイの設計および開発を検討しました。ターゲット選択AuNPベースのカラーアッセイが制御さ、概念実証実験室の設定で開発されてきました。しかし、これらの方式は、実験室の設定を超えて、その実用化を決定するために、障害発生時点に発揮されていません。この作品は、小分子検体とインフィールドの設定のためのアッセイを使用するためのアプタマー - AuNP比色アッセイを設計、開発、およびトラブルシューティングするための一般的なアプローチについて説明します。吸着されたアプタマーは、ナノ粒子表面を不動態化し、低減し、非標的分析物に偽陽性反応を排除するための手段を提供するので、アッセイが有利です。実用的な用途にこのシステムを移行することはアプタマー-AuNPアッセイの貯蔵寿命だけでなく、を定義するが、長期保存capabilを拡張するための方法および手順を確立する必要ities。また、比色読み取りと認識懸念事項の一つは、正確に色で頻繁に微妙な変化を識別するために、アナリストの負担です。フィールドのアナリスト上の責任を軽減するには、色分析プロトコルは、実験室グレードの機器でこのタスクを実行するための必要なく、色識別職務を行うために設計されました。データ分析プロトコルを作成し、テストするための方法が記載されています。しかし、理解し、吸着したアプタマーアッセイの設計に影響を与えるために、相互作用は、アプタマー、ターゲットに関連付けられている、とAuNPsは、さらなる研究が必要です。得られた知識は、機能向上のためのアプタマーを仕立てにつながる可能性があります。

概要

測色は、分析化学で使用される最も古い技術の一つです。この技術については、検体の定性的または定量的決意着色化合物¹の製造に基づいて行われます。典型的には、色アッセイは、可視光スペクトルにおいて観察または検出可能な色の変化をもたらす検体種の存在下で色ずれが発生する試薬を使用します。測色は、デオキシリボ核酸（DNA）、ペプチド、およびタンパク質^2-4のような複雑な生物学的分子の原子、イオン、および小分子の範囲の標的の検出に使用されてきました。過去20年間では、ナノ材料は、特にカラー基づくアッセイ^5-6と、検出アッセイの分野に革命をもたらしてきました。このような抗体、オリゴヌクレオチドアプタマーまたはペプチドアプタマーとして、標的選択的認識要素とナノ材料の固有の化学的および物理的特性を組み合わせ、復活につながっている私比色検出アッセイ⁷の設計と開発をn個。

金属ナノ粒子は、多数の比色アッセイの設計に利用されている実証サイズ依存色変化特性を有します。金ナノ粒子（AuNPs）が原因で、粒子の分散液は、通常、塩の正確な添加して^、8を集約するように誘導された特徴的な赤から青へのカラーシフトに特に重要です。凝集（青）の状態に分散（赤）からの移行を制御する能力は、イオン、小分子、ペプチド、タンパク質、および細胞標的^2-4,9ための比色センサーの作成 ​​につながっています。これらのセンサの多くは、標的認識モチーフとしてアプタマーを使用します。

アプタマーは、10 ¹² -10 ¹⁵の異なる配列^10-11のランダムプールから選択されたDNA又はリボ核酸（RNA）分子です。選択プロセスは、ターゲットの再を識別する認知低ナノモル領域における結合親和性を持つ要素、および指数関数的濃縮（SELEX） ​​によって、リガンドの系統的進化は、最も一般的に知られているプロセス^12-13です。アプリケーションを検出するためのオリゴヌクレオチドベースのアプタマーの利点は、合成の容易さ、制御可能な化学的修飾、および化学的安定性^14-15が含まれます。

比色アッセイを作成するための1つのアプローチは、認識要素とナノ材料を組み合わせたAuNP表面へのDNAアプタマー分子の物理吸着を介してこれらの二つの種を組み合わせで構成されています。標的アプタマーの結合を介して、アプタマーは、塩の添加により誘導可能な赤から青への色応答¹⁹につながるAuNP表面とアプタマーとの相互作用を変化させる構造変化^16-18を経験^します 。 AuNPsのこの驚くべき特徴は、解除するのに使用することができるアプタマーベースのデバイスのための観察、比色応答機構を提供します異なる分析物のための比色アッセイに署名。

AuNP表面上の非共有結合、物理吸着DNAアプタマーを用いて設計されたカラーアッセイが原因で堅牢性、制御された実験室の設定の外の故障の傾向、および実用的に使用するための利用可能な情報の不足の問題に弱いセンサープラットフォームであることの汚名を持っています設定。しかし、アプタマーAuNP基づく比色アッセイがあるため、操作や観察可能な色反応を簡単に興味深かったです。この研究の目的は、代表的な検体としてコカインを使用したDNA-AuNP基づく比色アッセイの設計、開発、運用面の減少に関連する偽陽性反応、および長期保存のためのプロトコルを提供することです。さらに、我々は、これらのアプタマー-AuNPのお尻のための従来のアプローチよりも少ないステップで得られた使いやすさと使いやすさに有利で ​​あるとして、この吸着されたアプタマーアッセイ法（ 図1）を提案しましたAYS。このアッセイでは、アプタマーは、最初に長期間の表面に吸着させたAuNPsに添加しました。このアプローチのさらなる利点は、AuNP表面相互作用に関連する非標的分析物分子に対する応答の減少でした。しかし、偽陽性反応の減少は、アッセイ感度を犠牲にしました。したがって、表面保護と検体アクセス性とのバランスが適切なアッセイの機能を維持するために必要です。また、経由色アッセイを分析する主要な欠陥が計測器を用いた場合よりも、他の意味色の微妙な違いを区別しようとしている場合は特に結果は、しばしば主観的でからアナ​​リスト・ツー・アナリストの解釈に開いていることです。逆に、本 ​​研究では電力等の利用可能性、携帯性と実用性、として、ラボ外で使用可能な実験室ベースのインスツルメンテーションを行うことで多くの問題があり、色解析プロトコルは、MORのために開発されました電子移植性と一般的に色ベースのアッセイの解釈^20-21に関連した当て推量のいくつかを排除します。従来のアプローチと比較すると、この努力は、実験室の設定を超えたアプリケーションのための彼らの限界にこれらのアッセイをプッシュする努力しました。

プロトコル

クエン酸の金ナノ粒子（AuNP）の削減と特性を経由して1合成

1. 5mlで三角フラスコ（500ml）および大型攪拌棒をきれいには、硝酸を濃縮し、15 mlの化学物質安全フード内濃塩酸しました。
   1. 酸洗浄とフラスコの表面全体を濡らし、ヌクレアーゼを含まない水でフラスコをすすぎ、そしてフラスコを乾燥させます。
2. 1 mMの金（III）塩化物の100ミリリットルを追加します。酸の上面を覆うようにアルミホイルのシートを使用し、沸騰するまでホットプレート上で連続的に攪拌しながら三角フラスコと熱を掃除。
3. 38.8 mMのクエン酸ナトリウムの10ミリリットルを追加します。色は黒/ダークブルーに、クリア/グレーから変更し、数分間にわたって最終的に暗赤色になります。 10分間の加熱をオフにして攪拌し続けます。
4. AuNP懸濁液を室温まで冷却し、連続的に攪拌しながらジエチル（DEPC）の110μLを追加することができます。
5. フラスコ全体をカバーでアルミ箔とはDEPC処理を一晩インキュベートすることができます。琥珀色の貯蔵容器に、暗所ですべてのAuNPsを保存またはアルミホイルで覆った。
6. 室温まで冷却AuNP懸濁液を、オートクレーブし、孔径0.22μmのセルロースアセテート膜でろ過します。 4℃で暗所で濾過し、オートクレーブしAuNP原液を保管してください。
   注：DEPCを用いた治療、4℃でオートクレーブを介して滅菌、およびストレージは、アプタマー-AuNPアッセイの貯蔵寿命を改善します。このように、ストレージは2ヶ月以上のための機能を維持するためのアッセイを可能にします。
7. 濃度（c）を計算することによって^8に Lモル^-1 cm ^{-1 で}ベールの法則とを520 nmで紫外可視吸収を得ることによってAuNP濃度を計算し、吸光係数（ここでε）を使用して2.4×10。濃度は、動的光散乱によって決定さ15nmの大きさの10 nMであると決定されました。
   注：濃度はFRを変化しますオムバッチ間。希望の10 nMのAuNPサスペンションを維持するために必要なヌクレアーゼを含まない水でAuNPストックを希釈します。

2. DNAアプタマー、バッファ、ソリューション、およびアッセイの準備

1. 標準的なホスホルアミダイト化学^22を使用してアプタマー配列を結合後のコカインを購入するか合成します：
   MN4 ^19：5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19：5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. 標準的な脱塩^23を使用してアプタマーを精製します。 100μMまたは1 mMのストック溶液のいずれかでヌクレアーゼフリー水にオリゴヌクレオチドを​​再構成します。数ヶ月のために-20℃で小分けし、店舗。
3. 購入または滅菌1Mの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pHが7.4、100mMの塩化マグネシウム（MgCl _2）、および1M塩化ナトリウム（NaCl）でのストックを調製します。
4. ヌクレアーゼフリー水のwi内のバッファの50ミリリットルを準備ヶ月間室温で第20 mMのHEPES、2mMのMgCl ₂を、pHが7.4の濃度とストア。
5. 室温で3-4時間、在庫AuNP溶液（10 nM）を用いてDNAをインキュベートし、光から保護します。試験は、（2.5〜7.5 ml）を実行するために十分なサンプルを提供することが望まれるようAuNPsの容積を変化させます。
   1. ここで、この作品では90、120、150、および180 DNA分子/ AuNPのローディング密度を使用します。それに応じてDNAの量と濃度を変化させます。非標的分析物の意図しないAuNP表面に関連するカラー応答を減少させるためのチューニングDNAカバレッジ。
      注：DNAカバレッジを増加させると、アッセイ感度を低下させます。ローディング密度がAuNPストックの濃度を知ること、そして実験に使用するための所望の量で存在AuNPsの総数を計算から計算されます。実際のカバレッジ密度が所望される場合、プロトコルは、これらの値^7を得るために存在します。 DNA被覆率は50 kDaのMを用いて決定しました。遊離DNAからAuNP結合したDNAを分離するolecular量カットオフスピンカラム。 AuNPsは、遊離DNAを容易に通過する一方、スピンカラムを通過するには大きすぎます。次のステップは、吸光度測定、または一本鎖DNAの蛍光色素を使用して収集した遊離DNAを定量することです。
6. 20mMのHEPES、2mMのMgCl ₂を、pH7.4の緩衝液の等量加え、暗所で一晩中4℃でサンプルを配置します。アプタマーAuNPアッセイは、10mMのHEPES、1mMのMgCl _2、pH7.4の（アッセイ緩衝液）でした。

3.塩滴定およびアッセイのセットアップ

1. アッセイブランクとの塩滴定によるアッセイの色応答を誘導するために必要な初期の塩濃度を決定します。 96ウェルプレート中のアプタマーAuNPアッセイ180μlのアリコートにメタノール20μlの（空白）を追加します。 （ 図2のストックNaCl溶液（1 M又は2 M）の増加する容積を有するサンプルを滴定し、当量点を決定します注：このアッセイは、同じアプタマー-AuNPアッセイに空白メタノール（または溶解した分析物）の比率を維持することによってより小さなボリュームにスケーリングすることができます。
   1. ここでは、目視によるわずかな色の変化を引き起こすために必要なNaClの量を決定します。アッセイの開始濃度はそれぞれ60 DNA分子/ AuNPカバレッジ密度で、MN4およびMN6のために75ミリ、130 mmでした。
      注：初期の塩濃度の定量決意については、滴定曲線の中点は良い出発点として機能します。また、使用した濃度は、日常的な性能、およびバッチ間からアプタマー、DNA被覆密度に基づいて変化します。
2. アッセイ応答の最適化、室温で96ウェルプレート中のアプタマー-AuNPアッセイ180μlのアリコートにメタノールで希釈した検体分子の20μlを添加します。直前のステップで決定されたNaCl濃度がアッセイの色応答を開始するために追加します。
   NOTE：同時に複数の実験を行うためにマルチチャンネルピペットを活用。
3. 増加またはNaCl濃度を減少させ、ブランク応答に対する目標応答を比較することにより、可能な最大の色変化を得ます。最大の応答差を与えるNaCl濃度を使用してください。
4. NaClを添加後、アッセイ応答150秒を観察または測定します。分光計を用いて650 nmおよび530 nmでの吸光度を分析したり、分析応答（写真解析プロトコルのセクション4を参照）のデジタルカメラの写真を入手。
   注記：マイクロプレートリーダーは、この作業のために測定値を得るのに使用しました。
5. 分析対象物濃度の関数として650 nmおよび530 nmの（E ₆₅₀ / E _530）で得られた吸光度の割合として結果をプロットします。この仕事で行ったように、ブランク信号に対するアッセイ応答を正規化します。

4.写真やデジタル画像色解析プロトコル分析

1. Prepar電子に記載のアッセイサンプル（セクション3.2から3.3）。トランスイルミネーター上で96ウェルプレートを置きます。
   注：標準的な実験ネーターは、典型的には、この分析のために使用可能なデジタル画像を得ることが明るすぎます。これらのtransilluminatorsが原因光源の強度にデジタル画像に表示されるように等間隔「ダークライン」を引き起こします。発光ダイオード（LED）ベースライトボックスからネーターを作ると、不透明なプラスチックの部分はうまく動作します。
2. 式^1〜24に示すように、増分の平均化技術を用いて、NaClを添加後150秒で96ウェルプレートの写真を取得し、画像解析ソフトに画像をインポートし、そして平均、赤、緑、青（RGB）の値を計算します。
   （1）
3. 標準のRGB（sRGBの）色空間からRGB値は、以下の式^24を用いて、色度図（CIExyY）色空間に変換します。
   （2）
   （3）
   （4）
4. 式2、式3で指定された行列を用いて線形RGB値に指数関数RGB値に変換するCIE色空間²⁴のX、Y及びZ値を計算するために使用されます。
5. 分析²⁴のために選択された領域内のピクセルの平均色を表す式（4）を使用して、xおよびy色度値を算出します。
6. すべてのウェルに分析を行い、検量線（ 図4）を生成する色度値をプロットします。同一ウェルの異なる領域の色を分析することによって、標準エラーを取得します。

長期保存のためのアプタマー-AuNPアッセイを凍結5.

1. セクション2.4および2.5に記載されているようにアプタマー-AuNPアッセイ成分を準備。寒剤ソリューションを作るためにヌクレアーゼフリー水に1グラム/ mlのトレハロースと1グラム/ mlのスクロースを含む別々の溶液を作ります。
   注：トレハロースとスクロースの高濃度の凍結のためのアッセイを調製する際の希釈率を減少させるために使用しました。使用前に完全に糖を溶解するために水の入ったビーカーにホットプレート上の糖液を加熱します。
2. 19.2 mg / mlでトレハロース、1.5 mlマイクロチューブ中200μlの最終容量で60 MN4-DNA / AuNPアッセイで4.8 mg / mlでのショ糖を含む溶液を作ります。最終的な寒剤溶液濃度は、DNAカバレッジによって異なります。
   注：凍結するサンプルは300μLを超えてはなりません。より大きなボリュームが正しくフリーズしない場合があります。
3. Flashは-146℃の冷凍庫または液体窒素中でを使用してサンプルを凍結します。使用するまで凍結したサンプルを保管してください。フラッシュ凍結が完了すると、ストレージはC°-80℃または-20であることができます。
4. この作業のために、オーバー-146℃の冷凍庫にサンプルを残しますその後、夜と長期保存のために-20℃の冷凍庫に移します。
   注：フラッシュ凍結はアプタマー-AuNPsが凝集することがあります。吸光度プロファイルを監視し、凍結していないサンプルと比較することにより、凍結プロセスの整合性をテストします。凝集が観察された場合、この問題を補償するために、冷媒液の量を増加させます。
5. 室温でサンプルを解凍し、実験のために必要なだけの十分なサンプルを使用。解凍したサンプルの吸光度スペクトルを取得し、凍結していない寒剤液処理したサンプルのベースラインスペクトルと比較します。 400から700nmに吸光度を測定します。
6. 塩滴定（セクション3.1）を実行し、アッセイ（セクション3.2）をテストし、前述したように結果（セクション3.3および3.4​​）をプロットします。

結果

この作業の主な目的は、フィールドでの使用のためにAuNP比色アッセイをベースアプタマーの安定性と堅牢性を開発し、調査することでした。前の公報に強調されているように、アッセイを作成するための2つの明確な戦略が⁷調べました。アッセイは、無料のアプタマーアッセイおよび吸着アプタマーアッセイと名付けました。吸着アプタマーアッセイfieldable検出アッセイ（ 図1）の目的のために、より魅力的でした。

吸着アプタマーアッセイの 図1 略図アプタマーはAuNPsと混合し、一晩インキュベートしました。メタノールに溶解した検体分子は直ちにターゲットが追加されたときにAuNP凝集を誘導するために、塩化ナトリウム（NaCl...

ディスカッション

過去10年間、ナノ粒子ベースの比色アッセイは、小分子、DNA、タンパク質、細胞^2-4を含む標的の検出のために開発されています。ナノ粒子とDNA-アプタマーを使用するアッセイは、関心を集めています。典型的に、これらの比色アッセイはAuNPs ^9-10に加え、続いて、分析物分子と、DNAアプタマーを混合することによって行われます。しかし、これらのアッセイは、制御された実験室の設定で、限られた、選択されたコントロールで概念実証のデモに利用されてきました。フィールドにこの技術を移行するための最近の進歩は⁷なされてきました。このアプローチでは、AuNPに吸着されたDNA、アプタマーは、検体分子を添加する前に（ 図1）試験される表面。どちらアプタマー金ナノ粒子ベースの比色アッセイの開発は、製造/分析プロセスの様々な段階での最適化を必要とします。ディスクにこのように、これらの新しいですiplineは精錬と成功するためにこれらのアッセイのトラブルシューティングに関連したニュアンスを認識する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
金(III)塩化水和物	シグマ	254169	99.999%の純度が重要で、毎回新鮮に溶液が作られていました
クエン酸ナトリウム二水和物	シグマ	W302600-1KG-K	製造元がAuNPアッセイに大きな影響を与え、溶液は毎回新鮮に作られていることがわかりました
シナジー	バイオテック	HT	どの吸光分光計でも動作しますが、プレートリーダーは複数サンプル分析が可能です
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)緩衝剤、1 Mは不妊手術済み	アムレスコ	J848	滅菌されたブランドならどんなものでも使えます
コーニング、250mlフィルターシステム、0.22 µMセルロース酢酸塩	漁夫	430767	AuNPを除去する他の膜も発見されています
UV分光光度計	ヴァリアン	キャリー 300	どの吸収分光器でも動作します
塩化マグネシウム・ヘキサハイドレート	フルーカ	63068	≥98%はどのブランドでも使えます
デオキシリボ核酸	IDT	習慣	DNAは脱塩カラムで精製され、より高濃度の精製技術も使用可能です
塩酸プロカイン	アクロス	AC20731-1000	メタノール1 mg/mlの99%在庫が準備されました
塩酸	漁夫	A144S-500	36.5〜38.0%の確率で他のブランドなら問題ありません
塩酸コカイン	リポメッド	COC-156-HC-1LM	製造元がAuNPアッセイに大きな影響を与えることがわかりました
硝酸	漁夫	A509-SK212	65%は他のブランドで動作します
塩化ナトリウム溶液、5 Mバイオ試薬グレード	シグマ	S5150-1L	固体から作られた滅菌溶液は効果的です
ジエチル炭酸塩	シグマ	D5758-25 mL	≥どのブランドでも97%は問題ありません
エクゴニンメチルエステル塩酸塩	リポメッド	COC-205-HC-1LM	EMEコントロールはコカイン標的と同じメーカーから入手しました
マイクロ遠心分離機チューブ、Axygen Scientific、非滅菌、1.7 ミリリットル	VWR	10011-722	製造元がAuNPアッセイに大きな影響を与えることが分かり、チューブは社内でオートクレーブ処理されていました
ヌクレアーゼフリーウォーター
メタノール