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方法論記事

熱の予防によりラットに悪影響をストレス

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DOI:

10.3791/54122

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2016年7月11日

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, Auburn University

この記事について

サマリー

私たちは、善玉菌による経口前処理によるラットの熱ストレス影響の予防のためのプロトコルを説明しました。このプロトコールは、さまざまな投与経路やさまざまな化合物の分析に変更を加えて使用できます。

要約

この研究は、熱ストレスに関連する合併症に対するバチルス・ズブチリス株の保護効果を評価するために設計しました。 32個のSprague-Dawleyラットをこの研究で使用しました。動物は、経口Bとの 2日間、1日2回処理しました。 サブチリス BSB3株またはPBS。最後の処置後の翌日、各グループを分割し、2つの実験群（PBS及び枯草菌で処理したものと処理したもの）25分間、45°Cのに置きました。 2つの対照群は、室温で25分間滞在しました。全てのラットを安楽死させ、別のパラメータは、すべての群で分析しました。熱ストレスの悪影響が絨毛の高さと腸上皮における総粘膜の厚さの減少により登録されています。内腔からの細菌の転。赤血球および血液中のリポ多糖（LPS）レベルの上昇の小胞形成を増加させました。治療の予防効果は、事前によって評価されますこれらの副作用の発明。プロトコルは、熱ストレスの合併症の予防のための細菌とラットの経口治療のために設立されたが、このプロトコルは、他の投与経路のために、異なる化合物の分析のために修正して使用することができます。

概要

異なるストレッサーが人間と動物の健康に影響を与えます。体温は最もストレスの多い要因の1つであり、慢性、急性、さらには致命的な病気を引き起こします1。熱ストレス後の腸の形態の変化と腸バリアの完全性の喪失は、多くの場合、文書化されています2,3。この保護バリアは、腸内細菌とその毒素、特にリポ多糖類(LPS)の内腔から内部循環への転座に対する防御に関与しています4,5。腸内細菌叢の安定性は、腸のバリア機能、宿主の免疫応答、およびストレス条件に対する耐性に大きく影響します6。したがって、腸内細菌叢の調節は、ストレス関連の副作用を予防するための新しいアプローチを提供できます。

有益な細菌は、下痢、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、代謝障害などのさまざまな臨床状態を成功裏に管理するための腸内細菌叢を改変するための有望な戦略として使用されてきました。善玉菌のプロバイオティクス効果には、腸の健康をサポートする必須代謝産物の産生、免疫系の刺激、乳糖耐性の促進、上皮機能障害の回復などがあります。プロバイオティクスは、in vitroおよび動物モデル11,12において、ストレス関連合併症の予防に有効であった。

研究者たちは、これらの細菌が腸の恒常性13をサポートし、宿主14に有益な効果をもたらすため、プロバイオティクスとしてバチルス菌により多くの注意を払っています。私たちの以前のデータは、in vitro15,16および臨床試験17,18で、病原体に対するバチルスプロバイオティクスの高い有効性を示しました。ここでは、B. subtilis BSB3株の熱ストレス後の合併症に対する予防効果の評価を目指します。

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プロトコル

全ての実験手順は、オーバーン大学のIACUC、オーバーン、アラバマ州によって承認されました。

文化メディア、食器や細菌培養の作製

  1. 栄養寒天プレート上で一晩増殖させた枯草菌 BSB3文化の単一コロニー、フラスコに栄養培地の10ミリリットルを接種します。
  2. バクト栄養ブロス、8グラム1.2％（v）の硫酸マグネシウム4×7H 2 O、10ミリリットル/ワット;寒天、15;（v）の塩化カリウム、10ミリリットル/ wの10％：リットル当たり（19培地胞子形成の500ミリリットルを作りますg）を、20分間121°Cのオートクレーブ。 50°Cのに冷却し、以下の滅菌溶液を追加することを許可する：1 MのCa（NO 3）2、1ミリリットルを、 0.01 MのMnCl 2、1ミリリットル。 1 mMのは4、1ミリリットルをのFeSO。
  3. 室温で20分間40°Cのに準備された培地を冷却し、滅菌キャビネットに20の滅菌ペトリ皿のそれぞれに25ミリリットルを注ぎます。媒体は一晩固化してみましょう。
  4. Bの一晩培養物0.5ミリリットルを広めますacillusサブチリスBSB3ペトリ皿中の培地の表面上に。 90％の胞子形成するまで、5日間37°Cの時に文化をインキュベートします。高解像度の顕微鏡による位相明るい胞子を明らかにしました。
  5. プレートに無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1ml添加​​し、無菌細胞スプレッダーを用いて表面から細菌を掻き取ることによって収穫細菌。必要になるまで冷蔵庫にサスペンションを保管してください。
  6. 37 O℃で24時間- 18のためのインキュベーションに続いて胞子形成培地プレート上の細菌懸濁液の適切な希釈（10 -5〜10 -6）の0.1ミリリットルをメッキすることにより細菌の生存能力を確認
  7. コロニーカウンターを用いて、プレート上の細菌コロニーをカウントし、テストした懸濁液中の細菌の力価を計算します。最終濃度が1×10 8 CFU / PBS中のmlの細菌懸濁液を準備します。

2.動物

  1. 300グラム - 32オスのSprague-Dawleyラット（250を使用します）。標準のペレット餌と水に自由にアクセスできる特定の病原体を含まない条件下で動物を維持します。平均温度（21±1 O℃）、湿度（50±5％）と12時間の明暗サイクルを確立します。

3.実験計画

  1. 順化の2日後、強制経口投与11により、動物の治療を開始します。強制経口投与針で注射器を使用してください。 Bで16匹のラットを扱いますズブチリス BSB3懸濁液（ラット当たり1ミリリットル）2日間一日二回（ 枯草菌群 ）。 PBSで16匹のラットの治療（ラット当たり1ミリリットル）一日二回2日間（PBS群）（図1）。
  2. グループ1-コントロール（PBS /ストレス無し）、グループ2位B.：処理後、各グループ（グループ当たり8匹のラット）を細分化枯草菌 （ 枯草菌 /ストレスなし）、グループ、3-ストレス（PBS /熱ストレス）とグループの4- B.枯草菌 +ストレス（ 枯草菌 /熱ストレス）。
  3. ELECを使用して、各ラットの直腸温度を測定デジタル温度計をTRONIC。 25分間室温でグループ1と2のラットを保管してください。 25分間、45 O Cと相対湿度55％での人工気象室に入れグループ3と4の動物を。
  4. その後、電子デジタル体温計を使用して、すべてのグループ内の各ラットの直腸温度を測定します。 4時間室温ですべての動物を配置します。
  5. 密閉可能な麻酔ジャー中 - （4％2）とラットを深く（つま先のピンチへの応答の欠如）を麻酔されるまで観察イソフルランでラットを麻酔。ギロチンで迅速な断頭によりラットを安楽死させます。
  6. 血清を取得し、すぐに顕微鏡検査のためのピペットを用いて血液のサンプル（各ラットから7μl）を取るために非発熱性のチューブに非発熱性ピペットで- （16ミリリットル15）各ラット20からトランク血液を採取します。
  7. 凝固を可能にするために、少なくとも30分間、冷蔵庫で血液を試験管に入れてください。 20°Cの時の遠心分離管、7,000×gで10分間、迅速にピペットで血清を除去。一定分量の血清をアッセイまで-20 O Cで50μlのボリュームとストアに各ラットから得られました。

4.手術手順

  1. カット/電気ハサミでカーカスの下の腹部と胸部からすべての毛皮をトリミング。滅菌キャビネットにカーカスを配置し、70％アルコールでカーカスの毛を剃っ表面を処理。
  2. 腹部の正中切開を作成するために、滅菌メスを使用してください。滅菌ピンセットを用いて、各ラットから肝臓、腸間膜リンパ節、脾臓、および小腸を削除します。

細菌転移の5分析

  1. 予め秤量した滅菌チューブに肝臓、腸間膜リンパ節および脾臓の各サンプルを置き、重量を量ります。サンプルとチューブの重量と空のチューブの重量の差として試料の重量を計算します。
  2. 1:10希釈液を得るためにチューブに無菌PBSを加える（w / v）のサンプルとhomoge均一な懸濁液21を得るために、滅菌ガラス組織ホモジナイザーで各サンプルをnize。
  3. 滅菌PBSで各サンプルの連続希釈（10 -1〜10 -4）を作成します。プレートヘミン（0.005グラム/ L）とビタミンK1（0.01グラム/ L）プレートとマッコンキーの表面および5％血液寒天とブルセラ血液寒天上に各組織のすべての希釈の0.1ミリリットル。
  4. 37°Cの 22で嫌気性条件下マッコンキー、5％血液寒天プレート好気的およびブルセラ血液寒天プレートをインキュベートします。
  5. 24時間後に好気性細菌のコロニー、およびコロニーカウンターを用いて、インキュベーションの48時間後の嫌気性細菌のコロニーを数えます。組織のグラムでのコロニー形成単位（CFU）の数として結果を表しています。

6.組織学的解析

  1. （ - 4.2 4.1ステップ）、外科的処置によって、各ラットから小腸サンプルを削除します。ブアン固定液、パラフィン中に埋め込み、内のサンプルを修正しました。標準的な手順23を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシンで6μmのセクションおよび染色切片を作製。
  2. 各サンプル（倍率100X）24で腸絨毛と総粘膜の厚さの高さを測定するための高解像度の顕微鏡システムを使用してください。各ラットからの4つのサンプルを分析し、各試料中の少なくとも20の測定を行います。マイクロメートルで結果を表現します。

7.サイトカインアッセイ

  1. IL-1βのための商業用ラットのELISAキットを使用します。 IL-6。 TNF-α;製造業者のプロトコールに従って血清中のサイトカインのレベルを測定するためのINF-γ、およびIL-10。
  2. 関連するキットの標準を使用してアッセイしたサンプルの各セットのための標準曲線を生成します。適切な標準曲線と実験データを比較することにより、各サンプル中のサイトカインのレベルを定義します。

8.リポ多糖アッセイ

  1. に従ってラットLPS ELISAキットを用いて血清中のLPSのレベルを分析製造業者のプロトコル。標準曲線の値で得られた値と比較することにより試料中のLPSの濃度を推定します。

血液の9高解像度光学顕微鏡

  1. 以前に25,26説明した顕微鏡システムを使用してください。ライブ画像を記録する顕微鏡システムの基本とビデオカメラとコンピュータ25として防振プラットフォームを使用します。以前に27を説明したようにリチャードソンのスライドを使用してテスト画像を調整します。
  2. スライドガラス、カバーガラス、写真上の各ラットから新たに採取した血液の7μLを置 ​​き、各サンプル（倍率1,700X）で72×53.3ミクロン2の10の画像フレームを記録します。
  3. リアルタイムで高解像度の直視光学像を提供するソフトウェアを使用して、小胞の濃度を測定します。各実験条件28のための20の画像フレームの最小値を調べます。

10. STATISチック

  1. 平均と標準偏差としてすべての値を表現します。統計分析とグラフ描画を実行します。 2標本t検定を用いた結果を分析し、統計的有意性を定義するために0.05で有意水準を設定します。

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結果

熱ストレス前後とすぐに動物の平均体温は、それぞれ36.7±0.07 O Cと40.3±0.17°Cの 、（P <0.05）でした。熱への暴露ラット（群3）は、絨毛の高さおよび全粘膜の厚さ（図2、図3）の有意な阻害をもたらしました。ストレス前BSB3株の経口投与は、熱の有害な影響から腸を保護しました。

腸からの細菌のトランスロケーションは、腸間膜リンパ節（MLN）、各ラットの肝臓および脾臓の細菌学的分析により決定しました。 1.7×10 3±4.6×10 2 CFU / g組織（図4）の濃度の細菌培養をPBSで前処理し、熱（グループ3）にさらさのみMLNから単離され、ラットの肝臓でした。対照ラット（グループ1、2）からと熱ストレスを受けた動物からの全ての試験されたサンプル滅菌したBSB3株（グル...

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ディスカッション

深刻な健康状態29内の高温の結果への暴露。予防と熱ストレスに関連する合併症の早期発見は極めて重要30です。 提示されたプロトコルは、熱ストレスの有害作用の防止のための様々なアプローチの有効性を評価するために使用することができます。

このプロトコル内の重要なステップは次のとおり熱処理手順（45°Cの 、25分）。エンテロトキシンによる汚染を防止するために、血液の収集および処理の間に非発熱性の材料の使用。凍結融解の繰り返しを避けるために、-20 O Cに血清のアリコートを保持します。および細菌転移の解析中に、滅菌手順を以下に示します。プロトコルは、熱ストレスの副作用の防止のための細菌とラットの経口治療のために設立されました。投与および他の化合物の他の経路については、このプロトコルを修正することができます。 TRの例について、時間熱ストレス前eatmentを延ばすことができます。経口投与、直腸投与に変更することができる。 枯草菌は、高温への曝露の前...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作業はオーバーン大学基金FOP 101002-139294-2050の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOP4417
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. 米国コネチカット州ブルックフィールド 64-17-5
寒天VWR97064-334
マッコンキー寒天プレートVWR470180-742
5%血液寒天プレートVWR89405-024
ヘミンとブルセラ血液寒天プレート、およびビタミンKVWR89405-032
Bouin'FixativeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA15990
IL-10 Rat ELISA kitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0101
IL-1beta Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0011
IL-6 Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0061
INF-γ Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USA
TNF-α ラット ELISA キットInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC3011
ラット LPS ELISA キットNeoBioLab, MA, USARL0275
環境チャンバー 6020-1Caron, Marietta, OH, USA6020-1
遠心分離機 Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USAOptima L-90K
Ultra Centrifuge
光学顕微鏡光学系CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counterFisher Scientific , Pittsburgh, PA, USARE-3325
FreezerHaier, Brooklyn, NY, USAHCMO50LA
Ultra microplateリーダーBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx 808
Auto Strip WasherBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx50
PipettesGilson, Pipetman, FranceP100, P200, P1000
C24 Incubator ShakerNew Brunswick Scientific, Enfield, CT, USAClassic C24
Rocking Shaker Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA55
ペトリ皿Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA875713100 mm x 15 mm
SterilGard III AdvanceThe Baker Company, Sanford, ME, USASG403
Culture Growing FlasksCorning Incorporated, Corning, NY, USA4995PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム。4001
Sony DXC-33 ビデオカメラSony
Richardson test slideElectron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA80303
Millipore water purification systemMilliporeDirect-Q
Image-Pro Plus softwareMedia Cybernetics, MD, USA
Triple Beam BalanceOHAUS Corporation,パーシッパニー、ニュージャージー州、米国
組織ホモジナイザー、ドンスVWR71000-518
KRC4021

参考文献

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