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方法論記事

覚醒ラットに移植し、無線電図の記録と視覚誘発電位

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DOI:

10.3791/54160

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2016年6月29日

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1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

この記事について

サマリー

私たちは、記録が麻酔の交絡せずに行われている人間の状態により類似している眼（網膜電位）と覚醒ラットにおける脳（視覚誘発電位）、からの視覚的な電気生理学的信号を測定するための外科的移植や録音手順を示しています。

要約

フルフィールド電図（ERG）と視覚誘発電位（VEP）は、実験室や臨床現場の両方で網膜および視覚経路の完全性を評価するための便利なツールです。現在、前臨床ERGおよびVEP測定値が安定した電極の配置を確実にするために、麻酔を用いて行われます。しかし、麻酔が非常に存在することは、正常な生理学的反応を汚染することが示されています。これらの麻酔の交絡を克服するために、我々は、意識のあるラットにERGおよびVEPをアッセイするための新しいプラットフォームを開発しています。電極は、外科的にERGをアッセイし、硬膜外視覚皮質の上VEPを測定するために、目にサブ結膜に注入されます。振幅および感度/タイミングパラメータの範囲は、発光エネルギーを増加させることERGおよびVEPの両方についてアッセイします。 ERGおよびVEP信号が少なくとも4週間後の外科的移植のための安定した再現性であることが示されています。麻酔なしERGおよびVEP信号を記録するこの能力は、前臨床の中で困惑しますettingは、臨床データに優れた翻訳を提供する必要があります。

概要

ERGおよびVEPは、研究室や診療所の両方にそれぞれ網膜および視覚経路の完全性を評価するためにインビボツールで低侵襲性です。全視野ERGは、網膜経路1,2の異なるセルクラスを表す各要素に、異なるコンポーネントに分解することができる特徴的な波形が得られます。古典的な全視野ERG波形は、感光体の活動のポスト露光2-4を表現することが示されている初期の負の傾き（波）、から構成されています。 A波は、中間網膜、主にONバイポーラ電池5-7の電気的活動を反映して、実質的な正の波形（B波）が続きます。さらに、一ロッド応答8から円錐を単離する光量と刺激間間隔を変化させることができます。

フラッシュVEPは、網膜光刺激に応答して視覚皮質および脳幹の電位を表し、9,10。この波形は、レチノ- geniculo-線条経 ​​路11-13およびラット11,13の様々なV1ラミナで行わ皮質処理を表す後半部品のニューロンの活性を反映し、早期の成分と、初期および後期のコンポーネントに分解することができます。したがって、ERGおよびVEPの同時測定は、視覚経路に関与する構造を総合的に評価を返します。

現在、動物における電気生理学を記録するために、麻酔は、電極の安定した配置を可能にするために使用されます。そこに意識のあるラット14-16でERGおよびVEPを測定しようとする試みであったが、これらの研究は、面倒なことができ、動物の動きと自然な行動17を制限することにより、動物のストレスにつながる可能性があり、有線の設定を、使用してきました。改善された小型化とバッテリー寿命を含む無線技術の最近の進歩により、ERG ANのための遠隔測定方法を実現することが可能ですDのVEP記録、有線記録に関連したストレスを減少させ、長期の生存率を向上させることができます。テレメトリプローブの完全に内在安定した注入は、慢性体温、血圧18、アクティビティ19の監視だけでなく、脳波20のための成功することが証明されています。技術のこのような進歩はまた、慢性研究のためのプラットフォームの有用性を増加させる、意識的な記録の再現性と安定性を支援します。

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プロトコル

倫理の文：動物実験は科学的な目的のための動物の管理と使用（2013）オーストラリア規範に従って行いました。動物の倫理承認は、動物倫理委員会、メルボルン大学から入手しました。材料は、本明細書においてのみ実験室での実験のためであり、医学的または獣医学的使用のために意図されません。

1.準備電極

注：3チャンネル送信器は、同時に実施する2 ERGおよび1 VEP記録を可能にする外科的移植のために使用されます。アクティブ3と3不活性な電極が眼に取り付けるために、移植前にリング状にあらかじめ作られる必要があります。非アクティブ電極はフルカラーのシースで覆われている一方で識別目的のために、製造業者は、半分白で半分色のプラスチック製のシースを活性電極を同封しました。接地電極（透明なプラスチック製シース）が変更されません。すべてのアクティブおよび非アクティブな電動式のため頌歌行為は1.1、1.2、1.3および1.7のステップ。

  1. 2細かい傾いてペンチで二本鎖ステンレス鋼電極を捩れ。
  2. リング電極を形成するために、残りの一つの長いストレートの鎖を残し、ステンレス鋼より線（先端から約1cm）のいずれかをトリミングします。
  3. 電極の先端に滑らかなリングを形成し、バック自体やねじれの上に単一のステンレス鋼の鎖を折ります。
  4. ERG活性電極のファッションのためのこのループ〜0.2 - ループの基盤をねじることにより、直径0.5mm（ここで説明する目的のために、両眼からのERGを記録するために、このように二つの活性電極を形成）、およびERG非アクティブとVEP電極は、ループの直径は〜直径0.8mm（この例では、一つの活性VEP電極と3つのすべての非アクティブな電極のためにこれを行う）します。
  5. ステンレス製のネジ（直径0.7ミリメートル、長さ3ミリメートル）を中心とする円形VEP活性電極をフックので、電極は、ねじ頭部に当接しています。
  6. ホー第二のステンレス鋼製ねじ（直径0.7ミリメートル、長さ3ミリメートル）の周りに3不活性な電極（2 ERG、1 VEP）をk個。
  7. 刺激を減らすために2つのステンレス鋼の鎖の鋭い端にある前方プラスチックスリーブを引き出します。
  8. 約25℃以上10時間、2％グルタルアルデヒド中に浸漬することによって遠隔測定送信機を滅菌します。次いで滅菌生理食塩水で3回送信リンス。

2.トランスミッタ移植

  1. 動物の準備
    1. 70％エタノールで洗浄することにより、実験前に手術領域を消毒します。使用前に、すべての手術用機器をオートクレーブないときは手術中に使用中のクロルヘキシジンで機器を維持します。無菌環境を維持するために、手術中に手術用ドレープで動物をカバーしています。すべての実験者は外科用マスク、滅菌手袋とガウンを着用していることを確認します。
    2. 3 L /分maintaiの流速で、2％のイソフルラン - 1.5で麻酔を誘導手術全体で2 L / minで2％ - 1.5で定義さ。足の指の間の筋肉をつまん時にペダル反射の欠如によって麻酔の十分な深さを確認してください。
    3. 胸骨に鼠径部の上から腹部の上に40ミリメートル×30ミリメートルの領域を剃ります。
    4. 目に、額の上に後部を30ミリメートル×20ミリメートルの領域を剃るし、耳に前方。
    5. 2剃らエリアを消毒。額面積については10％ポビドンヨード3回（外科技師の協会が定め実践の標準と一致している、目に近い領域のアルコール系消毒薬の使用を避ける）で消毒します。腹部の上に10％のポビドンヨードおよび70％エタノールで消毒します。
    6. 追加の局所麻酔用角膜にproxymetacaineの1滴を適用します。
    7. 目の乾燥を防ぐために、角膜にカルボキシメチルセルロースナトリウムの1滴を適用します。
  2. 外科的移植
    1. 10ミリメートルの切開を行います手術用メスで耳の間の垂直方向の正中線に沿って頭の上に。
    2. 胸骨下の正中線に沿って皮膚層を通って腹部に5ミリメートルの切開を行います。
    3. トンネルヘッド切開への腹部切開部から直径5mmのカニューレを皮下。
    4. 頭部への腹部からカニューレを通して送信機の電極線（3アクティブおよび3非アクティブ）をフィード。
    5. 送信機のベースと基準電極のままにして、無菌ガーゼで電極先端をカバーしています。
    6. 無菌ガーゼで電極チップ（3アクティブおよび3非アクティブ）をカバー。
    7. 定位プラットフォームにラットの頭を固定します。
    8. 手術用ハサミで長さが30ミリメートルに額切開を拡張します。
    9. 〜3および9時 - 2縫合糸（0-3）でたるんだ皮膚を後退させることにより手術領域を公開します。
    10. ブレグマ、ラムダと正中縫合糸を公開するために滅菌ガーゼを使用して頭蓋骨を覆う骨膜を削り取ります。
    11. VEPアクティブで頭蓋骨を介して2つの穴をドリル定位座標を（正中線にブレグマするために5ミリメートル吻側）と非アクティブ（7ミリメートルは、腹側正中線横3ミリメートルをブレグマ）。
    12. 既成の穴に深さ〜1ミリメートルの小さなスクリュードライバーで頭蓋骨にあらかじめ取り付けられたステンレス製ビス（直径0.7ミリメートル、長さ3ミリメートル）でVEPアクティブおよび非アクティブ電極を取り付けます。これは、基礎となる皮質組織を損傷することなく、骨にネジを固定します。
    13. 一時的に上まぶたを撤回する0縫合糸 - ERG活性電極を埋め込むためには、8を使用します。
    14. 優れた結膜円蓋に至るまで、目の後ろから16〜21 Gカニューレを皮下に挿入します。
    15. 案内針を外します。
    16. 目に向かって額から短縮プラスチックカテーテルを通して活性電極をフィード。その後、プラスチックカテーテルを取り外します。
    17. ELECを防止するために、電極のループに通されている、 - 一時的な縫合糸（0~8）を使用しトンネルに戻って後退からtrode。
    18. 1ミリメートル輪部の背後に、12時位置に優れた結膜上の0.5ミリメートルの切開を行います。根底にある強膜を露出するように鈍的切開を使用してください。
    19. 半分の強膜の厚さで角膜輪部のすぐ後ろに0縫合糸 - 0または9から8を埋め込みます。
    20. ERG活性電極からの一時的な縫合糸を取り外します。
    21. 電極の先端が角膜輪部の近くに位置して確実に3回連続結び目を結ぶことにより、半分の強膜の厚さの縫合糸​​にERG活性電極を固定します。
    22. （0 - - 0〜9の8）1〜2中断縫合糸を使用して、結膜フラップを閉じます。結膜は完全に快適性を向上させるためにERG電極を覆っていることを確認してください。
    23. まぶた後退縫合糸を取り外します。
    24. 反対側の眼のための手順を繰り返します。
    25. すべてステンレス製のネジと電極線を確保するために頭蓋骨の上にシアノアクリレートゲルを適用します。 ERGアクティブ電極がアンに固定する前にきつすぎる引っ張られていないことを確認できる眼球運動。
    26. 0縫合糸 - 非吸収性3を使用して、ヘッドの傷を閉じます。
    27. 腹部領域を露出するようにげっ歯類を回転させます。手術用ハサミで白線に沿って40ミリメートルに腹部の皮膚切開を延長。
    28. 内側の腹腔を露出するように、内側の筋肉壁を通して35ミリメートルの切開を行います。
    29. 2本の縫合糸（3から0）を使用すると、動物の右手側内腹壁に送信機本体を取り付けます。肝臓を触れないようにしてください。
    30. ループ接地電極と縫合糸（3から0）で、この形状で安全な。腹腔内で自由に浮遊して置きます。
    31. （ - 0 3）連続縫合を使用して腹膜を閉じます。
    32. 結節縫合（ - 0 3）を使用して、皮膚切開を閉じます。
  3. 術後のケア
    1. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで、動物を監視します。ハウス単独手術後の動物。
    2. carprの管理ofen皮下に4日間、一日一回鎮痛（5ミリグラム/キログラム）のために。
    3. 7日後に手術のために飲料水に予防的抗生物質の経口投与（Enrofloxin、5ミリグラム/キログラム）を追加します。
    4. 最初の7日後の手術のための刺激を低減するために、皮膚の切開部位に抗炎症軟膏を適用します。

覚醒ラットにおける3.行動ERGおよびVEPレコーディング

  1. ダークERGおよびVEPレコーディングの前に12時間のために動物を適応させます
  2. 暗赤色照明（17.4 cd.m -2、λ 最大 = 600 nm）の下にあるすべての実験操作を行います
  3. 局所麻酔（0.5％proxymetacaine）および拡張する（0.5％トロピカミド）角膜に低下を適用します。
  4. カスタムメイド、明確な拘束具に配慮した齧歯類を導きます。
    注：このプラスチックチューブの長さを60mmに固定し、全体的な直径を有する異なるサイズのラットを収容するように調整することができます。装置の先端は、ヘッドMOを最小限にするために先細になっていますvementと正常な呼吸を可能にするために穿孔が含まれています。このテーパーフロントは全体野球の開口部に位置合わせし、ラットの頭や目の安定化を可能にします。齧歯類は、手術前に拘束（3〜5の機会）に順応されていることに注意してください。
  5. ボウルの開口部に位置合わせ目で全体野ボウルの前にげっ歯類を置きます。
  6. 送信機の〜5cm以内にマグネットを通過させることにより、留置送信機の電源を入れます。送信機は受信機ベースのLEDステータスランプをチェックしてオンになっていることを確認します。
  7. 以前21記載されているように、発光エネルギー（ すなわち、-5.6 1.52ログにcd.sm -2）の範囲に渡って信号を収集します。簡単に言えば、明るい光エネルギーでの調光器光レベル（〜80リピート）および以下で、平均以上の信号（〜1リピート）。徐々に最も暗いから明るい光レベルに1から180秒に刺激間隔を長くします。
  8. ERGロッドを単離するために、コーン応答は、ツインフラッシュパラダイム8を利用します 。例えば、1.52ログcd.smで2点滅を開始-2で-間500ミリ秒刺激間間隔で。
  9. 明るく発光エネルギーでVEP信号、平均20のリピートを記録するには（ すなわち、1.52ログcd.sm -2、5秒刺激間間隔）。
  10. 時間をかけて信号の変動によって評価されたインプラントの安定性を評価するために、7、10、14、21、28日後に手術ERGおよびVEP録音を行っています。
  11. キシラジン麻酔（12：1ミリグラム/キログラム）の実験期間の後、ケタミン後pentobarbiturateの心臓内注射（1.5ミリリットル/ kg）を介して、ラットを安楽死させます。

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結果

感光体の応答は、ラムとピューのモデルに基づいて、それぞれの動物のためのトップ2の発光エネルギー（1.20、1.52ログCSM -2）でERG応答の最初の下降脚の先端に遅れガウシアンをフィッティングすることによって分析されます22は 、フードとバーチ23によって定式化。この式は、振幅と感度パラメータを返し、（それぞれ図1Cおよび1D）。双曲線関数は、（それぞれ、 図1E及び1F）振幅及び感度パラメータを、返された各動物の桿体双極細胞の光量応答に取り付けました。錐体双極細胞の振幅は、ピーク応答に達するのに要した時間とした暗黙的な時間の波形のピーク応答（ 図1Aおよび1Bの上部波形）として分析しました。さらなる詳細についてはCharng らを参照してください。...

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ディスカッション

視覚電気生理学の低侵襲性の性質のために、ヒト患者におけるERGおよびVEPの記録は意識的な条件下で行われており、唯一の電極配置のための局所麻酔薬の使用を必要としています。対照的に、動物モデルにおいて視覚電気生理学は、従来自主目と身体の動きを排除することによって、安定した電極配置を可能にするために、全身麻酔下で行われます。私たちの以前の出版物24と他の人25-27で示されるようにしかし、一般的に使用される一般的な麻酔薬は、ERGおよびVEP応答を変えます。齧歯類モデルにおける意識のERGおよびVEPプラットフォームのような開発は、今度は臨床所見に前臨床からより良い翻訳性をもたらし得る動物モデルにおける生理学的反応の優れた表現を、提供します。麻酔を使用することの別の欠点は、実験の持続時間を制限することです。具体的には、だけでなく、長時間の麻酔の使用はadministを繰り返します麻酔薬の比率は、薬物28を構築し、関連する呼吸器系の問題のような副作用の可能性を高めることができます。

この研究は、意識のあるラットにおける遠隔...

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開示事項

RGとRFは、この研究の商業資金提供者(ファイザー・ノイセンティスおよびファイザー・グローバル・リサーチ)の従業員です。MIは、この調査中、ファイザー・グローバル・リサーチの従業員であり、現在はプロテオスタシス・セラピューティクス(米国ケンブリッジ)の従業員です。

謝辞

JCは、この原稿を書くための財政的支援に対して、メルボルン大学のDavid Hay Memorial Fundに感謝したいと思います。このプロジェクトの資金は、ARC Linkage助成金100200129(BVB、AJV、CTON)によって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイオアンプADInstrumentsML 135ERGおよびVEP信号を増幅します
カルボキシメチルセルロース ナトリウム 1.0%アラガンCAS 0009000-11-7手術中に角膜の水分補給を維持
カルプロフェン 0.5%ファイザー アニマルヘルスグループCAS 53716-49-7手術後の鎮痛剤、体液補給のための注射生理食塩水で投与
クロルヘキサジン 0.5%オリオンラボラトリーズ27411、80085手術器具の消毒
ノアクリレートゲル活性化剤RSコンポーネント473-439すぐにシアノアクリレートゲル
ノクリレートゲル をRSコンポーネント473-423頭蓋骨にステンレスネジを固定
デンタルバーストルツインスツルメンツ、バウシュ・ロムE0824A直径~0.7mmのミニチュアドリルヘッドで、各半球の頭蓋骨に小さな穴を開けてVEPネジを埋め込むことができます
ドリルボッシュドレメル 300シリーズトレパニング用自動ドリル
エンロフロキシン・トロイ研究所予防的抗生物質ポストsurgey
Ganzfeld積分球測光ソリューション国際カスタム設計の光刺激装置:直径36 mm、開口部サイズ13 cm
ゼ綿棒Multigate Medical Products Pty Ltd57-100B手術中に外科的切開部と露出した頭蓋骨表面を乾燥
イソフルラン 99.9%Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7専有名:イソフロ(TM)吸入麻酔薬。VEP電極インプラント手術用の酸素ガスと混合された医薬品グレードの吸入麻酔薬
Kenacomb軟膏Aspen Pharma Pty Ltd手術後の皮膚刺激やかゆみを軽減するために
Luxeon LEDsPhillips Lighting Co.光刺激のために、205 Wおよび1 W LEDs、Scopeソフトウェアによって制御される
針(マクロ手術)- 0縫合糸、目の針、刃先5/16円サイズ1、15 500224
mmと使用される腹部および頭部手術のためのWorld Precision Instruments 501959ニードルホルダー(マイクロサージェリー)ワールドプレシジョンインスツルメンツ555419NT眼科手術中に針を保持するため
オプティバカテーテルスミスメディカルインターナショナル株式会社16または21 G頭蓋骨から結膜までの角膜活性電極
ポビドンヨード 10%サノフィ-アベンティスCAS 25655-41-8独自の名前:ベタジン、手術のために剃った皮膚を準備するための消毒剤 10%、500ミリリットル
Powerlabデータ収集システムADInstrumentsML 785テレメトリー送信機から信号を取得し、テレメトリーデータコンバーターProxymetacaine
0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9局所眼痛麻酔レス
トレーナーcutomは、頭の動きを最小限に抑えるために拘束の前面が先細りになっています、長さは異なるラットの長さに対応するように調整することができます、全体の直径は60ミリメートルです。
スケープ刃R.G.メディカルサプライSNSM0206手術切開用
ハサミ(マクロサージャリー)ワールド精密機器腹部・額組織切開用501225
サミ(マイクロサージャリー)ワールド精密機器501232結膜を解剖する電極アタッチメント用
スコープソフトウェアADInstrumentsversion 3.7.6ADI Powerlabシステムを介して同時に刺激をトリガーし、データを収集
ShaverOsterGolden A5手術部位から毛皮を削る
ステンレス製ストリールネジ マイクロファスナーL001.003CS304シャフト径0.7 mm、長さ3 mm 
脳定位固定装置フレームデビッド・コップモデル900頭蓋骨の移植ランドマークを特定するための小動物定位固定装置
外科用ドレープ重要な医療用品GM29-612EE手術中の無菌環境を確保
縫合糸(マクロ外科)ボ 腹部および頭部手術を縫合するための医療用針 3-0、滅菌シルク編組、60cm
縫合針(マイクロサージェリー)ニンボ医療用ニードル8-0または9-0、強膜への電極縫合および結膜創傷の閉鎖、ナイロン縫合、3/8円1× 5、30cm
テレメトリーデータコンバーター DataSciences InternationalR08データ収集ソフトウェアとインターフェースするテレメトリ信号を可能にします
テレメトリデータ交換マトリックスDataSciencesインターナショナル送信機からデータを収集し、受信機とペアにします
テレメトリデータ受信機DataSciences InternationalRPC-1送信機からテレメトリデータを受信し
テレメトリ送信機DataSciences国際F50-EEE3チャンネルテレメトリー送信機
トロピカミド 0.5%アルコンラボラトリーズ 虹彩拡張
ピンセット(マクロサージェリー)World Precision Instruments500092腹部および頭部手術中の組織操作ピン
セット(マイクロサージェリー)World Precision Instruments500342眼科手術中の組織操作
シアシア乾燥させます。・ガーさせる 3 ハします フ です ニン眼科手術用は、ます

参考文献

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