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方法論記事

ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

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DOI:

10.3791/54167

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2016年8月29日

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、未熟で拡張可能なヒト肝幹細胞の移植後にAlb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCIDマウスで生成された新しいヒト化マウス肝臓モデルを紹介します。

要約

ヒト肝細胞移植によって確立されたヒト化肝臓を持つキメラマウスを含む新しい動物モデルが開発されました。これらのマウスは、肝臓に機能的なヒト肝細胞が再増殖しており、ヒト肝細胞生物学、薬物代謝、およびその他の前臨床応用を研究するための有用なツールとして役立つ可能性があります。ヒト肝細胞のマウスへの移植を成功させるために必要な重要な要素の1つは、内因性肝細胞を排除してヒト細胞との競合を防ぎ、ヒトドナー細胞の増殖と分化を促進するための適切なスペースと微小環境を提供することです。これまでに、フマリアセトアセテート加水分解酵素(Fah)マウスとウロプラスミノーゲンアクチベーター(uPA)マウスを用いた2つの主要な肝障害マウスモデルが確立されています。しかし、Fahマウスは主に成熟した肝細胞と共に使用され、uPAモデルの適用は繁殖の減少によって制限される。これらの制限を克服するために、Alb毒素受容体媒介細胞ノックアウト(TRECK)/SCIDマウスを使用して、未熟なヒト肝細胞のin vivo分化とヒト化肝臓の生成を行いました。ヒト肝幹細胞(HpSC)は、ジフテリア毒素(DT)治療後に致死性劇症肝不全を発症したAlb-TRECK / SCIDマウスの肝臓を成功裏に再増殖させました。Alb-TRECK/SCIDマウスにおけるヒト化肝臓のこのモデルは、薬物代謝および薬物間相互作用を含む研究に機能的応用があり、他のin vivoおよびin vitro研究を促進します。

概要

マウスは、ヒトでの生物医学研究が制限されているため、医薬品の試験によく使用されます。しかし、これらのモデルはヒトで観察された効果を不正確にシミュレートする可能性があるため、必ずしも有用ではありません。現在医療で使用されているほとんどの薬物は、主に肝臓で代謝されます。しかし、同じ薬物がマウスとヒトの肝臓で異なる代謝物に代謝されることがありますが、これは種間の違いによるものです。したがって、潜在的な医薬品が臨床応用にリスクをもたらすかどうかを開発中に判断することはしばしば困難です2,3。

>jove_content<この問題に対処するために、マウス4-6内でヒト肝細胞を増殖させることにより、「ヒト化」マウスの肝臓が開発されました。これらのモデルは、ヒトの肝臓で観察されるものと同様の薬物反応を示します。現在、ヒト化肝臓の作製に用いられている主要なマウスモデルには、ウロプラスミノーゲン活性化因子(uPA+/+)マウス4,7、フマルアセトアセテート加水分解酵素(Fah-/-)マウス6、および最近報告されたチミジンキナーゼ(TK-NOG)マウスが含まれます。

しかし、以前の報告では、移植されたヒトの未熟細胞または幹細胞は、Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)マウス肝臓8-10において、成人ヒト肝細胞よりも競争力が低いことが示されています。さらに、Fah-/-マウスは、分化した肝細胞に対してのみ増殖上の利点を提供し、未熟な肝前駆細胞に対しては提供しない11。研究室でのヒト肝幹細胞(HpSC)のTK-NOGマウスへの移植は成功していません。したがって、ヒトの未熟な肝細胞を効率的に生着させるための有用なマウスモデルは現在のところ存在しません。

したがって、私たちはヒトの未熟な肝細胞を効率的に再増殖させることができる新しいAlb-TRECK/SCIDマウスモデルを開発しました。このトランスジェニックマウスモデルは、肝臓細胞特異的アルブミンプロモーターの制御下でヒトヘパリン結合EGF様成長因子(HB-EGF)受容体を発現します。ジフテリア毒素(DT)の投与後、これらのマウスは肝細胞の条件付きアブレーションにより劇症性肝炎を発症し、ドナー細胞の居住と増殖を可能にする12。マウス肝細胞のAlb-TRECK/SCIDマウスへの移植は先行研究13,14で成功しているが、Alb-TRECK/SCIDマウスを用いたヒト化肝臓の作製はまだ報告されていない。

>jove_content<この研究では、HpSCの移植によりAlb-TRECK/SCIDマウスにヒト化肝臓が生成されました。このヒト化肝臓は、普遍的な幹細胞の分化のためのin vivo環境を提供し、ヒトの薬物代謝パターンと薬物間相互作用を予測する能力を提供します。

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プロトコル

全ての動物実験手順は、横浜市立大学の動物保護ガイドラインに従って行いました。

急性肝障害モデルマウスの1世代

  1. 1mg / mlのDTストック溶液を作製するために1mgのジフテリア毒素（DT）から（0.85％のNaCl溶液100 mlの0.6グラムフェノール）フェノール化0.85％のNaCl溶液1mlを加えます。注：1ミリグラムの濃度のDT / mlで8℃に3℃で約2年間保存することができます。
  2. シリアルフェノール化0.85％NaCl溶液中0.3 / mlのDTに1mg / mlのDTストック溶液を希釈し、作業溶液として0.3 / mlのDT溶液のアリコートを準備します。注：この作業溶液を新たに準備する必要があります。
  3. 致死未満量（〜50％の致死率）を使用して実験を行うために、8週齢のマウスにDT1.5μgの/ kgの用量を投与します。
    1. 背側横臥位でマウスを保持することによって、DTの腹腔内注射を行い、needlを挿入膝の曲げ下のeは、左または正中線の右側。膀胱の浸透を防止するために、正中線を避けてください。角度身体への針は約45°です。
    2. インスリン注射器を用いて、マウス体重20gのあたり新たに調製した0.3 / mlのDTを100μlをマウスに注射します。例えば、18-グラムのマウスには、0.3 / mlのDTの溶液を90μLを受けるべきです。
  4. 48時間後DT注射で、血管を拡張するために、約10分間37℃の水浴中でマウスの尾の拘束にマウスを置き、温めて尾静脈から血液を収集します。そして、鋭いメスの刃で先端から尾2センチメートルに1ミリニックを行い、マイクロキャピラリーチューブに血液を収集します。
    1. 5分間1500×gで血液を含むマイクロキャピラリーチューブを遠心し、上清および細胞ペレットを分離することにより血清を収集します。
  5. GOT / AST-上に1：20希釈したマウス血清のピペットを50μlPIIIはスライドします。製造業者のプロトコルに従って多目的自動乾式化学分析装置を用いて650nmで反応生成物（青色色素）の吸光度を測定します。
    注：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の読み出しは、/グルタミン酸オキサロトランスアミナーゼ（GOT）活性が自動的に表示されます。 2日は、DTの注射後、マウスの約60％は12,000の間でAST値を示した - 16,000 IU / Lと急性肝障害を患っていると考えられました。これらのマウスは、新しいケージに移し、細胞移植のレシピエントとして使用しました。

ヒト肝幹細胞の調製

  1. CDCP1 + CD90 + CD66-の亜集団を得ることがCDCP1、CD90、およびCD66細胞抗原を使用して、セルソーターでヒト初代胎児肝細胞からのヒト肝幹細胞を分離し、その後、コラーゲンIVでコーティングした培養皿上で単離された細胞集団をシード、以前に15を報告しました 。胚性のヒト初代胎児肝細胞を使用してください週14と18の間の年齢。
  2. 、100 mmの培養皿上で90％コンフルエンス培地を吸引、10mlのPBSで細胞を洗浄し、その後PBSを削除 - 80％まで培養したヒト肝幹細胞を収集します。 37℃で5分間2mlの0.05％トリプシン/ EDTA溶液で細胞をトリプシン処理。注：細胞分化マウスにおけるそれらの増殖能に影響を与えることができるので、90％以上のコンフルエンスの細胞を、細胞移植に適していません。
  3. 顕微鏡下で細胞分散の状態を監視します。細胞が浮遊または自由に流れるように見える場合には、10％FBSを含むDMEM / F12を8mlを添加することにより酵素消化を停止します。
  4. ゆっくりと10-mlの血清学的ピペットを用いて細胞を懸濁し、15 mLコニカルチューブに細胞を移します。 100×gで5分間、4℃のための細胞を遠心します。
  5. 慎重に10％FBSを含む10 mlのDMEM / F12中で細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡計数チャンバーを用いて細胞数を決定します。
  6. 各個々のマウスのためのPBSのアリコート50μlのあたり1.0×10 6細胞に細胞を分割し、移植まで氷上で保存します。

ヒト肝幹細胞の3脾臓内移植

  1. 37°C電気加熱パッドの上にきれいなケージを置きます。
  2. ノズルの下に置くことによって - （分当たりの酸素の2 Lで1.5％（体積/体積）1）イソフルラン吸入を用いてマウスを麻酔。また、イソフルランに浸したガーゼを含むチューブを使用します。
    1. マウスは軽くリアフットパッドをつまんで麻酔されていることを確認してください。膝ジャークが誘発されている場合は、バックチャンバー内にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
  3. 電気バリカンを使用して手術部位を剃るし、滅菌するために70％（体積/体積）エタノール及びポビドンヨードを適用します。その後、切開に続いてちょうど肋骨の肋骨境界線下の左脇腹に1 cmの皮膚切開を作ります腹壁、ならびに腹膜。
  4. 慎重に脾臓を露出させます。直接各マウスの脾臓に50μlのPBS中に1.0×10 6個のヒト肝幹細胞を注入するために32-G、1/2インチの針で100μlのマイクロインジェクションのシリンジを使用してください。注射のための5°の角度で針を傾けます。
    1. 注入の深さは脾臓の半分以下の厚さであることを確認してください。針は、一方の端部（ヘッド）で脾臓を入力し、もう一方の端（テール）で細胞を付着させる必要があります。
  5. 注射後の細胞の漏れを防止するために、穏やかに2分間の指を使って圧力を適用し、針を取り除きます。
  6. バックマウス本体に脾臓を置き、筋肉組織や皮膚のための通常走行縫合糸で空洞を閉じます。
  7. すぐに移植後37℃で予熱したケージにマウスを転送します。マウスを確保するために、快適に息をケージにその側にマウスを配置することができ、ケージ寝具、手術の部位との間の接触が無効になります。
  8. 麻酔は、縫合糸は閉じたままとマウスは、手術前の状態に戻り確実にするために切れるまでマウスを監視します。
  9. マウスを確認し、通常の飲料水と食料が設けられています。 1時間後、動物中央のマウスの部屋にケージを返し、毎日マウスを監視します。

移植されたヒト肝4.検出は、マウス肝臓における細胞由来肝細胞を幹

注：以下の手順については、頸椎脱臼が続くケタミンとキシラジンの過剰摂取を使用して、すべての動物を安楽死させます。

  1. 4時 - 6週間、移植後、マウスを安楽死させると同時に、手術用はさみを使用して真皮と筋膜を切断して腹腔を開きます。
  2. スプレッダーとしてハサミを使用して、腹膜上記の結合組織を解剖し、腹膜を開くには、白線に沿って腹膜をカット空洞。
  3. 鉗子で胸骨を持ち上げ、横隔膜に穴を開け、最大子宮頸ガードルを介して胸骨の両側を切断。
  4. 肝臓の胸部側の大静脈を切断し、前方方向に肝臓を通って食道を引っ張ります。肝臓を除去するために、振動板を取り外します。
    注：はさみのヒントを出さないように注意してください下に胸部臓器の損傷を防止するために、上向きに指摘しました。胸腺は時折胸骨の背側にしがみつく傾向があり、これは慎重に避けなければなりません。
  5. ハンドルとしてダイヤフラムを使用して、腹腔から肝臓を引っ張って開始します。インテリア大静脈は、所定の位置に肝臓を開催します。インテリア大静脈をカット。途中で右副腎を解放しないように注意してください。
    注：マウスは中葉、左葉、右葉、および尾状​​葉からなる4ローブ肝臓を持っています。胆嚢はの小さな分岐に懸濁されます中葉。
  6. 接合部で互いにローブを分離し、製造業者のプロトコルに応じて最適な切削温度（OCT）化合物でそれらを埋め込みます。クライオスタット上の金属グリッドでの肝臓組織を含む10月をフリーズします。
  7. -18℃でクライオスタットを用いて5μmの厚さのサンプルのセクションをカットし、RT顕微鏡スライド上にマウントします。 -80℃での在庫を保管してください。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と以前に報告された手順16に従って、免疫蛍光染色のためのスライドを準備します。

5.ヒトアルブミンの分泌の検出とキメラ率の計算

  1. ヒト肝臓の再構成を測定するために、製造業者の指示に従って血清およびヒトアルブミンELISAキットを用いてヒトアルブミンELISAを行います。
  2. 全ヒト肝臓における発現レベルのリアルタイムPCR分析によりヒト肝キメラ率を計算します。相対元を決定しますヒト - マウスクロスアクチンに対するヒト特異的アクチンのPRESSIONレベル比（比1）、ヒト - マウスクロスアクチンに対するマウス特異的アクチンの比率（比率2）。キメラ率は、比1 /ように（比1 +比2）で算出されます。

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結果

ALB-トレック/ SCIDマウスの肝細胞は、アルブミンプロモーターの制御下で、ヒトDT受容体HB-EGF遺伝子を発現し、DT投与12以下の細胞毒性効果を発揮します。肝障害に対するDT処置の効果を評価するために、1.5μgの/キロのDT投与量は、8週齢のアルプ・トレック/ SCIDマウスに注射し、肝臓48時間後のDT投与の病理学的変化を組織学的に評価しました。 （いないDTで処理された）コントロールマウスと比較して、DT処置マウスは、増大した血清AST活性を有する輻輳の補正を示す無秩序な肝臓のアーキテクチャを示しました。また、DT-処置したマウスの肝細胞は暗い核（おそらくアポトーシス肝細胞）と一緒に、複数の、濃染好酸性細胞質封入体を持っていました。他のいくつかの肝細胞は、保存や、ほとんど門脈炎症と暗い核を有する空胞化細胞質（ 図1を示し登場します）。これらの知見は、アルプ・トレック/ SCIDマウスは、理想的な致死劇症肝不全モデルを表し、単一のDT注入12を用いて生成するこ...

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ディスカッション

最近の研究は、マウスの肝臓は、成人肝細胞および増殖性肝幹細胞17を含むヒト肝細胞で再増殖することができることを示しています。これらの再増殖した肝臓は薬物代謝試験および薬物の発見と開発18のための前臨床実験モデルとして使用されています。加えて、それらは、細胞成熟および分化19のためのインビボ環境を提供しています。本研究の主要な目的は、薬物の代謝活動を取得するため、ヒト未熟肝細胞の増殖、成熟、および分化を可能新規な肝疾患のマウスモデルを生成することでした。

脾臓内移植の過程は、広範囲に研究されています。ラットおよびマウスの脾臓に移植された細胞は、彼らの平均寿命を通して生き残ります。脾臓内移植プロトコルは、特定の研究課題を調査するのに非常に有用であることが証明されています。多くの研究室は、世界中のために改良されたマウスの生存と肝再生の肝細胞移植のための高度に再現可能で信頼性の高いモデルとしてこのプロトコルを利用することを試みてきました。移植された細胞の大部分は、彼らがポータル枝を閉塞することができ、肝臓に...

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開示事項

著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。

謝辞

マウスを提供してくださった東京都医学総合研究所の哺乳類遺伝学プロジェクトに感謝いたします。また、積水メディカル株式会社 ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Instituteの S. Aoyama 氏と Y. Adachi 氏、LC-MS/MS 分析にご協力いただいた Kozakai 氏と Y. Yamada 氏に感謝いたします。本研究の一部は、文部科学省科学省科学研究費補助金(18591421、20591531、23591872)の支援を受けて行われました。江蘇省の革新的で起業家精神にあふれたプロジェクトによるハイレベル人材の導入と江蘇省科学技術計画プロジェクト(BE2015669年)。科学技術振興機構(JST)の戦略的研究開発推進機構(S-innovation、62890004)への助成による。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒトアルブミンΣA6684マウス
CK19ダコM088801マウス
ヒト核ミリポアMAB1281
マウス ヒト CK8/18プロジェンGP11モルモット
CDCP1バイオレジェンド324006マウス
CD90BD559869マウス
CD66BD551479マウス
GOT/AST-PIII富士フイルム14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0.05% トリプシン-EDTA Gibco25300-054
ジフテリア毒素Σ D0564-1MG
ヒトアルブミン ELISA キットBethyl LaboratoriesE88-129
シリンジ (1 ml)テルモSS-01T
32G 1/2" 針TSKPRE-32013
O.C.T.コンパウンド (118 ml)サクラファインテック4583
MoFlo高速セルソーターベックマンターB25982
DRI-CHEM 7000フイルム14B2X10002000046
ジャパン コール富士

参考文献

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