ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

サマリー

ポリエチレングリコール(PEG)とアビジンコーティングされたガラス表面につながれ、マイクロ流体のせん断流で引き伸ばされた蛍光タンパク質DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された大きなDNA分子を視覚化するアプローチを提示します。

要約

大きなDNA分子は、特にDNAとその結合タンパク質との間の相互作用を調査するために、高分子物理学や生化学で利用されてきました。ここでは、表面につながれた大きなDNA分子を蛍光顕微鏡で可視化する方法について報告します。まず、ガラスカバースリップは、ビオチン化ポリエチレングリコールでコーティングすることによりビオチン化および不動態化され、アビジンタンパク質リンカーを介してビオチン化DNAに特異的に結合し、表面上のタンパク質またはDNA分子の非特異的相互作用による望ましくない結合を大幅に減少させます。次に、DNA分子は、その末端に応じて2つの異なる方法でビオチン化されます。平滑末端DNAは、末端トランスフェラーゼによって3'水酸基末端にビオチン化dUTPでタグ付けされ、粘着末端DNAはDNAリガーゼによってビオチン化相補型オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされます。最後に、マイクロ流体せん断流は、蛍光タンパク質-DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された後、単一のDNA分子をその輪郭全体の長さまで伸張させます。

概要

ガラスまたはビーズ表面に係留大きなDNA分子の可視化DNA基質^、1,2および高分子物理学上のDNAタンパク質相互作用、タンパク質の動力学を調査するために利用されてきた^。3,4-単一係留大型DNA分子のためのプラットフォームは、いくつかの異なるを有します他のDNA固定化方法に比べて利点が⁵まず、表面につなが大きいDNA分子は、その結合部位を認識するDNA結合タンパク質のための非常に重要であるせん断流れずに自然なランダムコイルコンフォメーションを有します。第二に、フローチャンバー内の一連の酵素反応のためのDNA分子の周りの化学的環境を変更することは非常に簡単です。第三に、マイクロ流体せん断流がDNA分子、このような表面固定化⁶及びナノチャネルの狭窄などの代替的なDNA伸長手法を用いて達成することは非常に困難である完全な輪郭の長さの100％にまで延伸を誘発する^。7 A完全stretcheDのDNA分子は、ゲノムマップ上の酵素の動きを監視するために有用であることができる位置情報を提供します。

それにもかかわらず、DNAテザリングアプローチは、YOYO-1のような挿入色素は、一般的に容易に蛍光励起光によって破壊される係留DNA分子を引き起こすという重大な欠点を有しています。一般的に、大規模なDNA分子は蛍光顕微鏡下で可視化のための蛍光色素で染色されなければなりません。これらの色素は、それらが二本鎖DNAにインターカレートしたときにのみ蛍光を発するので、この目的のために、YOYO-1または他のTOTO系色素が主に使用されている^。8しかし、ビス-インターカレート色素があるため、光誘導されるDNA光切断を引き起こすことがよく知られています蛍光体のインターカレーション^。9更に、表面につなが蛍光染色されたDNA分子は、剪断流れが自由にDNA分子の移動の力を壊す発揮することができるため、より脆弱です。したがって、我々は新たなDとFP-DBPを開発しました表面に係留大型DNA分子を画像化するためのNA-染色タンパク質色素。 FP-DBPを使用する利点は、それが結合するDNA分子の光開裂を起こさないことである。加えて^、10のビス-インターカレート色素は輪郭長さを増加しながら、FP-DBPは、DNAの輪郭の長さを増加させません約33％です。

このビデオ方式は、PEG-ビオチン表面に大きなDNA分子を係留するための実験的アプローチを紹介する。 図1は、平滑末端および付着末端を有するDNAを係留の異なるアプローチを示しています。したがって、この染色方法は、DNA分子の任意のタイプに適用することができる。 図2は、DNA分子を伸長するだけでなく、化学的および酵素をロードするためにせん断流を生成するために、シリンジポンプによって制御することができるフローチャンバアセンブリの概略図を示していますソリューション。 図3は、PEGylatにつなが完全に伸張したDNA分子の顕微鏡写真を示していますエド面¹¹とFP-DBPで染色しました。

プロトコル

1. DNAビオチン化

1. ターミナルトランスフェラーゼを使用して平滑末端DNAのビオチン化酵素（TdT）
   注：平滑末端DNAで使用T4 DNA（166 kbpの）を、。
   1. 2.5mmののCoCl _2、10×反応緩衝液5μl、10mMのビオチン-11-dUTPを0.5μlの、ターミナルトランスフェラーゼの0.5μlの（10単位）、およびT4 DNA0.5μlの（0.5μgの/μl）を5μLを追加反応混合物。水38.5μLを添加することによって50μlの最終容積にしてください。
   2. 1時間37℃で反応混合物をインキュベートします。
      注：延長反応時間、 すなわち 、二重係留DNAを得ることができ、ビオチンが両端にタグ付けされていることが可能です。
   3. 0.5 M EDTA、pHが8の5μLを加えて反応を停止します。
   4. 4℃でチューブを保管してください。
2. DNAリガーゼを用いて粘着性のエンドDNAのビオチン化
   注意：使用λDNA（48.5 kbpの）、粘着末端のDNAです。 <オール>
3. T4 DNAリガーゼを1μl、10×ライゲーションバッファー5μlの、25 ngの/μlのλファージDNAを1μlを追加し、50μlの最終容量を作るために水の43μlを添加します。
4. 4℃でチューブを保管してください。

2.官能の表面誘導体化

注： 図1に示すように、ガラス表面上のDNA分子の末端をつなぐためには、第1級アミン基をビオチンPEGコーティングに続いてカバースリップ上にシラン化され、このPEG化プロセスがあるため、単一分子DNAの画像化のために重要です。著しく表面上の望ましくない分子の結合によって作成されたランダムノイズを低減することができます。

1. ピラニアクリーニング
   注：ピラニア・ソリューションは、したがって、それは適切な安全ガイドラインに従って、取り扱いに注意する必要があり、有機物質と激しく反応します。
   1. 場所は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）ラックにカバースリップ、およびbはそれらを保持しますyのPTFE長手方向シールテープ、ラックの表面のエッジと半分に半分。ラッピングした後、洗浄手順の間にラックを処理するためのテープの長い一片（〜5センチ）のままにします。
   2. SO H ₂ O ₂の₄および150mlをヒュームフード内でピラニア溶液を作製するためにH ₂ 350 mlを1 Lのガラスビーカーを埋めます。 2時間ピラニア溶液中でラックを配置します。
   3. ビーカー内の水のpHになるまで脱イオン水で完全に空のビーカーからのピラニア溶液およびリンスカバースリップを中性に達します。 pH試験紙ストリップを使用してください。
   4. 30分間、水を含有するビーカーにカバースリップのラックを超音波処理。ビーカーからわずかアミノシラン化の前に空の水。ガラス基板をきれいにし、誘導体化するために超音波処理電力の75 Wを使用してください。
2. ガラス表面にAminosilanization
   1. N 2 mlを加え- [3-（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミン及び200mlまで氷酢酸10mlaminosilanization溶液を調製するための清浄なポリプロピレン容器中でメチルアルコール。
   2. ポリプロピレン容器中で洗浄カバースリップを置きます。 30分間100rpmで、室温でそれらを振ります。
   3. W.は、少なくとも30分間、100rpmで、室温でそれらを振る75で15分間、誘導体化されたカバースリップを入れたビーカーを超音波処理します。
   4. エチルアルコールで二回ビーカーからの溶液を空にし、メチルアルコールで一回、慎重にカバースリップをすすぎ、と。ストアエチルアルコール中のカバースリップとは、2週間以内にそれらを使用しています。
3. カバーガラスのPEG化
   1. 0.1 M炭酸水素ナトリウム（NaHCO _3）の10ミリリットルを加えます。 0.22μmのシリンジフィルターで溶液をフィルタリングします。
   2. ビオチンPEGスクシンイミジルカーボネート（ビオチン-PEG-SC）およびNaHCO ₃の350μlの中のPEGスクシンイミジル吉草酸80mgの（MPEG-SVG）の2ミリグラムを溶かします。光保護管を使用してください。
   3. 1激しくチューブをボルテックス0秒、および気泡を除去するために1分間10,000×gで、それを遠心します。
   4. エチルアルコールですすぎ、続いてアセトンでスライドガラスを、洗浄します。完全に空気乾燥にスライドを許可します。
   5. きれいなガラススライド上のPEG溶液の滴（50μl）を配置します。任意の気泡を発生させることなく、アミノシラン化カバースリップで軽く滴をカバーしています。
   6. 3時間のための場所のスライドは一晩暗所で、室温で湿潤チャンバーを十分に平らにします。底に水で、チャンバとして空のピペットチップホルダーを使用します。チューブ内の残留PEG溶液を密封し、4℃で保管してください。
   7. 脱イオン水で十分にペグ化されたカバースリップを洗い流します。使用するまで暗く乾燥した場所に保管してください。

3.フローチャンバーの組み立て

1. 図2のように、パンチアクリルホルダーを製作。チューブインサートの直径は0.762ミリメートルであることを確認し、一つの孔を指定すると、入口であり、他方はであり、アウトレット（ 図2）。
2. 任意のチャンネル穴を摂動ない、入口と出口の穴に垂直に整列させ、アクリルホルダー（ 図2）に両面粘着テープ片（幅5〜6ミリメートル）を配置します。チャンバーを作るために、マルチチャネル壁としてこれらのテープストリップを使用してください。ピペットチップを使用してテープをスクラブ。
3. フェイスダウンPEG化側で、フローチャンバーを作るために上にPEG化されたカバースリップを置きます。
4. 漏れる任意の溶液を防ぐために、両面テープが配置されている領域の上にカバーガラスの上部を押します。上部にある、ボトム（ 図2の黄色）でチャンバのエッジを閉じるには速乾エポキシ接着剤を追加します。
5. ガスタイトシリンジにチューブ（外径、OD、0.042 "）の短い断片（2.5センチ）を接続し、エポキシ接着剤で接合部をシールします。
6. 注射器にリンクされているチューブに、エポキシ接着剤で接合部をシールする：長いフレキシブルチューブ（0.03 "OD）を接続します。
7. TUBI塗りつぶしngのDI水で注射器にリンクされています。空気の泡がないことを確認してください。
8. エポキシ接着剤で封止しフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。
9. 貯水池などの他の穴に黄色の先端部（200μlの先端）を配置します。

フローチャンバー内に4.サンプルのロード

注：ニュートラアビジンは、ストレプトアビジンのような他のアビジンのタンパク質で置き換えることができます。それは言及されない限り、全ての反応は、室温で行うことができます。黄色の先端に試料液を取り、アクリルホルダーの穴（ 図2b）上に溶液で先端をインストールします。

1. 50μl/分でシリンジポンプの流量を設定します。負荷アビジンタンパク質の20μlの（T50溶液中の25μgの/ mlで、10mMトリス、50mMのNaClを、pHを8）は、10分間それを維持します。
2. 負荷ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド（1×TE中100μM）を20μl、10分間それを維持します。ターミナルトランスフェラーゼを使用する場合は、ロードをスキップオリゴデオキシヌクレオチドの。
3. 10μl/分の流速でフローチャンバーへのステップ1からの負荷のDNA溶液20μlを、30分間それを維持します。
4. 1×TEとフローチャンバーを洗浄し、FP-DBP ^10（〜80 nM）を40μlのをロードします。
5. 60X対物レンズに1×TEで染色する分子の連続的な流れと蛍光顕微鏡下でDNAを観察します。 FP（EGFP）-dbpの励起に488nmの固体レーザーを使用してください。 DNA分子の完全なストレッチのために、使用されるDNAの長さに応じて異なる流量を適用します。例えば、T4 DNAの166 kbpのためのλDNAの48.5 kbpの、そして100μl/分を50μl/分を適用します。
   1. アクリルホルダーのリサイクルのため、家庭用洗剤溶液¹²で組み立てフローチャンバーを浸します。かみそりの刃でテープとエポキシを削除し、それらを完全にオフに取るために手でこすります。注射針で穴を邪魔を除きます。さらに使用するまで脱イオン水にホルダーを保管してください。

結果

図1は、DNA分子の末端構造に応じて2つの異なるDNAテザリング方法を示している。 図1aは、スティッキーエンドのDNA分子は、アビジン被覆PEG表面上に固定化された補完的なビオチン化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている様子を示す。 図1bは、の追加を示していますビオチン化のddNTPまたはターミナルトランスフェラーゼによって平滑末端DNAの3 '水酸基へのdNTP。我々は、DNA分子とビオチン間の柔軟なリンカーを追加しました。これは、反応に十分なスペースを提供するために、連結およびアビジン-ビオチン結合効率を増加させた。 図1cはアビジンコートPEG表面上のDNAテザリングのための全体的な概略図を示しています。

図2は、アクリルホルダーと一緒にフローチャンバのアセンブリを...

ディスカッション

ここでは、表面上に固定するためにビオチン化長いDNA分子を可視化するためのプラットフォームを提示します。私たちは、ビオチン化ウシ血清アルブミンとアビジンタンパク質コーティングされた表面上の係留DNA分子のためのアプローチを報告している^。6以前のアプローチでは、我々は上の係留DNA分子を染色ビス-インターカレーション染料によって引き起こされるDNAの光開裂の重要な問題を発見しました表面。これらの連続的励起フルオロフォアは、DNAリン酸骨格を攻撃する高い確率を有するように^、9励起光のパワーは、光開裂を避けるために最小化されなければなりませんでした。

この不便さを克服するために、我々は、光開裂することなく、DNAを染色するためのDNA結合能（FP-DBP）で遺伝子操作された蛍光タンパク質を開発しました^。10我々は、アビジン被覆タンパク質表面上の信頼性のDNA染色を観察しました。それにもかかわらず、このプラットフォームは、上の蛍光タンパク質の望ましくない凝集の別の問題がありました増加したバックグラウンドノイズを生じる​​タン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.DNA Biotinylation
1.1) Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	10x 反応バッファー、2.5 mM 塩化コバルト
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP も利用可能
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
エチレンジアミン四酢酸	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) DNAリガーゼT4 DNAリガーゼを使用した粘着末端DNAのビオチン化
	ニューイングランドバイオラボ	M0202S	10x反応バッファーラム
ダファージDNA	バイオニア	D-2510	入手可能 ニューイングランドバイオラボ
<強い>2。機能化された表面誘導体化
2.1) Piranha Cleaning
>Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, No. 1
厚さ テフロンラック			カスタムファブリケーション
PTFE スレッドシールテープ	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	テフロン&テープ
硫酸	ジンケミカル株式会社	S280823	H2SO4、純度95%
過酸化水素	ジンケミカル株式会社	H290423	H2O2、水中35%
処理装置	大韓科学(株)	WUC-A02H	卓上超音波洗浄
2.2) ガラス表面のアミノシラン化
N-[3-(トリメトキシシリル)プロピル] エチレンジアミン	Sigma-Aldrich	104884
氷酢酸	Duksan Chemicals	414	99% 純度
メチルアルコール	Jin Chemical Co., Ltd.	M300318	99.9%純度
ポリプロピレン容器	Qorpak	PLC-04907
エチルアルコール	ジンケミカル株式会社	A300202	99.9% 純度
2.3) カバーガラスのPEG化
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5761
シリンジ フィルター	ザルトリウス	16534----------K
ビオチン-PEG-SC	レイサン バイオ	ビオチン-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	レイサン バイオ	MPEG-SVA-5000
アセトンジン	ケミカル(株)	A300129	純度99%
顕微鏡スライド	マリエンフェルト・スペリオル	1000612	~76 mm x 26 mm x 1 mm
3.フローチャンバーの組み立て
>アクリルサポート			カスタム加工
両面テープ	3M		透明タイプ
速乾性エポキシ	3M
ポリエチレンチューブ	コールパーマー	06417-11, 06417-21
ガスタイト 250 & マイクロ;lシリンジ	ハミルトン	81165
シリンジポンプ	新時代ポンプシステム株式会社	NE-1000
4.フローチャンバーへのサンプルローディング
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Trisベース	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizmaベース
顕微鏡	Olympus	IX70
EMCCDカメラ	Q Imaging	Rolera EM-C2
固体レーザー (488 nm)	Oxxius	LBX488
アルコノックス	アルコノックス