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方法論記事

生存時間の測定で

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DOI:

10.3791/54126

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2016年7月22日

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1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

この記事について

サマリー

ワムシは、生態毒性学および老化研究のモデルとして使用される微細な動物プランクトンです。ここでは、Brachionusワムシの生存時間を強力かつ再現性よく測定するためのプロトコルを提供します。母性の状態は子孫の生活史に影響を与えるため、数世代にわたる培養条件の同期は特に重要です。

要約

ワムシは、生態毒性学や老化研究のモデルとして使用される微細なコスモポリタンな動物プランクトンであり、寿命が短い、培養の容易さ、単為生殖がクローン培養を可能にするなど、いくつかの利点があります。ただし、生存時間を測定する際には、母親の年齢や母親の摂食条件に影響されるため注意が必要です。ここでは、数世代にわたる培養条件の慎重な同期に続くBrachionusワムシの生存時間の強力で再現性のある測定のためのプロトコルを提供します。経験的には、同期性が悪いと、早期死亡と生存率の漸進的な低下につながり、統計的検出力が弱くなります。実際、このような状況下では、カロリー制限(CR)はB. plicatilisの寿命を大幅に延ばすことはできませんでしたが、CRによる寿命は、過去と現在の研究で十分に同期したワムシサンプルで実証されています。このプロトコルは、ミバエDrosophila melanogasterや線虫Caenorhabditis elegansなどの他の無脊椎動物モデルにも有用であり、これらの種では母体の年齢の影響も報告されています。

概要

ワムシは門ワムシ1を構成する微細な国際的な動物プランクトン（<1ミリメートル）です。彼らは、約1,000体細胞から成るシンプルなボディープランだけでなく、特徴的な車輪状の毛様体装置が移動し、給餌のために使用されているコロナと呼ばれています。ほとんどのワムシはそれぞれ2、約1600と500種を含むクラスMonogonontaまたはヒルガタワムシ綱に属します。 bdelloidワムシが義務付け単為生殖3によって再生するMonogonontワムシは、一般的に、両方の性的および無性生殖相（循環的単為生殖を）持っています。実験において高い再現性を保証する、遺伝的に同一のワムシの個体を得ることができます。さらに、それらは、短い寿命、培養の容易さ、ゲノム及びトランスクリプトーム配列データ4-7の可用性、およびから離れユニークな系統発生位置などのモデル生物のようないくつかの他の利点を有しますrthropodsと線虫8。ワムシは、したがって、生態系における無脊椎動物のモデルを有望な毒物学、および研究9-12を老化されています。

環境ストレスや化学物質への曝露下での生存時間は、これらの研究分野13-19で頻繁に測定されたパラメータです。ワムシの生存時間を測定する場合、それは母親の環境条件に敏感であるためしかし、注意が必要です。すなわち、monogonontワムシBrachionus manjavacasで、高齢者の母親からの女性の子孫は、若い母親からのものよりも短い寿命を持っています。しかし、母体のカロリー制限（CR）は、部分的に高齢出産20の有害な影響を相殺します。 B.でplicatilis、母体のCRは、子孫の長寿、飢餓の下で長い生存期間、および抗酸化酵素21,22の発現増強に伴う高い酸化ストレス耐性を提供します。母体の年齢効果またbdelloidワムシ23で観察されています。したがって、実験ワムシの条件は慎重に生存時間の測定の前に数世代にわたって同期する必要があります。

ここでは、数世代にわたって培養条件の同期以下のBrachionusのワムシでの生存時間を測定するためのプロトコルを提供します。間欠絶食（IF）、ワムシは、定期的に供給されるCRの変化は、原因寿命22,24にIFのよく知られた効果のために、同期の影響を明らかにするために適用しました。

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プロトコル

メディアの調製

注意：使用して、塩分16.5 PPT（PSU）の半希釈Brujewicz人工海水を。他の人工海水にも頻繁に文化Brachionusのワムシ25,26に使用されています。

  1. 454のNaCl、26のMgCl 2、27mMのMgSO 4を、10のKCl、および10mMのCaCl 2（最終容量は5 Lになります）の蒸留水4.5 Lに追加します。また、脱イオン希釈水の代わりに蒸留水を使用しています。すべての他の塩を溶解させた後のCaCl 2を追加します。
  2. 0.48 MのNaHCO 3ストック溶液（200倍濃度）を準備します。上記の溶液に25mlのを追加します。 NaHCO 3を最終濃度が2.4 mmです。
  3. 0.4 MのNaBr原液（500X濃度）を準備します。上記の溶液に10mlのを追加します。 NaBrの最終濃度は0.8 mmです。蒸留水で5 Lにメイクアップ。
  4. 0.45μmのメンブレンフィルターで溶液をフィルタリングします。（v / v）を使用前に滅菌水で2回希釈します。
    注：原液としてBrujewicz人工海水の2倍の濃度とすることができます。

2.一般的な培養条件

  1. 培養実験室で上昇または20と30℃の間の滅菌100ミリリットルのビーカー内の野生捕獲さワムシ。温度が高いほど短い寿命と加速再生につながります。実験の便宜のために25°Cを使用してください。ワムシ密度または人工海水の量は、ここで大きな問題ではありません。
  2. 人工海水11中の文化食物微細藻類種。詳細は11のためにスネルら。（2014）を参照してください。一般的に、Tetraselmisのtetrathele（〜2×10 5細胞/ mlの27,28）、Tを使用ダイエット藻類（種、培養コンディットので、suecica（〜6×10 5細胞/ mlの25,29）、およびNannochloropsisのoculata（〜7×10 6細胞/ mlの30,31）。イオン、生化学的組成物）は大幅にすべての実験群では、微細藻類の同一ロットを使用し、Brachionusのワムシの生存期間に影響を与えます。
  3. 供給し、（ 例えば 、2日毎に供給し、毎週接種）時折メディアを変更することにより、バッチ培養におけるワムシの株式集団をキープ。ワムシは、最適な条件である場合、多くの新生児2-3卵を有する成人を観察することができます。
    注意：実験的なワムシを取得する別の方法は、安静時の卵を孵化することです。休んで卵から孵化しワムシはよく同期させることが考えられ、その寿 ​​命は倍数性単為生殖の卵11から孵化ワムシのそれとは大きく異なっていないされています。しかし、安静時の卵からのワムシは倍数性単為生殖の卵からのものよりも早く再生を開始します。このように、注意が彼らの繁殖形質の測定のために必要とされます。

前培養によるワムシの3同期

  1. 目から単一のワムシを選択実験に使用される亜集団を確立するために、2.1〜2.3で説明したように、人口培養OCK。典型的には、2週間の培養。
  2. （実験に使用される個人の二重数を収集する）サブ集団から卵ベアリングワムシを集めます。単一のコホートとしての文化、それらを（密度：〜50人/ ml）を不断給餌下で新鮮な培地に2.1から2.3に記載されているように6ウェル培養プレートインチ馴化培地はBrachionusのワムシ32,33の生殖生理学に影響を与えるため、人口密度を制御することが重要です。
  3. 新たに用意した培養培地に大人の最初の卵から孵化した新生児を転送します。 2-3世代を超えて、この手順を繰り返します。
  4. 生存時間を測定するための一定期間（ 例えば 、<3 ​​時間）以内に孵化した新生児を使用してください。単一の個人の選択の可能性バイアスを避けるために、非常にありそうにないものの、いくつかのINDEを使用して再現性を確認しますペンダントのサブ集団。
    注：ワムシは、通常、この条件の下でのみ無性再現するように、何人の男性が、実験を通して存在しないことを確認します。男性は新生児よりも小さく、一般的に速い女性より移動します。 Mictic女性が一定の条件の29の下で倍数性単為生殖の雌は異なる寿命を持っています。

生存期間の4測定

  1. プラスチックプレートに入れ新生児（人工海水の各ウェルを含む1ミリリットルで、通常、24または48ウェルプレート、）。
  2. 24時間の間隔で、より高い温度（上記30℃以上）であれば、新たに調製した培養培地に、または12時間の間隔でワムシを転送します。子孫の数を記録し、各個人が死んでいるか生きているかどうか。コロナの繊毛の動きが完全に停止したときに死んだとしてワムシを記録します。
    注：ワムシは、多くの場合、ウェルの側壁に付着します。水の穏やかなピペッティングは、それらを見つけるのに役立ちます。ワムシが見つかり又はArされていない場合電子誤ってピペット操作によって損傷を受け、ない「死んだ」として、「検閲」としてそれらを記録。
  3. 実験ワムシが積極的に再現しているときに新生児を削除します。新生児は急速に成長し、実験ワムシと区別することが困難な場合があります。

5.データ解析

  1. X軸上のY軸と時間の累積生存率をプロットしたカプラン・マイヤー生存曲線（ 図1及び2）を作成します 。これは、生存データの最も一般的な表現です。生存期間34の統計的比較のために（もマンテル-コックスのテストと呼ばれる）ノンパラメトリックログランク検定を使用してください。ログランク検定はまた、JMPおよびR.などの他の標準的な統計パッケージに含まれています
    注意：正規分布は、通常、生存データ35によって満たされていないため、スチューデントのt検定またはパラメトリック多重比較に続いて分散分析（ANOVA）を使用しないでください。また、これらのメトDSのアカウントに検閲個人を取ることはありません。何打ち切りデータが存在しない場合はマンホイットニーU検定を使用することができます。

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結果


図1は不十分同期集団（2つの複製のうち）の代表的な生存曲線を示しています。この実験では、ワムシは、供給された日常の[ 自由摂取 （AL）グループ]または隔日（グループIF）のいずれかでした。生存期間中央値はそれぞれ、ALおよびIFグループで13と18日でした。よくIFは、ワムシの寿命を延長することが知られているが、この実験では、ALとIFグループの寿命の間に統計的に有意な差を検出することができませんでした。経験的には、早期の死亡率および生存率の緩やかな下落が不十分で、同期の結果は、この実験で観察しました。サブ集団についての不適切な処理または低水質に起因するワムシへの損傷は、同様の結果が得られる傾向にあります。

ワムシの条件が最適とも同期されている場合には、早期の死亡率はほとんど見られず、accordinされますGlyをワムシは、実験の後の段階（ 図2）中...

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ディスカッション

現在のプロトコルはBrachionusのワムシの生存時間を測定するための方法が記載されています。重要なステップは、数世代にわたるワムシ条件の同期です。実験ワムシはよく同期化されるとき、典型的なタイプIの生存曲線は、いくつかの以前の研究18,24,37,38で報告されたように、非常に小さな初期の死亡率が観察されます。彼らの生存時間の標準偏差が高いため、統計的パワーで、その結果、不十分同期ワムシに比べて小さくなります。同期化はまた、生存時間の測定の再現性を高めることが期待される - 母親は最適な条件下で培養されているため、現在のプロトコルは、母体の世代の可能性有害な影響を相殺します。早期の死亡率は依然として慎重な同期の後に観察されている場合は、新たに用意した培地を使用することを検討して、 すなわち供給藻類、または新たに確立された実験コホートの他の多く（、）プロトコル3.1から開始します。

このプロトコルの制限がよく同期ワムシが潜在的に過剰に敏感であるということです。例えば、寿命を延長する化学物質のスクリーニング時に、このプロトコ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、撮影中の彼らの助けのために、ジョージ・ジャービス、マーサボック、およびベティヒーコックス-リー、海洋生物学研究所に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
塩化ナトリウム和光190-13921
塩化マグネシウム和光136-03995
硫酸マグネシウム和光131-00427
塩化カリウム和光168-22111
塩化カルシウム和光035-00455
重炭酸ナトリウム和光199-05985
臭化ナトリウム和光190-01515
メンブレンフィルター (0.45 & micro;ミリポアHAWP04700
プレート、6ウェル、未処理トーマス・サイエンティフィック6902D01平底
培養プレート、48ウェル、未処理トーマス・サイエンティフィック6902D07平底
テトラセルミス、リビング・カロライナ・バイオロジカル・サプライ・カンパニー152610
PRISM 6GraphPad ソフトウェア・バージョン6.0d
培養

参考文献

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