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この記事について
サマリー
要約
この方法は、異なる培養条件下で精製した慢性リンパ球性白血病（CLL）細胞によって産生される細胞外プリンヌクレオチド及びヌクレオシドの定量化のために開発、検証、敏感な特定の、信頼性が高く再現可能な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）アッセイを記載します。アデノシン5'-一リン酸（AMP）、アデノシン（ADO）とイノシン（INO）のクロマトグラフィー分離は、極性化合物の保持のために使用されるシリカベースの逆相カラム上でRTで行われます。方法/分1.00 mlに、流速と7mMの酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルから成る2成分移動相を含みます。溶出液を260nmで設定フォトダイオードアレイUV検出器を用いて監視されます。標準検量線は、各プリン化合物の分析的定量化のための方程式を計算するために生成されます。システム制御、データ収集および分析が次に実施されます。このプロトコルを適用すると、AMP、INOとADOは、それぞれ、7、11および11.9分で溶出し、各試料の総実行時間は20分です。このプロトコルは、マトリックスとして培地を使用して、異なる細胞型および細胞株（懸濁および接着の両方）に適用されてもよいです。利点は、簡単かつ迅速に試料調製及び分析のために上清の少量の要求です。また、無血清培地の使用は、その影響のプリン化合物の最終濃度をアセトニトリルによるタンパク質沈殿のステップをスキップできます。この方法の制限の1つは、より長い実験の合計実行時間を製造し、ハイスループットスクリーニング適用を防ぐ、各単一のサンプルのランの前に平衡化カラムをランの要件です。
概要
アデノシン（ADO）は、グリコシド結合を介してリボース糖の分子部分に結合したアデニン分子とプリンヌクレオシドです。ときに細胞外環境中に存在し、それは、免疫系の作用によって過度の損傷から細胞を保護します。この役割は、大腸炎1、糖尿病2、喘息3、敗血症4、及び虚血性損傷5のような異なる疾病モデルを使用して強調されています。メインADO機能の一つは、腫瘍免疫回避6に貢献し、腫瘍微小環境における免疫応答の阻害です。この理由のために、ADO形成およびシグナル伝達に関与するメカニズムは、かなりの治療上の関心7です。
ADO組織微小環境中のレベルは、正常な生理学的条件下では相対的に低く、確かに免疫細胞の感度閾値以下。しかし、低酸素症、虚血、炎症、感染症、代謝中ストレスや腫瘍変換が、彼 らは急速に8を高めます。オートクリンおよびパラクリン方法で、組織の損傷を報告するために、一般的に細胞保護とみなすことができる組織応答を生成する：組織摂動信号に応答して上昇した細胞外ADOレベルは二重の機能を持っています。
細胞外ADOが原因アデノシンデアミナーゼによって操作損なわ分解のヌクレオシド輸送体9または蓄積によって媒介される細胞内コンパートメント....
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プロトコル
CLL血液試料を研究所のガイドライン及びヘルシンキ宣言に従って得られます。
CLL患者の血液サンプルから白血病リンパ球の1の単離
- ヘパリンナトリウム（グリーン・トップ）チューブ17内の血液サンプルを採取します。
- RT 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で全血の3希釈：1にします。
- 密度勾配遠心分離により血液試料から末梢血単核細胞（PBMC）を精製します。
- 下敷き5密度遠心分離媒体（ 例えば、フィコール）のミリリットル15ミリリットルの遠心分離管で、慎重に希釈された血液の10ミリリットルを転送します。すぐに室温で20分間、1500×gで遠心します。
- 吸引真空ポンプに接続されたガラスパスツールピペットで上清の一部と5ミリリットルピペットで密度遠心分離培地と希釈血漿の間の相間でのPBMCリングを集めます。 （50メートルを50ミリリットルの遠心管に移し、PBSで洗浄リットル最終容量）。 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。
- 吸引したガラスパスツールピペットで上清を、PBS 50mlにペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
- ステイン抗CD19とのPBMCおよびフローサイトメトリーのための-CD5抗体は、免疫染色のための標準プロトコルに従い、PBMC亜集団組成18をチェックします。
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結果
代表的なCLL患者から新たに精製したPBMC中の白血病細胞の割合（％）を評価するために、細胞を抗CD19および抗CD5抗体でマークされています。 図3の左側のパネルには、生きた細胞に選択ゲートと細胞蛍光ドットプロットを表している。 図3は、（中央パネル）の前にCLL患者からのPBMCの一例を示し、（右パネル）B細胞の精製後。
CD73 + CLL細胞中のプリン化合物のHPLC定量化の例を図4（a）に示されています。 260 nmでのAMP、INOとADOの異なる保持時間は、化合物の同時定量を可能にします。アッセイが正しく実行された場合、すべてのヌクレオチドおよびヌクレオシドは、十分なピーク分離を持っています。基質として200μMのAMPの濃度から出発し、ADOとINOのために得られたピークは明らかにされています可視および濃度を標.......
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルは、精製されたヒト白血病細胞からの細胞培養培地中のCD39 / CD73アデノシン機械の活性を評価することを可能にします。このHPLC法を通して、私たちは以下の通りと定量的にADO（CD73依存）とINOへのその後の分解（CD26 / ADA依存）の酵素的生成を測定することができます。酵素阻害剤の使用は、プロトコルを制御するために、内部コントロールを有することを可能にします。このプロトコルの利点および新規性は、I）は、II）は、培養培地の少量を必要とするIII）試料調製が非常に容易であることは、培養物中で増殖している細胞に適用することができることです。
私たちのシステムは、オートサンプラーと一緒に四低圧混合ポンプとインライン真空脱気を装備した分離モジュールから構成されています。 AMP、ADOとINOのクロマトグラフィー分離は、極性化合物の保持のために使用されるシリカベースの逆相カラム上で達成されます。目電子バイナリ移動相システムは、緩衝液A（二重脱イオン水で7 mMの酢酸アンモニウム、塩酸で調整してpH3.0）及びバッファーB（アセトニトリル）で構成されて.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品はAssociazione ItalianaのRicerca Cancro（IG＃12754）によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ヒト血液 | |||
| ミリQ水 | ミリポア | 二重脱イオン水 | |
| フィコール・パケ・プラス | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| 精製抗CD3、-CD14、-CD16 | 製マウスモノ | クローナル | |
| PE標識 抗CD19 | ミルテニー・バイオテック | 120-014-229 | |
| FITC標識抗CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads 羊 抗マウスIgG | Invitrogen | 11031 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Amresco | E404-200TABS | 錠剤 |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | ID bio | 1000-70 | 標準グレード |
| 分離バッファー | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V 血清遊離媒体 | GIBCO | 12055-091 | 液体 (研究グレード) |
| アデノシン 5'-二リン酸 (ADP) | シグマ-アルドリッチ | A2754 | |
| アデノシン 5'-モノスフェート (AMP) | シグマ-アルドリッチ | A1752 | |
| アデノシン (ADO) | シグマ-アルドリッチ | A9251 | |
| イノシン (INO) | シグマ-アルドリッチ | I4125 | |
| &α;,β-メチレン-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73阻害剤 |
| EHNA塩酸塩 | Sigma-Aldrich | E114 | アデノシンデアミナーゼ阻害剤 |
| デオキシコホルマイシン(dCF) | Tocris | 2033 | アデノシンデアミナーゼ阻害剤 |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| ジピリダモール | Sigma-Aldrich | D9766 | ヌクレオシドトランスポーター阻害剤 |
| アセトニトリル (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC グレード |
| 酢酸アンモニウム | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| 塩酸 | Sigma-Aldrich | 30721-1L | 最小 37% |
| 名前 | 会社名/strongstrong会社名 | カタログ番号 | コメント |
| Equipment | |||
| Bürker細胞カウンター | VWR | 631-0920 | 血球計算盤 |
| DynaMag-15 マグネット | Invitrogen | 12301D | ダイナル 磁気ビーズセパレーター |
| マイクロ遠心分離機 安全ロックチューブ | エッペンドルフ | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET遠心チューブ | コーニング | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 シリンジフィルター | ザルトリウス ステディム バイオテック | 17821 | メンブレン0.2&マイクロ;メートル |
| の短い糸のバイアルVWR | 548-0029 | 1.5 ml/ガラス | |
| のマイクロ挿入物 | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/ガラス |
| スクリュー キャップ | VWR | 548-0085 | 9 mm/PPの青い |
| Atlantis dC18のコラムWaters | 186001344 | 5 µm、4.6 mm x 150 mm | |
| Atlantis dC18 ガードカラム | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 セパレーションモジュール | Waters | HPLC セパレーションモジュール | |
| Waters 2998 フォトダイオードアレイ (PDA) 検出器 | Waters | UV 検出器 | |
| Waters Empower2 ソフトウェア | Waters |
参考文献
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al.
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