Method Article

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

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転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF DNA結合の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)およびDNAアフィニティー沈殿アッセイ(DAPA)分析のための詳細な実験プロトコルが提供されています。

Abstract

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集団および家族ベースの遺伝学的研究は、通常、臨床的疾患または表現型と統計的に関連する遺伝的変異の特定をもたらします。多くの疾患や形質では、ほとんどの変異体はノンコーディングであるため、遺伝子発現を制御する微妙で比較的予測が難しいメカニズムに影響を与えることで作用する可能性があります。ここでは、ノンコーディングバリアントを優先し、その機能をスクリーニングするための一般的な戦略的アプローチについて説明します。このアプローチには、機能ゲノムデータベースを使用した計算の優先順位付けと、それに続くリスク対立遺伝子および非リスク対立遺伝子への転写因子(TF)の差次的結合の実験的分析が含まれます。遺伝的変異の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)およびDNA親和性沈殿アッセイ(DAPA)分析の両方で、合成DNAオリゴヌクレオチド(オリゴ)を使用して、疾患または表現型関連細胞の核溶解物中の因子を同定します。EMSAでは、結合した核因子の有無にかかわらずオリゴヌクレオチド(多くの場合TF)を、トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)ポリアクリルアミドゲル上の非変性電気泳動により分析します。DAPAでは、オリゴヌクレオチドを磁気カラムに結合させ、DNA配列に特異的に結合する核因子を溶出し、質量分析または還元型ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分析し、その後ウェスタンブロット分析を行います。この一般的なアプローチは、あらゆる疾患、形質、表現型に関連するノンコーディング遺伝的変異の機能を研究するために広く使用できます。

Introduction

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ゲノムワイド関連研究（GWAS）を含むシーケンシングおよびジェノタイピングベースの研究、候補遺伝子座の研究、およびディープシーケンシング研究は、統計学的疾患、形質または表現型と関連している多くの遺伝的変異を同定しました。初期の予測に反して、これらの変異体（85-93％）の大部分は非コード領域に位置しており、タンパク質1,2のアミノ酸配列を変更しません。これらの非コード変異体の機能の解釈と関連する疾患、形質または表現型にそれらを接続する生物学的メカニズムを決定することは3-6に挑戦証明されています。遺伝子発現 - 私たちは、重要な中間表現型にバリアントをリンクする分子メカニズムを識別するための一般的な戦略を開発しました。このパイプラインは、特に遺伝的変異による結合TFの調節を同定するために設計されています。この戦略を予測することを目的とした計算手法および分子生物学技術を組み合わせインシリコ候補変異体の生物学的効果、および（ 図1）、経験的に、これらの予測を検証します。

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図1： 非コ....

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Protocol

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ソリューションおよび試薬の調製

  1. EMSAとDAPAで使用するためのカスタムDNAオリゴヌクレオチドプローブを注文してください。
    1. 、非特異的タンパク質結合を減少させる（長さ35から45塩基対（bp）の間の）短いオリゴ30を設計し、その17 bpの内在性ゲノム配列によって挟ま中心部に関心の変形を配置します。 EMSAオリゴについては、5 '蛍光団を追加します。 DAPAオリゴについては、5 'ビオチンタグを追加します。
    2. センス鎖およびその逆相補鎖の両方を注文。また、二重（予備アニール）オリゴを注文。オリゴに名前を付けるときは、確立された基準ゲノム上の命名法の基礎としています。
      注：「リスク」と「基準」と「非参照」は、より普遍的に関連している一方で、「非危険」指定は、病気やプロジェクト固有することができます。
    3. オリゴの到着すると、簡単に100μの最終濃度にヌクレアーゼフリー水に内容を再懸濁をスピンダウン; M。ストアは、-20℃でストックを再懸濁しました。アルミホイルで包むことにより光からフォアでタグ付けされたオリゴを保護します。
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Results

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このセクションでは、EMSAまたはDAPAを実行するときに何を期待するの代表的な結果が提供され、そして溶解物の品質に関して変動性が特徴です。例えば、複数回の凍結融解のタンパク質試料は変性をもたらし得ることが示唆されています。これらの「凍結融解」サイクルの文脈においてEMSA分析の再現性を調査するために、1遺伝子変異体で異なる2 35 bpのオリゴが指示された量のために解凍し、再凍結した核溶解物の単一バッチと共にインキュベートしました。回の図2を 、この特定のBリンパ球の核抽出液まで5回凍結融解することは、一見するタンパク質の完全性に影響を与えないことを示しています。しかし、核タンパク質の安定性は、サンプルによって異なりますので、使用する個々のセルラインでテストする必要があります。異なるバッチpreparからの変化を有することも可能です核溶解物のations。この変化は溶解前に、細胞継代数、または他の要因に細胞周期の段階によるものであるかどうかは、実際の結果を確実にするために、溶解物の異なるバッチを使用して、EMSAの結果を再現することが重.......

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Discussion

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シーケンシングおよびジェノタイピング技術の進歩は著しく、疾患に関連する遺伝子変異体を同定するために我々の能力を強化しているが、これらの変異体によって影響を受ける機能のメカニズムを理解するために我々の能力が遅れています。問題の主な原因は、多くの疾患関連変異体は、上のコード可能性が高い遺伝子発現を制御困難ツー予測メカニズムに影響を与えるゲノムの領域、n個に位置していることです。ここでは、EMSAとDAPA技術に基づくプロトコル、おそらく多くの非コード変異体の機能に寄与遺伝子型に依存するTF結合事象を識別するための貴重な分子ツールを提示します。これらの二つの技術は、過去に広く使用されてきたが、それらは、ごく最近TF結合の遺伝的変異の分析のために適応されています。 TFを超えて、EMSAは、プロトコル36にわずかな調整をRNA結合タンパク質の遺伝的変異の効果を分析するために使用することができます。

ove_contentは ">本明細書に提示プロトコルは、シンプルかつ実行するのは簡単です。それにもかかわらず、特定の部分は、実験前に追加の考慮を必要とする第一に、厳密な統計分析を行うことで、.......

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Disclosures

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著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgements

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プロトコル開発におけるインプットとディレクションを提供してくださったErin Zoller氏、Jessica Bene氏、Lindsey Hays氏に感謝します。MTWは、NIH R21 HG008186と、シンシナティ小児病院研究財団からの受託者賞の助成金によって部分的に支援されました。ZHPはT32 GM063483-13によって部分的に支援された。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
カスタムDNAオリゴヌクレオチド統合されたDNA技術
http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 塩化カリウムフィッシャーサイエンティフィックBP366-500KCl、CEバッファーHEPES
(1 M)用フィッシャーサイエンティフィック15630-080CEおよびNE
バッファーEDTA(0.5M)、pH 8.0Life TechnologiesR1021CE、NE、およびアニーリングバッファー用
塩化ナトリウムFisher ScientificBP358-1NaCl、NEバッファー用
Tris-HCl (1M)、pH 8.0InvitrogenBP1756-100アニーリングバッファー
リン酸緩衝生理食塩水 (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS、細胞洗浄用
DL-ジチオスレイトール溶液 (1 M)Sigma646563還元剤
プロテアーゼ阻害剤カクテルThermo Scientific87786
ホスファターゼ阻害剤カクテルThermo Scientific78420TFの脱リン酸化を防止
Nonidet P-40 核IBI ScientificIB01140NP-40
BCAタンパク質アッセイキットThermo Scientific23225タンパク質濃度の測定用
Odyssey EMSAバッファーキットLicor829-07910必要なすべてのEMSAバッファーを含む
TBEゲル、6%、12ウェルInvitrogenEC6265BOXEMSA
TBE バッファー用 (10x)Thermo ScientificB52For EMSA
FactorFinder Starting KitMiltenyi Biotec130-092-318必要なすべてのDAPAバッファーが含まれています
Licor Odyssey CLxLicorDAPA/EMSA用推奨スキャナー
抗生物質-抗真菌剤Gibco15240-06210,000ユニット/ mlのペニシリン、10,000µが含まれています。ストレプトマイシンのg / ml、および25 µ菌類のg/ml®Antimycotic薬剤
のウシの胎児の血清Gibco26140-079FBS、培養媒体
RPMI 1640 媒体のためのGibco22400-071Lグルタミンおよび25 mM HEPESを含んでいる
用 TFs の異化作用を防止します 抽出用の代替

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

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Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

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