Mucinsは高分子量の複合糖質で、サイズは0.2から200メガダルトン(MDa)の範囲です。そのサイズの結果として、ムチンは従来のポリアクリルアミドゲルに浸透せず、分離のためにより大きな細孔を必要とします。ムチンアガロースゲル電気泳動の詳細なプロトコールを提供し、相対定量を評価し、ポリマーアセンブリを研究します。
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この記事について
サマリー
要約
ムチン、粘膜表面を裏打ち重くグリコシル化タンパク質は、侵入する病原体に対する上皮を保護することにより先天的防御の重要なコンポーネントとして発展してきました。これらの高分子の主な役割は、粘膜の潤滑を促進しながら粒子捕獲およびクリアランスを容易にすることです。タンパク質合成の間に、ムチンは劇的にこれらの分子の質量と大きさを増加させる強烈なO-グリコシル化および多量体を受けます。これらの翻訳後修飾は、粘液の粘弾性特性のために重要です。これらの分子の複雑な生化学的および生物物理学的性質の結果として、ムチンでの作業は従来のタンパク質分析方法によって克服することができない多くの課題を提供します。例えば、それらの高分子量は、通常のポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動を防止し、その粘着性の性質は、実験チューブへの接着を引き起こします。しかし、健康でムチンの役割を調査（ 例えば 、粘膜の整合性を維持する）および疾患（ 例えば 、hyperconcentration、mucostasis、癌）は、最近関心を集めているし、ムチンは、治療標的として研究されています。高分子をムチンの産生および機能のより良い理解は、ムチン顆粒エキソサイトーシスの新規な医薬の手法、 例えば 、阻害剤および/ または粘液溶解薬につながる可能性があります。したがって、一貫性と信頼性の高いプロトコルは、ムチン生物学は科学の進歩のために重要で調査しました。ここでは、アガロースゲルを用いた電気泳動によってムチン高分子を分離し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、ムチン特異的抗体を用いた信号ならびに赤外蛍光ゲルリーダーを検出するための従来の方法を説明します。これらの技術はムチン定量、多量体化を決定し、ムチンの薬理学的化合物の効果を試験するために広く適用されています。
概要
ムチンは、通常、外部環境にさらされた空洞を裏打ちする粘膜表面によって製造されている（ 例えば 、呼吸器、消化器、生殖器、眼表面）だけでなく、内臓（ 例えば 、膵臓、胆嚢、乳腺）。これらの糖タンパク質の存在は、表面水和を維持し、病原体に対する物理的障壁を形成します。ムチン生産は不可逆的な組織損傷を引き起こす可能性管閉塞、細菌定着および慢性炎症につながることができ、ムチンhyperconcentrationおよび/または異常な粘液の特性を健康粘膜することが不可欠ですが。イベントの同様のカスケードは、 例えば 、いくつかの疾患で観察される。、嚢胞性線維症1、慢性中耳炎2と頸膣感染3。従って、健康および疾患におけるムチンの役割を理解し、タンパク質同定のためのルーチンのプロトコルを確立することが重要です。
現在まで、19ムチン遺伝子が同定され、1200至るまで大きなポリペプチド鎖のためにエンコードされている（ 例えば 、MUC1）22,000（ 例えば 、MUC16）アミノ酸に。細胞シグナル伝達及び表面遮蔽に関与する膜関連ムチン、およびゲル形成ムチン、粘液ゲルの粘弾性特性を担う：ムチン遺伝子ファミリーは、2つのサブタイプに分類することができます。膜結合型ムチンは主に単量体であり、疎水性の膜貫通ドメインを介して細胞表面に付着します。対....
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プロトコル
1.ムチンジェルウェスタンブロッティングのためにバッファを準備
- 50×TAE（トリス - 酢酸EDTA）緩衝液の1リットルを準備します。
- 蒸留水（のdH 2 O）の700ミリリットルでトリス塩基（0.4 M）、氷酢酸（液体の重量を量る）（0.2 M）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（50 mM）のの14.61グラムの57.1グラムの242グラムを追加します。
- pHを8.0に調整し、 の dH 2 Oで1リットルにボリュームを構成します
- 10倍のローディング緩衝液10mlを準備します。
- 1×TAE緩衝液5mlを準備します。これを行うために、グリセロール（50％）5mlを、ブロモフェノールブルー（0.25％）を25mg、及びドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（1％）100mgを加えます。
- 20倍のナトリウムクエン酸生理食塩水（SSC）バッファーの2リットルを準備します。
- dH 2 Oの1.5リットルで、NaClを350.6グラム（3 M）とクエン酸三ナトリウムの176.4グラム（のNa 3 C 6 H 5 O 7）（0.3 M）を追加します。 pHを7.0に調整し、 の
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結果
我々は、マウスの肺からのBALFにおけるアガロースゲル電気泳動（ 図1）は、次式ムチンの代表的な結果を示します。この例では、Tgは、MUC5ACのマウスモデルのIL-13処置後のムチン産生のアップレギュレーションを示すために、アガロースゲルを使用しました。ウェスタンブロットは、多量体または単量体バンドシグナル強度の定量分析（ 図2）のために使用することができるムチンの発現の視覚的表現を示しています。この方法はまた、ヒト気管支上皮（HBE）細胞の洗浄およびヒト喀痰サンプル中のムチンの発現を示すために使用することができます。この方法は、還元剤で処理した後ムチンの減少を示すために使用することができます。私たちは、DTTの濃度を増加させた （ 図3）で処理されたHBE洗浄液から代表的な結果を示しています。私たちは、還元年齢による治療とムチン還元後の多量の信号強度の損失を定量化NT（ 図4）。
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ディスカッション
このビデオで説明したウェスタンブロッティングをムチンのプロトコルは、タンパク質検出のための定期的な技術、 すなわち 、免疫ブロット法で、分離し、DNAなどの巨大分子を、転送するために分子生物学で使用される従来の技術を兼ね備えています。同技術は、高分子量ヒアルロン酸18の破壊のような複雑なグリコサミノグリカンの生物学を研究するために適用することができます。この技術は、アッセイの広い範囲で使用することができるが、成功したアガロースウェスタンブロッティング細心および時間依存の操作を必要とする手順の多くに依存します。成功を最大にするために、いくつかの重要なステップは、見直されるべきです。
サンプル調製とゲルローディングは、正確な結果を得るための重要なステップです。ムチン豊富なサンプル、 すなわち 。、痰、本質的に、実験チューブに付着し、 すなわち 、ある。、ピペットチップ、遠心分離管、フィルター。正の変位ピペットと事前の使用ピペットチップを-wettingするウェルに粘弾性材料の充填を容易にすることができます。.......
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開示事項
著者らは、開示することは矛盾がありません。
謝辞
著者は、この作業の完了において中心的な役割を果たした彼らの指導と指導に対して、ジョン・シーハン博士とルブナ・アブドラ博士に感謝したいと思います。この研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)(P01HL108808年、UH2HL123645年)およびCystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc.(EHRE07XX0)からの資金提供を受けて行われました。キャサリン・ラムゼイは、NHMRCアーリーキャリアリサーチフェローシップによってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| トリスベース | シグマ | T6060-1kg | 1 kg |
| 氷酢酸 | シグマ | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | シグマ | EDS-100g | 100g |
| グリセロール | フィッシャー | BP229-1 | 1 L |
| ブロモフェノールブルー | シグマ | 114391-5g | 5 g |
| SDS (ドデシル硫酸ナトリウム) | Σ | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (クエン酸生理食塩水) バッファー | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| クエン酸三ナトリウム (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (ジチオスレイトール) | Sigma | D0632 | 25 g |
| 粉乳 | Saco | インスタント無脂肪粉乳 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| 抗 GFP ヤギ一次抗体 (マウスサンプル) | Rockland 抗体およびアッセイ | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 抗 Muc5b ウサギ一次抗体 (マウスサンプル) | UNC | ||
| H300 抗MUC5B一次抗体(ヒト検体) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (ヒト検体) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| ロバ アンチウサギ 800CW IR 染料 | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| ロバ アンチマウス 680LT IR 染料 | LI-COR バイオサイエンス | 926-68022 | 0.5 mg |
| 電気泳動 ゲル ボックスとキャスティング トレイ | フクロウ 分離システム | ||
| 電源ボックス | Biorad | モデル 200/20 | |
| 膜ブロッティング ペーパー | アマシャム | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | ジェ | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 V | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey 赤外線蛍光システム | LI-COR Biosciences |
参考文献
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotei....
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再版と許可
