ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Summary

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。

Abstract

単一細胞の不均一性を研究することは、多くの生物学的問題にとって非常に重要ですが、技術的には困難です。そのため、シングルセル培養実験を行うためのシンプルでありながらハイスループットな方法が求められています。ここでは、高効率のシングルセル単離(~77%)のためのマイクロ流体チップベースの戦略を報告し、クローン生成アッセイを使用して長期シングルセル培養(最大7 d)および細胞不均一性分析を実行する能力を実証します。これらのアプリケーションは、KT98マウス神経幹細胞、A549およびMDA-MB-435ヒトがん細胞で実証されました。高いシングルセル分離効率と長期培養能力は、マイクロ流体チャネルの上部と下部で異なるサイズのマイクロウェルを使用することで達成されます。スモールマイクロウェルアレイはシングルセルを正確に単離するために設計されており、ラージマイクロウェルアレイはマイクロ流体チップでのシングルセルクローン培養に使用されます。このマイクロ流体プラットフォームは、分離効率を低下させることなく、さまざまな培養戦略に合わせて調整可能な細胞培養スペースの柔軟性により、シングルセル培養アプリケーションにとって魅力的なアプローチを構成します。

Introduction

現在、培養空間内に個別に単一細胞を配置することは、一般に、限界希釈または蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用することによって達成されます。それだけで容易に入手可能であるピペット組織培養プレートを、必要とする多くの研究室は、希釈を制限することは、便利な方法です。この場合には、細胞懸濁液を直列適切な細胞密度に希釈し、その後手動のピペットを使用して培養ウェルに入れました。これらの区画の単一の細胞は、次いで^、1コロニー形成^2のスクリーニング遺伝的異質性として、細胞分析のために使用されます。限界希釈法のポアソン分布の性質は^37％3の最大確率に単一細胞事象を制限するため、この方法は、支援のためにロボットアームを利用することなく、低スループット、労働集約的です。統合されたロボットアームとFACSマシンは正確にPLACによってポアソン分布の限界を克服することができます時間⁴で培養ウェル内の1つの単一細胞をる。しかし、高い機械的剪断応力^5（従って、細胞生存率を低下させ）、機械購入および運用コストは、多くの研究室での使用が制限されています。

上記の制限を克服するために、マイクロスケールデバイスは、高効率マイクロウェル⁶に単一細胞をロードするために開発されてきました。しかし、マイクロウェルは、ロードされた細胞が原因で、単一セルの負荷の確率を最大化するために単一のセルのそれに近いマイクロウェルそれぞれのサイズを作る必要があるため、増殖するために十分なスペースを提供していません。培養アッセイは、多くの細胞ベースのアプリケーション（ 例えば、クローン原性アッセイ^7）で必要とされるように、（90から-直径又は一辺の長さ650ミクロン）より大きいマイクロウェルは、拡張、細胞培養を可能にするために利用されています。しかし、限界希釈法のように、彼らはまた、10に至るまで、低い単セル負荷効率を有している- ^。30％8、9

以前、我々は個々のマイクロウェル内の単一細胞を単離し、単離された細胞のクローン原性アッセイにおけるその適用を実証するためにハイスループットマイクロ流体プラットフォームを開発しました^。10デバイスは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）で作られた、およびマイクロウェルアレイの2組を備えました主としてそのサイズのマイクロウェルに1つのセルを負荷の効率を向上させることができる別のマイクロウェルのサイズと細胞よりも有意に大きいです。注目すべきことに、この「二重井戸」の概念は、培養領域の大きさを柔軟それは簡単な異なる細胞型およびアプリケーションに合わせて装置の設計を調整すること、単一細胞捕獲効率に影響を与えることなく調整することができます。この高効率の方法は、細胞の不均一性の研究およびモノクローナル細胞株の確立のための長期の細胞培養実験のために有用です。

Protocol

注：私達のマイクロ流体デバイス製造用のフォトマスクの設計は、コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して描かれました。設計は、その後の商業サービスを使用してクロムフォトマスクを作製するために利用されました。 PDMSデバイスは、ソフトリソグラフィ技術を用いて製造した^。11

リソグラフィによりマスター金型の1製作

1. フォトリソグラフィ工程¹²の前に、基質として4インチのシリコンウエハを使用し、10分間120℃で、従来のオーブン内でウェーハを脱水します。
2. プラズマクリーナーで30秒間、100ワットで酸素プラズマ処理を使用して脱水したシリコンウェーハをクリーニング。
3. 次の焼成工程のために、それぞれ65℃、95℃、2つのホットプレートを予熱。
4. スピンコーターを用いて洗浄されたシリコンウェハ上にネガ型フォトレジスト（PR）のコート5 gであり30秒間1,200rpmで（SU-8 50）における回転は、マイクロチャネル層を作製しました。
5. PRを配置12分間65℃で予熱したホットプレート上のウエハをコーティングし、ソフトベーク処理を行う（厚さ100μmのパターンについて）33分間、95℃でさらに予熱したホットプレートに移します。
6. 焼成後、半自動マスクアライナのホルダーにPRコーティングされたシリコンウェハを配置し、25400 dpiの解像度透明度のフォトマスクに合わせます。
7. シリコンウェハ上のフォトレジストパターンを作成するために500ミリジュール/ cm ²の線量でUV光（365 nm）にPRコーティングされたシリコンウェハを露出させます。
8. アライナからウエハを取り外し、12分間95℃でポストベーク用のホットプレートの上に置きます。
9. アライメントマークを露出させるために12分間、窒素ガスを穏やかに乾燥するための未架橋PRを洗浄するためにSU-8現像液（プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、PGMEA）溶液中にウェーハを浸します。
10. 再び、スピンコーターによりウェハ上のネガ型フォトレジストのコート5グラム。 300＆30秒30秒、1,200rpmで（SU-8 10）のために700回転（SU-8 100）におけるスピン＃181;メートルの厚さのパターンと27ミクロンの厚さのパターンは、それぞれのマイクロウェル層を作製しました。
11. （27ミクロンの深キャプチャウェル層のための）8分間、4分間65℃でホットプレート上で95℃でPR塗布されたウエハを配置。そして40分間65℃と（300μmの深い文化ウェル層用）110分間95℃で。
12. 冷却した後、UV光を備えたマスクアライナ上にPRコーティングされたシリコンウェハを置きます。
13. （27ミクロンの厚さのパターン用）を250mJ / cm ²であり、（厚さ300μmのパターン用）700ミリジュール/ cm ²の線量でUV光（365nm）にPRコーティングされたシリコンウェハを公開します。
14. それぞれ5分（27μmの厚さのパターン）、30分（厚さ300μmのパターン）、95℃でのウェハ焼きます。
15. それぞれ、6分（27μmの厚さのパターン）のためにPGMEAおよび25分（厚さ300μmのパターン）により未架橋PRを洗い流し、その後、窒素ガスでそれらを乾燥させます。
16. パターンの高さを測定上の特徴走査型レーザプロフィルメータのXYステージ上にウエハを配置することによって走査レーザープロフィルを有するウェーハ。
    1. 焦点面を調整し、明らかにパターンが20X対物レンズの下に「カメラビュー」観察モードを使用することにより、ウエハ上に備えて表示します。
    2. 「レーザービュー」に「カメラビュー」から観察モードを切り替えて、特徴の上下位置を設定します。
    3. それぞれの測定モード、エリア、品質、および透明（上部）までのz-ピッチ、1ライン（1024×1）、高精度かつ0.5μmで、設定し、測定を開始するスタート底を押してください。

単一細胞の単離のためのPDMSデバイスの作製

1. PDMS鋳造する前に、それが簡単にマスターモールドからPDMSのレプリカをはがしすることができ、疎水性​​の表面を、作成するために、トリクロロシランとマスター金型をsilanize。
   1. マスター金型と重み入りのボートを配置200デシケーター中のトリクロロシランのμlの、そして15分間真空（-85キロパスカル）を適用します。
   2. 真空を停止し、その後、少なくとも1時間室温でマスター金型をsilanizeデシケーターでマスター金型を残します。
   3. デシケーターからマスターモールドを取り外し、10センチメートルペトリ皿に各マスターモールドを配置します。
2. 10の割合で塩基及び硬化剤を含有する17.6グラムのPDMSポリマーキットの総量ミックス：1、次いでペトリ皿にマスターモールド上にPDMSを注ぎます。
3. デシケーター中でペトリ皿を置き、PDMS中の気泡を除去するために、1時間真空（-85キロパスカル）を適用します。
4. デシケーターからペトリ皿を取り外し、3、65℃で通常のオーブンに入れてください - PDMSを硬化させるために6時間。
5. マスター金型から硬化PDMSのレプリカを削除し、0の内径とパンチャーによって捕獲ウェルアレイPDMSのレプリカでマイクロチャネルの両端に入口と出口のように2つの穴をパンチ。流体チャネル（ 図2A）のための75ミリメートル。
6. PDMSレプリカの表面をきれいにしてから、短時間の酸素プラズマ処理（14秒間100ワット）のためのプラズマクリーナーにPDMSのレプリカを配置するためにテープを使用してください。
7. 酸素プラズママシンからPDMSのレプリカを削除します。
8. 実体顕微鏡下で手で（キャプチャマイクロウェルを含む）上部と下部のPDMS（培養マイクロウェルを含む）レプリカを合わせ、接触にそれらをもたらします。
9. 最終的なデバイスを形成するために、PDMSレプリカとの間の永久的な結合を達成するために24時間65℃のオーブンに整列PDMSレプリカを置きます。
10. PDMSデバイスのマイクロ流路から空気を除去するために15分間（-85キロパスカル）を、脱イオン（DI）でPDMSデバイスを浸し - 水充填された容器と、真空下でデシケーター中でコンテナを配置します。
11. 組織培養フードにDI水で満たされたPDMSデバイスを配置し、UV光（光の波長：254 nm）を使用して30マイルのためにデバイスを滅菌しますn個。
12. 1×PBS溶液中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）とPDMS装置にDI水を交換し、PDMSの表面に付着する細胞を防ぐために、37℃で30分間インキュベートします。
    注：BSAコーティングは、培養ウェルにキャプチャーウェルから単離された細胞の転送効率を向上することが重要です。
13. 滅菌1×PBS溶液でPDMSデバイス中の5％BSA溶液を交換してください。

単一細胞懸濁液の調製

1. 培養神経細胞のKT98、およびヒト癌細胞A549およびMDA-MB-435、我々幹PDMSデバイス細胞実験のために細胞を調製するための従来の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2、95％湿度）でペトリ皿中。
2. 80％のコンフルエンス - 70まで増殖させた細胞で培養皿から除去し、廃棄する使用済みの培養培地（10％ウシ胎児血清および1％抗生物質を与えDMEM基礎培地）。
3. 静かに滅菌PBSで3回細胞を洗浄します。
4. （詳しい情報については、物質一覧をご参照ください）​​を取り外し、PBSを捨て、およびタンパク質分解、コラーゲン、およびDNアーゼ活性を有する組換え酵素混合物の2ミリリットルを追加します。
5. 5分間、室温で培養皿をインキュベートし、その後細胞の剥離を容易にするために培養皿をタップします。
6. 細胞を分散させるために滅菌PBSの4ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を転送します。
7. 3分間300×gでチューブを遠心し、上清を除去します。
8. 静かにPBS滅菌1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁し、標準的なトリパンブルー排除法^13を用いて、生細胞数をカウントします。
   注：この再懸濁手順は、単一細胞分離効率を向上させるために十分に解離し、単一細胞懸濁液を調製するのに重要です。

4.単一細胞の単離およびクローン培養

1. 2.5×10 - 2.2の濃度の負荷50μlの細胞懸濁液を 6細胞/ ml。
   注：細胞懸濁液をローディングピペットをマイクロチャネル内に気泡を導入することを避けるために停止し、最初の停止位置に保持する必要があります。
2. 均等に細胞と全体のマイクロチャネルを埋めるために、入口孔を通して細胞懸濁液の別の50μLをロードします。
3. 入口と出口の穴上の液滴からの静水圧によって誘発される流れを回避するために、プラグ（長い3ミリメートル、直径1mmカットナイロン釣り糸）と出口穴を塞ぎます。
   注：プラグは使用前に、組織培養フードの内部に滅菌UVました。
4. 、培地で1ミリリットルの無菌注射器を埋めることから気泡を排出し、シリンジポンプにそれを設定。
5. 23 G鈍針とポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブを経由してPDMSデバイスの入口孔への媒体ロード注射器を接続します。
6. コンセントの穴からプラグを外し、すべてのOW 2分間の時間間隔は、細胞が重力によって単一細胞捕捉ウェルに落ち着くことを可能にします。
7. シリンジポンプによって駆動を600μl/分の流速で培地300μlで捕捉されていない細胞を洗い流します。
8. デバイスを安定させるために2分間待って、閉じた培養システムを形成するためのプラグと、入口と出口の穴をシールします。
9. 培養マイクロウェルに捕捉され、単一細胞を転送するために、手でデバイスを反転します。
10. 100-mm組織培養皿にPDMSデバイスを配置し、マイクロチャネルからの培養培地の蒸発を避けるために、デバイスの周りに滅菌PBSの10ミリリットルを追加します。
11. 単一細胞のクローン培養物のための従来の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2、95％湿度）で培養皿を動かします。

5.培養培地補充

1. 培養の1日後、細胞PRを改善するために、新鮮な培地でPDMSデバイスに培地を交換しoliferation。
2. 次のステップを実行している間、マイクロチャネル内に気泡を導入することを避けるために、入口および出口孔領域の近くにPDMS装置の上に培地二の液滴を置き。
3. 入口とマイクロチャネルのための出口としてマイクロ流路の両端近くにPDMSデバイスの上から2穴パンチ。
   注：PDMSデバイスの全体的な二層パンチスルーしないでください。代わりに、ちょうどPDMSの最上部層を介してパンチ。
4. 23 G鈍針とPTFEチューブを経由して入口に新鮮な培地を含有する1ミリリットルのプラスチックシリンジを接続します。
5. 古い培地を交換するために5分間のデバイスに120μlの新鮮な培地を流します。
6. 入口と出口の穴を密閉し、細胞培養インキュベーターにデバイスを戻すために2つのプラグを挿入します。
7. 5.5に手順5.4を繰り返し、続いて、シールプラグを、除去することにより、培養期間中に培地ごとに2日間を更新します。

Results

単一細胞の単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォームは、マイクロウェルアレイ（ 図2A）の2組のマイクロチャネル（高さ200μm）を備えています。マイクロウェルアレイの2セットは、キャプチャウェル（直径25ミクロン、深さ27μm）とし、それぞれ単一細胞の単離および培養用の培養ウェル（直径285ミクロン、深さ300μm）であり、それぞれと呼ばれています上面図（ 図2B）から見たときに捕捉ウェル培養ウェルの中央に位置しています。デバイス動作について（概略動作フローを図1に示されている）、必要な装置（シリンジポンプ、組織培養インキュベーター、および顕微鏡）や消耗品（シリンジ、ピペット、およびチューブ）は、生物学的実験室で一般に入手可能です。また、プラットフォームの移植性及び透明性は、細胞が容易にConvenとを備えた装置で観察し、分析することが許さ細胞培養実験中的な顕微鏡。

Discussion

マイクロウェルベースのデバイスシステム^{6,14は 、6を}捕捉^する大型単セル及び単一造血幹細胞の増殖を¹⁵として、単一細胞操作及び分析のために利用されています。ウェルのサイズ、数、及び形状は、特定の用途のために調整可能であるがウェルのサイズを大きくすると、単一細胞分離効率が常に損なわれる^。9,15

マイクロサイズは細胞拡散と成長を可能にするために拡大している間に、この制限を克服するために、パークらは 、高単一細胞捕捉率（58.34パーセント）を持つ三角形のマイクロウェルを持つマイクロ流体チップを報告しました。ただし、（サイド〜50μmの長さ）マイクロウェルは最大2日間細胞の増殖をサポートすることができました^。16私たちのデュアルウェル戦略は、大規模なマイクロウェル内の単一セルの負荷はポアソン確率によって限定されるものではないことができますDILUを制限する際に遭遇分布ション方法とサイズ、少なくとも7日間（ 図4A）

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCADソフトウェア	Autodesk	AutoCAD LT 2011	部品番号 057C1-74A111-1001
シリコンウェーハ	Eltechの株式会社	SPE0039
従来のオーブン	YEONG-SHIN社	ovp45
プラズマクリーナー	ノードソン	AP-300	ベンチトッププラズマ処理システム
SU-8 50 ネガフォトレジスト	MicroChem	Y131269
SU-8 100 ネガティブフォトレジ	MicroChem	Y131273
スピンコーター	Synrex Co.,株式 会社。	SC-HMI 2インチ ~ 6インチ
ホットプレート	YOTEC 社	YS-300S
Msak アライナー	デヤ オプトロニック	A1K-5-MDA
SU-8開発者	グランドケミカルカンパニー	ズ GP5002-000000-72GC	プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート
走査型レーザープロファイラー(表面形状測定機	) キーエンス	VK-X 100
トリクロロシラン	Gelest, Inc	SIT8174.0	トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル。危険な。気道を腐食し、水と激しく反応します。
デシケーター	Bel-Art Products	F42020-0000	省スペース真空デシケーター 190 mmホワイトベース
ポリジメチルシロキサン(PDMS)キット	ダウコーニング	シルガード184
ハリスユニコアパンチャー	テッドペラ株式会社	15072	内径 0.75 mm
リムーバブル テープ	3M 会社	スコッチ リムーバブル テープ 811
実体顕微鏡	ライカ マイクロシステムズ	ライカ E24
ウシ血清アルブミン (BSA)	バーシング テクノロジー	ALB001.500
DMEM 基礎培地	Gibco	12800-017
ウシ胎児血清	サーモ ハイクロン	SH30071.03HI
抗生物質	Biowest	L0014-100	グルタミン-ペニシリン-ストレプトマイシン
組換え酵素混合物	革新的な細胞技術	AM-105	Accumax
DiIC12(3) 細胞膜染料	BD バイオサイエンス 354218		細胞トラッカーとして使用
シリンジポンプ	ハーバード大学装置	703007
プラスチックシリンジ (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 ゲージ鈍針	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
ポリテトラフルオロエテン(PTFE)チューブ	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	内径 0.51 ミリメートル;外径、0.82 ミリメートル