免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック

サマリー

腸の粘膜内層に沿って上皮細胞の正確な同定と位置が異なる細胞系譜を定義することが不可欠です。腸組織の適切な画像化は、最大解像度でのタンパク質発現パターンの同定のために重要です。本研究では、マウスの腸組織を処理するための最適な方法および条件を線引きすることを目指しています。

要約

腸上皮の恒常性を調節する因子の役割と、損傷や再生への反応を理解することは重要です。現在の文献では、データ検証のために腸組織の画像を取得するためのいくつかの異なる方法論的アプローチが説明されています。この論文では、マウス腸組織の誘導とプロセシングに関連する一般的なプロトコルについて説明します。腸組織の適切な固定と、腸上皮の形態を強化するスイスロール技術について説明します。切除後の処理と埋め込まれた腸組織の向きを変えることは、切片化後に無傷の腸の構造的特徴を示すパラフィン包埋ブロックを得るために重要です。スイスローリング技術は、検査された完全な腸または結腸切片の組織学的評価に役立ちます。腸の構造的特徴を区別する能力は、全長に沿った腸の炎症と腫瘍形成の定量的測定に不可欠です。最後に、パラフィン包埋切片は、免疫組織化学および免疫蛍光検出法の両方を使用した堅牢な処理に最適です。非蛍光性免疫組織化学切片は、さまざまな細胞構造の特徴を詳述した組織の鮮明な画像を提供しますが、細胞内共局在実験には柔軟性を提供しません。複数の蛍光チャンネルを免疫蛍光検出と併用して共局在実験に適切に利用することができ、機構研究をサポートします。

概要

哺乳類の腸上皮は円柱細胞の単層を含みます。分化した細胞は、絨毛の領域を占有しながら、小腸において、増殖細胞は陰窩に閉じ込められます。大腸には​​絨毛がないのでしかし、増殖性細胞は陰窩の底に局在し、分化した細胞は陰窩の上部領域を占有しています。陰窩内の増殖細胞の連続した​​分割によって駆動される - （5日、約3）腸上皮は、迅速な補給を受けます。陰窩の増殖細胞は均質な集団ではなく、さらに、幹細胞とトランジット増幅（TA）のセル¹に細分化されています。 ²一番下から5細胞-幹細胞は、最初の4以内、陰窩の底部に存在します。陰窩ベース柱状（CBC）、幹細胞と予備静止幹細胞：現在のモデルは、2つの幹細胞の種類の存在をサポートしています。 CBCのTEM細胞が活発に増殖しているとロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体^{5（LGR5）3、Olfactomedin 4（Olfm4）4}とAchaeteの盾板状の^{2（Ascl2）5}でマークされています。一方、予備静止幹細胞は、B細胞特異的モロニーマウス白血病ウイルス統合部位^{1（BMI1）6、}マウステロメラーゼ逆転写酵素^（mTert）7により標識され、HOPホメオボックス^{（Hopx）8、}ダブルコルチン様およびCAMキナーゼ様^{1（DCLK1）9、}およびロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリン様ドメイン^{1（Lrig1）10。}活発に増殖している幹細胞は、次いで、吸収細胞（腸細胞）および分泌細胞（腸、杯、パネート、およびタフト細胞）へのさらなる分化を受けるTA細胞を生じます。彼らはアポトーシスを起こすとされている絨毛のトップに到達するまで増殖帯での連続的な細胞分裂は、陰窩 - 絨毛軸に沿った上皮細胞の上方への移動をもたらします上皮の表面から脱落。腸上皮細胞の異なる種類は、異なるタンパク質（ 例えば 、腸杯細胞がリゾチームに対する抗体でMUC2及びパネート細胞に対する抗体で染色することにより認識することができる）の発現によって示されています。私たちは、腸上皮^11-13の恒常性と病理生物学におけるクルッペル様因子（KLFs）の役割を研究します。変形スイス圧延技術の実現可能性を支持し、ここで示された結果は、活発に増殖し、腸上皮幹細胞¹⁴の維持にクルッペル様因子5（KLF5）の役割の以前の研究に基づいています。 KLF5は、高活性腸管幹及びTAのセル¹²内で発現されるジンクフィンガー転写因子です。以前の研究では、KLF5はのKi-67、腸陰窩で知られている増殖マーカーと共発現していることを実証しました。

胃腸のtr行為は、構造的または機能的に均質な組織ではありません。小腸はさらに、近位、中間、および遠位の部分に分け、後者で、十二指腸、空腸、および回腸と盲腸および結腸に大腸に分割されています。これらの各セクションは、固有の組織学的特徴を有しており、別個の役割^15を担っています。このように、傷害及び腸上皮の応答の程度の影響を研究した組織¹⁶の領域に依存してもよいです。さらに、種々のマウス系統は、試験¹⁶に使用される損傷の種類に基づいて、組織学的レベルでの応答の多様性を示します。これにより、組織標本にふさわしい、適切な組織学的および腸組織の分子の分析を可能にするために必要です。このように、スイスロール技術は一度に腸上皮の完全な長さの分析を許可するため、総合的な情報に基づいて、十分な情報に結論を確認します。

e_content ">スイスロールの技術は最初マグナス¹⁷言及し、MoolenbeckとRuitenbergパークらによって詳細に説明した。組織を調製し、組織を実行するための方法は、それぞれ、げっ歯類腸^18,19を分析する。プロトコル診断目的のために、タイムリーかつ信頼性の高い組織調製のために許可する独自の方法の改良版は、この公報に提示描写。この修正された技術は、効率的なコレクションと、そのような免疫組織化学、免疫蛍光、ならびに普遍的に使用される技術のための腸管上皮の調製を可能にしますin situハイブリダイゼーション（蛍光及び発色^20） のように。また、変更された組織標本の作製方法は、容易に入手可能で利用し、比較的安価な試薬の迅速な組織固定の方法を提供しつつ、さらなる評価のために、タンパク質、DNA、及びRNAの回収を可能にする。撮影します一緒に、THIsの技術は、腸上皮の、組織病理学的病理学、および分子的特徴を総合的に評価するための優れたです。

プロトコル

1.マウス

1. マウスを含むすべての研究は、ニューヨーク州立大学ストーニーブルック校施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。マウスは、12：12時間の明暗サイクルで維持しました。
   1. 商業的にC57BL / 6マウスを得ます。 loxP部位^{（L / F リットル F} KLF5）によって隣接KLF5対立遺伝子を運ぶC57BL / 6マウスを入手します。これらのマウスは、以前に^21を説明し、優雅博士良三永井によって提供されました。
2. LGR5プロモーター（LGR5-EGFP / CreERT2マウス）の調節下に誘導性Creリコンビナーゼ遺伝子を有するC57BL / 6マウスを購入します。
3. LGR5-EGFP /クレエ^T2 / KLF5 ^{のF リットル / f が リットルマウス}を確立するために、交差KLF5 ^{FL / F} LGR5-EGFP /クレエ^T2マウスで、次いでKLF5 ^{FL / F リットル}の子孫を戻し交配^{リットルマウス} マウス。
4. プロトコルに従って、タモキシフェンで処理したマウスは、以前に^22を説明しました。 5日間連続して、滅菌コーン油に溶解したタモキシフェンの1ミリグラム（10ミリグラム/ミリリットル）で、8週齢の実験及び対照マウスの腹腔内（IP）を注射します。
5. 最初のタモキシフェン注射後14日目に、CO ₂ガス源に接続されたチャンバ内にそれらを配置することにより、CO ₂窒息を使用して犠牲マウス。マウスは無意識であり、すべての動きが停止するまでガスが室内に流入することを可能にします。安楽死を確実にするために、頸椎脱臼を行います。

2.組織調製およびスイスのローリング

1. 解剖鉗子とハサミを使用して、腹側の皮膚に切開をカット。鉗子のペアで、切開で皮膚を保持し、静かに腹部の筋肉組織から引き出します。腹部の皮膚をカットし、腹部の筋肉を露出するようにハサミを使用してください。
2. 保留とPEをプルアップ鉗子でritoneum。保持や腸で引っ張ることがないようにしてください。慎重に腹膜組織の切開を行い、腹部の筋肉を露出させるために皮膚を切り取る続けます。慎重に腹部の筋肉の切開を行い、腸を露出するために、それらを切り取る続けます。
3. それは直腸/肛門に参加する遠位端にコロンとトレースを特定します。はさみのペアで、できるだけ肛門開口部に近​​いカット。
4. それは小腸と合流胃およびトレースを特定します。はさみのペアで、約1cm離れて胃から腸を解放カット。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する清潔なペトリ皿に解放された小腸および結腸の全長を転送します。
5. 1手や鉗子のペアで、結腸の遠位端を保持し、静かに任意の腸間膜の結合および/または脂肪組織からの結腸の全長を解明するためにもう一方の手を使用しています。
6. 盲腸を特定（小腸および大腸の間に小さなポーチ）と盲腸および結腸にコロンを解放するために（コロンの近位端）に参加ここでカット。
7. 1手や鉗子のペアで、小腸を保持し、穏やかに任意の腸間膜の結合および/または脂肪組織から小腸の全長を解明するためにもう一方の手を使用しています。盲腸を離れてカットし、それのための必要がない場合は破棄します。
   注：このプロセスは一晩修正ブアン固定液（DH ₂ O中の50％エタノール/ 5％酢酸）で切り出し腸をインキュベートすることによって、ここで停止し、次の日の手順を続行することができます。
8. 腸（小腸または結腸）の1セグメントを取り扱い、修正ブアン固定液で10 mlの注射器を記入し、それに強制経口投与針を取り付けます。腸セグメントの前方開口部に半分センチ程度の針を挿入します。
9. 楽器でしっかりと圧力を加えることによって、腸のセグメントの内側胃管栄養針を保持します腸セグメント上。一方は注射器を保持すると、修正されたブアン固定液を使用して、腸のセグメントの内容をフラッシュする優しいが、一貫性のある圧力をかけます。このステップは、腸のセグメントと直接固定を同時に洗浄することができます。フロースルー廃棄物を収集するために、ペトリ皿を使用してください。固定は不透明回し大腸色によって観察することができます。
   注意：洗浄または腸のセグメントが破裂かもしれない間、あまりにも多くの圧力を適用していないことを確認してください。
10. はさみを使用して、腸間膜ラインに沿って長手方向に腸のセグメントを切り開きます。ピンセットでそれを保持し、PBSを含むペトリ皿に簡単にそれをすすいでください。
    1. 近位、中間、および遠位：3つの等しいセグメントに小腸をカット。近位セグメントは、胃の直後一つであり、及び遠位セグメントはコロンの直前1です。近位セグメントは、十二指腸、空腸半ば、および遠位にすることと同じです回腸。
    2. 各セグメントについて、近位端および遠位端をマーク。近位端は、もともと胃に向かって指したものであり、遠位結腸に向かって指摘しました。
11. 洗浄し、開かれた腸セグメントを配置するために、ペトリ皿の上部を使用してください。上向きに腔側と腸のセグメントを配置します。
    1. コロンの場合は、その幅を横切って実行variegations /畝によって腔側を識別し、近位端に存在しています。中間領域と遠位領域は、長手方向に実行するいくつかのvariegationsを持っています。小腸は、絨毛をマークラフに見える表面で腔側を識別します。
       注：小腸のために、近位、中間及び遠位領域の外部肉眼解剖学的境界はありません。しかしながら、これらの領域は、顕微鏡下のセクションで同定することができることができます。絨毛は、近位領域で最長であり、彼らがどこにある遠位徐々に短くなって長さが短いです。顕微鏡、結腸陰窩はまた、リッジの存在によって同定することができる近位領域に最短です。結腸陰窩は、近位領域よりも、まだ、まだ背の高い中央部で最も高いと遠位領域で短くなっています。
12. スイスは、コロンをローリングして進みます。
    1. フラットオープンコロンを維持し、ペトリ皿の縁に向かって、その近位端からピ​​ンセットでそれを引っ張ります。
    2. 上を向い腔側を維持し、片手で鉗子と近位端を保持し、もう一方の手で爪楊枝を保持します。
    3. 鉗子を使用して、つまようじの周りの近位端の縁をラップし、少しの場所でそれを保持するためにつまようじに対して包まれたエッジをはさみます。
    4. ゆっくり、ゆっくりとスイスロールを形成するためにつまようじの周りにコロンをロール指でつまようじを転がり始めます。
    5. 結腸全体の長さがロールアップされた後、慎重にCをスライドするようにピンセットを使用しつまようじオフと組織処理/ -EmbeddingカセットにOLONスイスロール。室温で一晩、10％緩衝ホルマリン中にカセットを置きます。
13. スイスは、小腸をローリングして進みます。
    1. 一度に一つのセグメントを取り扱い、腔側とフラットオープンセグメントを維持し、ペトリ皿の縁に向かって、その近位端からピ​​ンセットでそれを引っ張ります。
    2. コロンで説明したようにスイスのローリングを続行します。
14. パラフィン包埋のためにホルマリン固定組織の処理に進みます。以下のように実行します。
    注：（詳細は材料および機器のを参照してください）​​自動化されたプロセッサを使用してください。
    1. 組織は、カセットにある間は固定液が完全に除去されるまで、PBSで組織をすすぎます。
    2. 以下の順序でエタノールを用いて組織を脱水：10分間、50％エタノール、10分間、70％エタノール、10分間、80％エタノール、10分間、95％エタノール、10分間100％エタノール、10分間100％エタノール、および110分間の00パーセントエタノール。
    3. 次の順序でキシレンとの交流のエタノール：2：1のエタノール：10キシレン - 15分、1：1のエタノール：10キシレン - 15分、1：2のエタノール：10キシレン - 10で15分間、100％キシレン - 15分、10、100％キシレン - 15分、および10のための100％のキシレン - 15分。注意：キシレンは、このように職場が適切なフードと担当者が身に着けていたしなければならない適切な保護具で局所排気装置を装備する必要があり、健康被害です。
    4. パラフィンとの交流キシレン。オーブン54に設定し、真空中で次の手順を実行 - 58°C：1キシレン：2 30分間パラフィン、1：1キシレン：30分間パラフィン、1：2キシレン：30分間パラフィン、100％のパラフィン1から2時間、および1のための100％のパラフィン - 2時間または一晩。
       注：これはパラフィンポリマーを低下させ、それが硬くて脆いようになりますので、パラフィンが長期間60℃を超えないようにしてください。
    5. デ新鮮な新しいパラフィンおよび配向組織に埋め込みますパラフィンが硬化する前に産ま。スイスロールのために、組織のパラフィン除去以下は、パラフィン包埋の間、その側に各ロールの位置を変更することが重要です。これは、切断中に、各ロールの全長のセクションが生成されることを保証します。
15. 染色のために、ミクロトームを用いて5μmの厚さの切片を切りました。 65℃のオーブンで一晩中（焼く）に帯電したスライド上のセクションを収集し、それらを乾燥させ;室温まで冷却し、その後、染色のためにそれらを使用してみましょう。
    注： - 新たにスライドしている切断方法に応じて、2時間の焼成時間は、1に短縮することができます。切片以来1カ月未満ならば、一晩焼くことをお勧めします。それはヶ月以上されている場合は、1 - ベーキングの2時間は、時間を節約するのに十分です。時間が不足している場合は、一晩のバッキングは常に使用することができます。

3.組織学的分析および免疫蛍光染色

組織学的分析およびimmunofluを実行しますorescence染色は、以前に変更を加えて^{、23,24について}説明^しました 。強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）免疫蛍光のために：

1. 1時間65℃のオーブンで焼くスライド内因性アルカリホスファターゼ活性を不活性化し、続いてキシレンで脱パラフィン。
2. 内因性組織ペルオキシダーゼを遮断するために、メタノール中の3％過酸化水素の浴のセクションをインキュベート。その後、10分間125℃でクエン酸緩衝液中で抗原回復が続く減少アルコール浴シリーズ（100％、95％、70％）（10 mMクエン酸ナトリウム、0.05％のTween-20、pH6.0）ででインキュベートすることによって再水和decloakingチャンバを使用。
3. 疎水性の障壁を提供するペンマーキング用いて組織切片の周りに円を描くと（EGFPに対する一次抗体と共に、次に希釈1を37℃で30分間（TBS-Tween中で2.5％ウシ血清アルブミン[BSA]）をブロッキング緩衝液とを用いて切片をインキュベート：500）、加湿チャンバー内で4℃で一晩穏やかに振とうしながら。
4. 切片を洗浄し、37℃で30分間、適切な濃度の蛍光タグ付き二次抗体と共にインキュベートします。
5. ヘキストと二次抗体処理および染色核後、スライドを洗浄し、取り付けメディアでマウントします。
   1. KLF5 / EGFP /のKi-67共染色のために、ステップ3.1で説明したように、プロセスのスライド - 3.3およびKLF5抗体（希釈1：150）とインキュベートすることにより、KLF5染色を行い、一晩。
   2. ウサギAPポリマーの検出は、プロトコルに従って、スライドに適用されます。
   3. Klf4のは、製造業者のプロトコルに従って色原体の免疫組織化学染色を用いて染色を明らかにしました。
   4. 以前に記載されたプロトコル^25を用いて抗体の溶出を実行します。 1時間撹拌しながらグリシンSDS（pHは2.0）溶液中で50℃でスライドをインキュベートします。
   5. 洗浄を蒸留水で徹底的にスライドし、37℃で30分間（TBS-Tween中の2.5％BSA）をブロッキング緩衝液と共にインキュベートします。
   6. Ki-67を追加（希釈1：500）およびEGFP（希釈1：500）を同時に抗体と1時間37℃でインキュベートします。
   7. ヘキストで染色する前に、適切な二次抗体を用いて蛍光検出を行った（データは示していない）とマウンティング培地でマウント。
6. ヘマトキシリンおよびエオシン^{（H＆E）26}と5μmのセクションを染色する上で、組織の組織学的形態を観察します。蛍光画像は、それぞれ、EGFP、KLF5、およびKi-67染色を視覚化するために535、646、および700の発光波長を使用します。

結果

免疫組織化学染色と組み合わせたスイスの圧延技術は​​、小規模または大規模な腸組織の総合的な分析を可能にします。 C57BL / 6マウス（図1）の大腸のH＆E染色の例は、実現可能性と、この技術の有効性を示す図です。近位、中間、および遠位： 図1に示すように 、画像は、結腸の全ての部分をキャプチャすることが可能です。これにより、総合的な組織学的評価を可能にします。スイスのローリングおよび小規模または大規模な腸組織の全体の長さを捕捉する能力は、異種遺伝子発現およびマーカー染色または傷害への腸組織の可変応答のための非常に有用です。

例では、LGR5-EGFP /クレエ^T2マウスにおけるEGFPの染色パターンです。このマウスモデルにおいて、EGFPの発現は、以下によって駆動されますのみ活発に増殖腸陰窩において活性であるLGR5プロ...

ディスカッション

スイスの圧延技術は​​、大規模で組織学的および形態学的評価のための腸組織を調製するための強力な方法です。もともと凍結切片^18,19の製造のために開発された、以前に記載スイス圧延技術とは対照的に、ここで紹介する手順は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）のプロンプト腸組織の準備と固定を可能にします。凍結組織と比較して、FFPE組織は、はるかに長い貯蔵寿命を有しており、なぜなら、より良い組織の完全性の組織学的分析のために組織の好ましいタイプです。スイス・ローリングプロトコルの重要な部分は、圧延および染色かん流後スイスロールの整合性と組織の品質を維持するための組織の柔軟性を必要とします。腸組織のFFPEのための標準的なスイス・ロール方式では、面倒で時間がかかる（2日^）18,19です。また、この標準的な方法は、通常、rと腸組織をもたらしますelatively硬いとスイスロール状に形成することは容易ではありません。 10％緩衝ホルマリン中で切開腸組織の一晩のインキュベーションが組織圧延前​​に必要とされるからです。 FFPE目的のための技術の他の修飾も開発されているが、それらは腸組織の傾向の主...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステンレス鋼解剖キット	VWR	25640-002
デクローキングチャンバー	バイオケア メディカル	DC2012
シリンジ 10 ml	VWR	89215-218
スイングセット ティッシュ埋め込み/処理カセット 蓋付き	Simport	M515
スーパーフロスト プラス スライド [サイズ: 25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
手動スライド染色セット	Tissue-Tek/Sakura	4451
染色皿 グリーン	ティッシュ-TEK/Sakura	4456
染色皿 白い	ティッシュ-Tek/Sakura	4457
24スライドスライドスライドホルダー 取り外し可能なハンドル付き	Tissue-Tek/Sakura	4465
オーブン	Thermo Scientific	6243	65度でスライドを焼くため
解剖顕微鏡	ツァイ	スステミ 2000C
蛍光顕微鏡	ニコン	Eclipse 90i	明るくフルーレセント光、対物レンズ付き: 10X、20X
PAP ペン 超液体ブロッカー ミニ	フィッシャーサイエンティフィ	DAI-PAP-S-M
エタノール 200 プルーフ	AAPR	111000200
メタノール	VWR	BDH1135-4LP
氷酢酸	AAPR	281000ACS
キシレン	フィッシャーサイエンティフィック	X5P-1GAL
過酸化水素 25% 水溶液	アクロス	202465000
10% ブファーホルマリン	フィッシャーサイエンティフィック	22-026-213
ウシ血清画分V、ヒートショック	ロシュ	3116956001
トゥイーン 20	シグマ アルドリッチ	P7949
エン酸ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S279
強制針	VWR	20068-624
ウサギ 抗 Klf5 抗体	サンタクルーズ バイオテクノロジー	sc-22797	希釈 1:150
チキン 抗 EGFP 抗体	ミリポア	AB16901	希釈 1:500
ウサギ 抗 Ki67 抗体	Biocare Medical	CRM325B	希釈 1:500
Mach3 ウサギ AP ポリマー検出キット	Biocare Medical	M3R533L
Warp 赤色色素剤キット	Biocare Medical	WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 マウス	ジャクソン研究所	008875
自動プロセッサー	Leica	Leica TP1020