ここでは、未熟で拡張可能なヒト肝幹細胞の移植後にAlb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCIDマウスで生成された新しいヒト化マウス肝臓モデルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト肝細胞移植によって確立されたヒト化肝臓を持つキメラマウスを含む新しい動物モデルが開発されました。これらのマウスは、肝臓に機能的なヒト肝細胞が再増殖しており、ヒト肝細胞生物学、薬物代謝、およびその他の前臨床応用を研究するための有用なツールとして役立つ可能性があります。ヒト肝細胞のマウスへの移植を成功させるために必要な重要な要素の1つは、内因性肝細胞を排除してヒト細胞との競合を防ぎ、ヒトドナー細胞の増殖と分化を促進するための適切なスペースと微小環境を提供することです。これまでに、フマリアセトアセテート加水分解酵素(Fah)マウスとウロプラスミノーゲンアクチベーター(uPA)マウスを用いた2つの主要な肝障害マウスモデルが確立されています。しかし、Fahマウスは主に成熟した肝細胞と共に使用され、uPAモデルの適用は繁殖の減少によって制限される。これらの制限を克服するために、Alb毒素受容体媒介細胞ノックアウト(TRECK)/SCIDマウスを使用して、未熟なヒト肝細胞のin vivo分化とヒト化肝臓の生成を行いました。ヒト肝幹細胞(HpSC)は、ジフテリア毒素(DT)治療後に致死性劇症肝不全を発症したAlb-TRECK / SCIDマウスの肝臓を成功裏に再増殖させました。Alb-TRECK/SCIDマウスにおけるヒト化肝臓のこのモデルは、薬物代謝および薬物間相互作用を含む研究に機能的応用があり、他のin vivoおよびin vitro研究を促進します。
概要
マウスは、ヒトでの生物医学研究が制限されているため、医薬品の試験によく使用されます。しかし、これらのモデルはヒトで観察された効果を不正確にシミュレートする可能性があるため、必ずしも有用ではありません。現在医療で使用されているほとんどの薬物は、主に肝臓で代謝されます。しかし、同じ薬物がマウスとヒトの肝臓で異なる代謝物に代謝されることがありますが、これは種間の違いによるものです。したがって、潜在的な医薬品が臨床応用にリスクをもたらすかどうかを開発中に判断することはしばしば困難です2,3。
>jove_content<この問題に対処するために、マウス4-6内でヒト肝細胞を増殖させることにより、「ヒト化」マウスの肝臓が開発されました。これらのモデルは、ヒトの肝臓で観察されるものと同様の薬物反応を示します。現在、ヒト化肝臓の作製に用いられている主要なマウスモデルには、ウロプラスミノーゲン活性化因子(uPA+/+)マウス4,7、フマルアセトアセテート加水分解酵素(Fah-/-)マウス6、および最近報告されたチミジンキナーゼ(TK-NOG)マウスが含まれます。しかし、以前の報告では、移植されたヒトの未熟細胞または幹細胞は、Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)マウス肝臓8-10において、成人ヒト肝細胞よりも競争力が低いことが示されています。....
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プロトコル
全ての動物実験手順は、横浜市立大学の動物保護ガイドラインに従って行いました。
急性肝障害モデルマウスの1世代
- 1mg / mlのDTストック溶液を作製するために1mgのジフテリア毒素（DT）から（0.85％のNaCl溶液100 mlの0.6グラムフェノール）フェノール化0.85％のNaCl溶液1mlを加えます。注：1ミリグラムの濃度のDT / mlで8℃に3℃で約2年間保存することができます。
- シリアルフェノール化0.85％NaCl溶液中0.3 / mlのDTに1mg / mlのDTストック溶液を希釈し、作業溶液として0.3 / mlのDT溶液のアリコートを準備します。注：この作業溶液を新たに準備する必要があります。
- 致死未満量（〜50％の致死率）を使用して実験を行うために、8週齢のマウスにDT1.5μgの/ kgの用量を投与します。
- 背側横臥位でマウスを保持することによって、DTの腹腔内注射を行い、needlを挿入膝の曲げ下のeは、左または正中線の右側。膀胱の浸透を防止するために、正中線を避けてください。角度身体への針は約45°です。
- インスリン注射器を用いて、マウス体重20gのあたり新たに調製した0.3 / mlのDTを100μlをマウスに注射します。例えば、18-グラムのマウスには、0.3 / mlのDTの溶液を90μLを受けるべきです。
- 4....
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結果
ALB-トレック/ SCIDマウスの肝細胞は、アルブミンプロモーターの制御下で、ヒトDT受容体HB-EGF遺伝子を発現し、DT投与12以下の細胞毒性効果を発揮します。肝障害に対するDT処置の効果を評価するために、1.5μgの/キロのDT投与量は、8週齢のアルプ・トレック/ SCIDマウスに注射し、肝臓48時間後のDT投与の病理学的変化を組織学的に評価しました。 （いないDTで処理された）コントロールマウスと比較して、DT処置マウスは、増大した血清AST活性を有する輻輳の補正を示す無秩序な肝臓のアーキテクチャを示しました。また、DT-処置したマウスの肝細胞は暗い核（おそらくアポトーシス肝細胞）と一緒に、複数の、濃染好酸性細胞質封入体を持っていました。他のいくつかの肝細胞は、保存や、ほとんど門脈炎症と暗い核を有する空胞化細胞質（ 図1を示し登場します）。これらの知見は、アルプ・トレック/ SCIDマウスは、理想的な致死劇症肝不全モデルを表し、単一のDT注入12を用いて生成するこ.......
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ディスカッション
最近の研究は、マウスの肝臓は、成人肝細胞および増殖性肝幹細胞17を含むヒト肝細胞で再増殖することができることを示しています。これらの再増殖した肝臓は薬物代謝試験および薬物の発見と開発18のための前臨床実験モデルとして使用されています。加えて、それらは、細胞成熟および分化19のためのインビボ環境を提供しています。本研究の主要な目的は、薬物の代謝活動を取得するため、ヒト未熟肝細胞の増殖、成熟、および分化を可能新規な肝疾患のマウスモデルを生成することでした。
脾臓内移植の過程は、広範囲に研究されています。ラットおよびマウスの脾臓に移植された細胞は、彼らの平均寿命を通して生き残ります。脾臓内移植プロトコルは、特定の研究課題を調査するのに非常に有用であることが証明されています。多くの研究室は、世界中のために改良されたマウスの生存と肝再生の肝細胞移植のための高度に再現可能で信頼性の高いモデルとしてこのプロトコルを利用することを試みてきました。移植された細胞の大部分は、彼らがポータル枝を閉塞することができ、肝臓に.......
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開示事項
著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。
謝辞
マウスを提供してくださった東京都医学総合研究所の哺乳類遺伝学プロジェクトに感謝いたします。また、積水メディカル株式会社 ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Instituteの S. Aoyama 氏と Y. Adachi 氏、LC-MS/MS 分析にご協力いただいた Kozakai 氏と Y. Yamada 氏に感謝いたします。本研究の一部は、文部科学省科学省科学研究費補助金(18591421、20591531、23591872)の支援を受けて行われました。江蘇省の革新的で起業家精神にあふれたプロジェクトによるハイレベル人材の導入と江蘇省科学技術計画プロジェクト(BE2015669年)。科学技術振興機構(JST)の戦略的研究開発推進機構(S-innovation、62890004)への助成による。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ヒトアルブミン | Σ | A6684 | マウス |
| CK19 | ダコ | M088801 | マウス |
| ヒト核 | ミリポア | MAB1281 | |
| マウス ヒト CK8/18 | プロジェン | GP11 | モルモット |
| CDCP1 | バイオレジェンド | 324006 | マウス |
| CD90 | BD | 559869 | マウス |
| CD66 | BD | 551479 | マウス |
| GOT/AST-PIII | 富士フイルム | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% トリプシン-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| ジフテリア毒素 | Σ D0564-1MG | ||
| ヒトアルブミン ELISA キット | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| シリンジ (1 ml) | テルモ | SS-01T | |
| 32G 1/2" 針 | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.コンパウンド (118 ml) | サクラファインテック | 4583 | |
| MoFlo高速セルソーター | ベックマン | ターB25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | フイルム | 14B2X10002000046 |
参考文献
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric ....
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