親水性コーティングのためのグリアジンシアノアクリレートナノ粒子の製造のためのプロトコル

サマリー

この記事では、疎水性の表面を親水性に変えるタンパク質ベースのナノ粒子の製造に関するプロトコルを紹介します。生成されたナノ粒子は、グリアジン-シアノアクリレートジブロック共重合体の集合体です。生成したナノ粒子をスプレーコーティングすると、ターゲット材料の表面が親水性に変化します。

要約

この記事では、単純なスプレーコーティングによって親水性に疎水性表面を変化させるタンパク質ベースのナノ粒子の製造のためのプロトコルを提示します。これらのナノ粒子は、穀物タンパク質（グリアジン）分子の表面上のアルキルシアノアクリレートの重合反応によって製造されます。アルキルシアノアクリレートは、それが材料の表面に適用した場合、即座に、室温で重合する単量体です。その重合反応は、水分を含む表面上に、弱塩基性または求核性種の微量によって開始されます。重合後ニトリル基は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）のバックボーンにあるため、重合アルキルシアノアクリレートは、対象物質と強い親和性を示します。彼らはシアノアクリレートの重合を開始することができるアミン基を含有するためのタンパク質はまた、この重合のための開始剤として働きます。凝集タンパク質を開始剤として使用される場合、タンパク質凝集体は、疎水性で囲まれていますアルキルシアノアクリレートの重合反応後のポリ（アルキルシアノアクリレート）鎖。実験条件を制御することにより、ナノメートル範囲の粒子が生成されます。製造されたナノ粒子は、容易にガラス、金属、プラスチック、木材、皮革、及び織物を含むほとんどの物質の表面に吸着します。材料の表面を製造ナノ粒子​​懸濁液を噴霧し、水でリンスされた場合、ナノ粒子のミセル構造は、コンフォメーションが変化し、親水性タンパク質は、空気にさらされています。その結果、ナノ粒子コーティングされた表面は、親水性に変化します。

概要

この記事の目的は、単純なスプレーによって材料の濡れ特性を変更するナノ粒子懸濁液の調製のためのプロトコルを示すことです。提示されたナノ粒子懸濁液は、アルキルシアノアクリレート¹と穀物タンパク質であるグリアジン^2,3から作られています。製造工程では、タンパク質凝集体がエタノール水^溶液中に形成されます4。その後、モノマー(アルキルシアノアクリレート)と反応すると、線状ポリマー鎖[poly(alkyl cyanoacrylate)]⁵に囲まれたタンパク質コアからなるナノ粒子が生成されます。

ポリ(アルキルシアノアクリレート)は生分解性であり、乳化^重合6によるナノ粒子の製造に使用されています。この反応は、反応媒体⁷中の水から解離した水酸基または他の求核基によって自発的に開始される。本稿で紹介した反応の場合、タンパク質凝集体表面のアミン基がアルキルシアノアクリレートモノ^マー5,8の重合反応を開始する。この反応の結果として、反応媒体中にナノ粒子が形成されます。ナノ粒子のコアはタンパク質凝集体であり、外層はポリ(アルキルシアノアクリレート)(PACA)鎖です。調製されたナノ粒子は、ほとんどの材料(より正確には、PACAが吸着できる任意の材料)に強い親和性を持ち、それらの表面に付着してナノメートルスケールの薄いコーティングを形成します。簡単なスプレーコーティングは、材料の表面を瞬時に親水性に変えます。

グリアジンは、小麦の胚乳に含まれるグルテンの主要な画分の一つです。グリアジンは、主に分子量が約28,000〜55,000の単量体タンパク質です。水素結合、イオン結合、疎水性結合などの非共有結合は、グリアジンの凝集に関与しています²。この記事ではグリアジンを反応物として選択していますが、他の多くのタンパク質も同じ目的で使用できます。しかし、凝集を誘導する条件は、使用するタンパク質の種類に依存するため、反応条件を適宜修正^{する必要がある8。}他のタンパク質と比較して、グリアジンはより容易に利用可能であり、精製は簡単で、製造コストは低いです。提示された反応のモノマーとしてシアノアクリレートエチル(ECA)が選択されますが、同じ反応には他のアルキルシアノアクリレートも使用できます。ECAを選んだ理由は、低コストで手軽に利用できるからです。

プロトコル

1.脱脂商業グリアジン

1. メスシリンダーをアセトン150ml中に測定250mlの三角フラスコに注ぎます。
   1. 室温でマグネチックスターラー上でスピン棒で攪拌しながら、商業グリアジン粉末30gを追加します。アルミ箔でフラスコの開口部を密閉し、フード内でO / N撹拌し続けます。
2. 濾紙で溶液をろ液。
   1. 新鮮なアセトン（約50ml）でろ液を洗います。アセトンを排出させるために10分間放置してみましょう。
   2. このような細胞培養正方形の皿のような大きな皿に下をろ紙とともにろ液を転送します。残留アセトンの蒸発を遅くするために、大きなろ紙で全体の皿をカバーしています。
   3. ろ液は、ボンネットO / Nで完全に乾燥することができます。室温で気密容器内の脱脂グリアジンを保管してください。

精製されたグリアジンの調製

1. WAの150ミリリットルを測定しますメスシリンダーとターと千ミリリットルの三角フラスコに注ぎます。
   1. 混乱のシリンダーを無水エタノール350ミリリットルを測定し、同じ千ミリリットルの三角フラスコに注ぎます。全く気泡が溶液混合物から生成されなくなるまでスピン棒を - （1,000回転800）を激しく撹拌します。
2. 撹拌しながら、脱脂商用グリアジン粉末20グラムを追加します。途中で空気を含ま塊の形成を避けるために、一度に少量でグリアジンを追加します。 O / N撹拌し続けます。
3. 千ミリリットルのメスシリンダーにソリューション全体を転送します。 2日間放置してみましょう。この時間の間に、不純物がシリンダの底部に析出されます。
4. ピペットでロータリーエバポレーターに上清を移して、できるだけ多くの上清からエタノールを除去。エタノールの割合が減少すると、グリアジンは、集合体として溶液中で表示されます。
5. メタノールに回転/浸漬することによりグリアジン凝集体を含む溶液を凍結/ドライアイス混合物、凍結乾燥し、真空下で-70℃で。凍結乾燥の前に、溶液全体が任意の液体ずに凍結されていることを確認します。
   注：凍結乾燥したグリアジンは、多孔性固体を形成します。
6. 乳鉢と乳棒で凍結乾燥したグリアジンを粉砕し、微粉末（<0.5 mm）を得るためにコーヒーグラインダーで挽きます。室温で気密容器と店に製品を転送します。

グリアジンとECAの3重合反応

1. 計量バランス、風袋中のシンチレーションバイアルを（体積は約20ミリリットルである）を配置します。 scitillationバイアルに3.2グラムの蒸留水および6.8グラムの無水エタノールを追加します。
2. バイアルに磁気スピン棒（20×3 mm）を入れ、マグネチックスターラー上にシンチレーションバイアルを移動し、激しく撹拌 - 空気の泡が水性エタノール混合物から生成されなくなるまで（800千rpm）を。
3. 攪拌しながら、バイアルに4 N HClを40μlを添加します。 STIながらバイアルにグリアジン20mgを追加します。 RRING、およびグリアジン粉末を完全に水性エタノールの混合物に溶解するまで攪拌し続けます。
4. 1,000回転 - 攪拌速度はまだ800である間ECA100μlの - を確認した後グリアジン液が肉眼には明らかである、ゆっくりと80を追加します。
   1. 500rpmに攪拌速度を下げ、そして1時間撹拌し続けます。反応が進行するにつれて、重合反応が進行中であることを示している濁度を観察します。
5. 反応が終了すると、遠心チューブに溶液を移し、チューブの重量のバランスをとります。 20分間10,000×gでの反応生成物を遠心。この間、副生成物の沈殿物及びナノ粒子はsupernantantに残ります。副生成物の主成分は、PACAホモポリマーです。
6. 遠心分離後、シンチレーションバイアル（または任意の気密容器）にピペットを用いて製造したナノ粒子懸濁液（上清）を転送し、室温で保管してください。

商品のタイトル "> 4。キャラクタリゼーション

1. 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに3.2グラムの水および6.8グラムの無水エタノールを混合することにより、68重量％エタノール水溶液の10グラムを準備し、全く気泡が溶液混合物から生成されなくなるまで撹拌します。
   1. 攪拌しながら混合液に4 N HClを40μlを添加します。攪拌しながら調製したエタノール溶液にナノ粒子懸濁液の50μlのを追加します。
2. 上記で調製した試料溶液を用いて、動的光散乱（DLS）を持つナノ粒子のサイズを測定し、製造元の指示に従ってください。
   注：最終製品のサイズを200nmよりも小さくなければなりません。それが200nmよりも大きい場合、生成物は、長期間安定ではないだろう。就業ECAが新鮮でない場合は、大きなナノ粒子が生成されます。

製品の5.審査

1. このような手鏡としてガラス板を準備します。石鹸水でガラス板の表面を洗浄します。 R流水でガラス板の表面inse。清浄化された表面を乾燥させたり、次の工程で乾燥させずに使用します。
2. ガラス板の一部に）3.6で得られたナノ粒子懸濁液をスプレーし、す​​ぐに流水で表面を洗い流してください。
3. ガラス板の表面に、純水をスプレー。コー​​ティングされていない面がクリアされている間（ナノ粒子懸濁液を噴霧）塗面ホールド水層を観察します。

結果

ナノ粒子は、種々の反応条件下で調製する​​ことができます。グリアジン形態は、エタノール含有量⁵の広い範囲に集約します。しかし、凝集体の大きさは、付加的な層（ すなわち 、重合ECA）は、この集合に追加されるため、できるだけ小さくする必要があり、このプロセスは、最終的なサイズが大きくなります。粒子の最終サイズが大きすぎると、粒子が不安定になり、容易に沈殿されます。したがって、68％エタノール水溶液を反応媒体⁴として選択しました。生成ナノ粒子のサイズは、数百ナノメートルのオーダーです。以下のように製造したナノ粒子を有する親水性コーティングのための作業機構です。

材料のコーティングのために、（68％エタノール中に懸濁）このナノ粒子懸濁液を水で洗い流し、続いてターゲット材料の表面上に噴霧されます。ときナンは、水性エタノール中に懸濁oparticlesがターゲット材の表面に噴霧されるエタノ...

ディスカッション

ナノ粒子懸濁液の製造には、いくつかの重要なステップがあります。精製されたグリアジンに不純物が含まれている場合、ECAとの反応により副生成物が生成されます。これらの不要な生成物は遠心分離段階で反応媒体から除去できますが、主要生成物の収率が低下します。実験ステップ2.3)で調製したグリアジン溶液が2日後に上清と沈殿物の間に明確な分離を示さない場合、溶液はより長い時間放置する必要があります。ECAの保存期間は限られているため、新鮮なECAを使用することが最も重要です。

古いECAで部分的に重合したECAは、懸濁液中で安定しないより大きなサイズのナノ粒子を生成します。各反応物の濃度は変更できます。ただし、最終製品のサイズと安定性は変更によって影響を受けます。したがって、生成されたナノ粒子が凝集体を形成するかどうかを確認する必要があります。集合体のサイズは数マイクロメートルの範囲にあるため、この目的には光学顕微鏡を使用できます。生成されたナノ粒子は、120°Cを超えると分解し始めます。コーティングされた表面の温度が120°C以上に上昇した場合は、再度コーティングする必要があります。コーティ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エチルシアノアクリレート(ECA)モノマーK	&R International (Laguna Niguel, CA)	I-1605	純粋なECAであれば何でも使用できます。
Gliadin	MGP Ingredients, Inc (カンザス州アッチソン)	社からのギフト	は、Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G) から購入できます。グリアジンの代わりに、任意のコマーシャル グルテンを使用できます。
HCl	Any		Any試薬グレードの薬品を使用できます。
アセトン	任意		試薬グレードの薬品を使用することができます。
メタノール	Any		試薬グレードの薬品を使用することができます。
エタノール(100%)	任意		試薬グレードの薬品であれば何でも使用できます。
濾紙	Any		10cm以上のグレードの濾紙はどれでも使用できます。
細胞培養スクエアディッシュ	Any		20×20cm以上のディッシュであれば何でも使用できます。
コーヒーグラインダー	Any		Coffee Grinder Any Coffeeグラインダーが使用できます。
ロータリーエバポレーター	Any		ロータリーエバポレーターが使用できます。
凍結乾燥機	Any		70 °に達することができる任意の凍結乾燥機。Cを使用できます。
任意の		遠心分離	1,000×gを塗布できる任意の遠心分離機が使用できます。
マグネチックスターラー	任意		スピンバーを1,000rpmまで回転させることができるマグネチックスターラーなら何でも使用できます。
ダイナミックライトスキャタリング(DLS)	Brookhaven Instruments Corporation	NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer	DLSは、どの会社からでも使用できます。
走査型電子顕微鏡(SEM)	カールツァイス社		任意のSEMを使用できます。
ダイナミックコンタクトアングル(DCA)	サーモカーン機器		任意のDCAが使用できます。

Gliadin -機