方法論記事

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

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DOI：

10.3791/54194

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2016年6月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, University of British Columbia

この記事について

サマリー

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)で培養した骨髄細胞は、マクロファージと樹状細胞(DC)を含む不均一な培養を生成します。この方法は、GM-CSF培養中のマクロファージとDCを区別するために、MHCIIとHA(HA)結合を使用することを強調している。この培養物のマクロファージは、肺胞マクロファージと多くの類似点があります。

要約

マクロファージや樹状細胞（DC）は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしている組織やリンパ器官に見られる先天性免疫細胞です。しかし、それらは、それらを詳細に研究するために十分な数に分離することが困難であるため、 インビトロモデルが開発されている。骨髄由来マクロファージおよび樹状細胞のインビトロ培養物の免疫学的研究のための十分に確立され、有益な方法です。ここで、培養およびサイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を用いて、一次マウス骨髄細胞の単一培養物からのDCおよびマクロファージの両方を同定するための方法が記載されています。このプロトコルは、最初のルッツらによって開発された確立された手順に基づいています。骨髄由来DCの1999インチ文化は不均一であり、かつMHCIIおよび蛍光標識ヒアルロン酸（FL-HA）は、未成熟および成熟DCからマクロファージを区別するために使用されます。プロこれらのGM-CSF由来のマクロファージ密接に表現型および機能の両方に肺胞マクロファージに似ているインビトロ由来のマクロファージの便利な供給源を見よ。

概要

いくつかのin vitroでの培養方法は、骨髄由来マクロファージ（BMDMs）と1つの成長因子の組み合わせを使用して、骨髄由来DC（BMDCを）を生成することが記載されています。 BMDMsは、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、またはGM-CSF 1,2のいずれかを使用して骨髄細胞を培養することによって生成することができます。 BMDCのために、骨髄文化へのFLT3リガンドの添加は、培養3,4で9日後（ 高およびCD11c 見よ 、それぞれB220 + CD11cの高い / MHCII）非接着古典と形質DCに上昇を与えます。対照的に、GM-CSFと培養7〜10日後に生成された、非接着細胞単独5,6-、GM-CSFおよびIL-4 7、またはGM-CSFおよびFLT3リガンド8,9より密接炎症性DCを似たBMDCを生成（ 高いのCD11c、MHCII 高のCD11b +）10。これらのインビトロ培養は、マクロファージを生成するために使用されている間に各培養物は純粋な集団を生じさせる場合DCは、それは不明です。例えば、GM-CSF培養中の接着細胞は、それらが均質であり、任意の観察された変動がある推定でマクロファージ5、DCを6,11-13として使用されるのと同じ培養物からの非付着細胞であることが記載されているものの開発14,15の異なる段階に起因します。さらに、研究は、 インビボ 16,17 における肺胞マクロファージの発達のために必須の増殖因子であるGM-CSFを発見し、そして肺胞マクロファージ様16,17,18を生成するためにインビトロで使用することができます。

付着以外は、GM-CSF処理した骨髄培養物からのマクロファージ及び樹状細胞を生成するための手順は、GM-CSFの骨髄培養物内に存在し得る不均質性を示唆している非常に類似しています。これは、実際に2つの論文は、BMDC培養物の非付着画分におけるBMDMsの存在を報告としてケースのように思われます。 1論文で、彼らはidentifi最も密接に肺胞マクロファージに似ていたし、T細胞19を活性化する能力が低下していた遺伝子発現特性を発現したCD11c +、のCD11b +、MHCII 半ば 、MERTK +、およびCD115 +、などの細胞の集団を編。未熟（たCD11c +、MHCII 半ば 、 低 FL-HA）および成熟異なっていた肺胞マクロファージ様人口を識別するために、MHCIIとFL-HAを使用する第二の紙（たCD11c +、 ミッド/ロー MHCII、FL-HA 高 ）樹状細胞（のCD11cの+、 高 MHCII）、両方の表現型および機能的に18。これらの論文は、GM-CSF BMDC培養が不均一であることを示してBMDC培養物からのデータを解釈する際には注意すべきであることを示すマクロファージおよびDC集団の両方を含む両方。

このプロトコルは、骨髄、GM-CSFでの培養骨髄細胞を分離し、肺胞マクロファージ様を識別する方法について説明します結合およびMHCII発現FL-HAを使用して、フローサイトメトリーによる骨髄培養における未成熟および成熟DCから人口。 。この手順は、6ルッツらの確立された手順に基づいており、5生成することができるされている- 10ミリリットルの培養7日目に10×10 6非接着細胞を。文化は日から7〜10に使用可能であり、7日目これが成長し、大量にインビトロ肺胞のようなマクロファージを単離するための簡単な方法を提供するでマクロファージ、未成熟および成熟DC、だけでなく、いくつかの前駆細胞の不均一な集団を生成します。

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プロトコル

マウスは、ブリティッシュコロンビア州の動物管理委員会の大学によって承認された手順によって、倫理的な動物実験のためのカナダ・カウンシル動物ケアに関するガイドラインに従って安楽死させました。

1.マウスの大腿骨および脛骨から単一細胞骨髄サスペンションを取得

  1. キャビネットの空気をパージし、空気の流れの安定化を可能にし、クリーン/ 70％エタノールでBSC表面を噴霧する手順を開始する前に生物学的安全キャビネットにスイッチ（BSC）15分。プロトコルの全体のために可能な限り無菌すべてを保管してください。非無菌条件下で骨を切断しないでください。
  2. 70％エタノールに浸漬することによって、解剖ツールを準備し、5％ウシ胎児血清（HBSS-FCS）、滅菌ペトリ皿（100ミリメートル×15 mm）で、1とハンクス液（解剖はさみ、鉗子の2ペアの1ペア） mlのシリンジ、26½ゲージ針、円錐形のコレクションチューブ（15ミリリットルまたは50ミリリットル）、およびBSCにおける紙タオル。
  3. 使用してマウスを安楽死させます機関の動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコル。 、BSCに持参1または2ペーパータオルの上に置き、70％エタノールでマウスをスプレー。
  4. 蓋に2ミリリットル - BSCでは、無菌的にアリコートベースにHBSS-FCSの10ミリリットルと1を滅菌ペトリ皿を開きます。
  5. 上を向いて背中とのお腹の上でマウスを置き、非利き手の指で胸部セクションの周りの皮膚を持ち上げます。皮膚が持ち上げられる切開を作るためにハサミを使用してください。
  6. 胃での切開会うの両端まで引っ張り続け、胃に戻ってから、マウスの周りの皮膚を引き離す慎重にカットの両端は、それぞれの手で一方の端にしがみつくと。
  7. 上を向いて胃にマウスを裏返して、片手で足が露出するまで肌を引き戻す維持、ダウンレグに向けて皮膚の下半分を引っ張ります。
  8. マウスアップの足を持ち、足関節の上にアキレス腱を切断し、靭帯は、はさみで脛骨の下端に足に筋肉を接続します。これは、足の骨から足を緩めます。
  9. 足で足を持ち上げながら、下肢から大腿部の筋肉を切断するために、大腿骨の下端に、すべての膝関節の周りにハサミで筋肉や靭帯を切りました。静かに腓骨及び大腿骨表面から緩め筋肉を引っ張るために鉗子を使用してください。大量出血を避けるために、大腿動脈を切断しないように注意してください。
  10. 1手が足につかまっでは、股関節における大腿骨の上端部で記者ダウンオープンはさみは、脚を回転させ、自由への最終的なカットを作るためにハサミを使用しながら股関節から大腿骨を分離するために慎重に引き抜い本体から脚。
  11. これ以降、唯一の滅菌鉗子で組織を保持します。一方の端部での足にしがみつくと、他の上で足をやってのけます。
    注：接続靭帯がステップで切断されているように、これは、多くの力を必要とすべきではありません1.9。また、ちょうど骨が融合されている足首の上に脛骨を切りました。
  12. 1鉗子のセットと別と脛骨と腓骨の近位端部と大腿骨の遠位端部により脚を持ち、慎重に大腿骨と膝蓋骨からそれらを分離するために、膝関節の反対方向に脛骨と腓骨を曲げます。
  13. まだ下腿骨に付着した残りの靭帯や筋肉をプルダウンするために鉗子を使用してください。骨髄細胞のためにフラッシュするには小さすぎるようにここでは、鉗子で結合組織と一緒に腓骨を削除します。反転ペトリ皿の蓋の上に洗浄脛骨を置きます。
  14. 1鉗子のセットと別と膝蓋骨と大腿骨の下端を持ち、除去のための共同の反対方向に膝蓋骨と周囲の組織を曲げます。その後、大腿骨から結合組織を残りきれい。鉗子でそれらを引き離し、反転シャーレのふたの上に置きます。膝蓋骨を捨てます。
  15. 1.7を繰り返します- 他の脚と1.13必要に応じて。必要に応じて輸送のための1ミリリットルの無菌HBSS-FCSを含む1.6ミリリットルのマイクロチューブに骨を移します。
  16. HBSS-の10ミリリットルを含むペトリ皿の底に骨を移すその後、まだ脛骨および大腿骨に取り付けられた任意の残留組織をきれいにするために鉗子を使用し、HBSS-FCSの2ミリリットル - 1で、反転したペトリ皿の蓋の上に骨を置きますFCS。また、骨をきれいにし、70％エタノールに浸した組織を用いて、添付の筋肉組織を取り除きます。
  17. ハサミで半分に骨のそれぞれをカット。皿の中の骨の滞在を確実にするために切断しながら、部分的に無菌の蓋付きペトリ皿を遮蔽します。あるいは、次のステップでフラッシングを可能にするために、各骨の端部を切断します。
  18. 1mlシリンジへの26½G針を取り付け、ペトリ皿から1ミリリットルHBSS-FCSを描きます。骨片の端部に針の先端を挿入し、骨髄細胞（骨内部の柔らかい赤組織）を洗い流します。頭の中に針を挿入骨と開放端の、すべての赤色骨髄が除去されるまで。色は白と骨を観察します。
  19. 単一細胞懸濁液を形成するために、数回の注射器を介して骨髄の目に見える塊を渡します。
  20. フラッシュ骨を捨てます。よく細胞懸濁液を混合し、コレクションチューブに転送するために10ミリリットルのピペットを使用してください。皿に残留する細胞を収集するためにHBSS-FCSの5ミリリットルで一回ペトリ皿をすすぎます。細胞を氷上に置きます。
    注：2のために保存した場合の骨髄細胞懸濁液が依然として生存可能である- 4℃で3時間。

骨髄細胞の2めっきおよび培養（のBMC）

  1. 以下の試薬および消耗品を準備します。
    1. 2 mMトリスpH7.2の最終溶液を0.84％の塩化アンモニウムを行うことで、赤血球（RBC）溶解緩衝液を調製し、次いで0.2ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌します。
    2. 10％FCS、20mMのHEPES、1×非必須アミノ酸、55＃を追加することによって、BMC媒体を準備181; RPMI培地1640 M 2-メルカプトエタノール、50 U / mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、および2mM L-グルタミン。
    3. 市販の組換えGM-CSFを入手するか、GM-CSF遺伝子20をトランスフェクトしAG8.653骨髄腫細胞からの上清を含むGM-CSFを使用します。 ELISAによる上清中のGM-CSFの濃度を決定し、BMCメディアに20 ng / mlでの同等のものを追加します。
  2. 5分間、314×gで骨髄細胞をスピンダウン。ペレットは、赤血球による赤です。 BSCでは、その後、RBC溶解緩衝液10mlを追加し、タップしてペレットを緩め、真空吸引に取り付けられた滅菌ガラスパスツールピペットを用いて上清を吸引除去します。渦は、細胞を再懸濁し、5分間室温でRBC溶解緩衝液中でインキュベートします。
  3. HBSS-FCSの10ミリリットルを追加し、その後5分間、314×gで細胞をスピンし、上清を吸引除去します。白い色として細胞ペレットを観察します。 BMCメディアの所望の体積で細胞を再懸濁します。
  4. RESUを数えます0.4％トリパンブルーで死細胞を染色した後、血球計数器を使用してspended細胞。
    注：、片足（シングル脛骨および大腿骨）からの骨髄を使用する場合は、BMCメディアの5ミリリットル中に再懸濁し、10μlの細胞懸濁液を取り、青色の0.4％トリパン70μlのとそれを希釈し、よく混ぜおよび10μlのを転送血球計数器室に1/8細胞希釈。 4つの象限中の生存細胞の数：4象限のカウントの平均は、希釈係数×10 4 =ミリリットル当たりの細胞数をxは。 RBC溶解後に4×10 7細胞- 1の脚から大腿骨と脛骨は一般的に約2が得られます。
  5. 培養の終了時に実験に必要とされる総細胞数に基づいて、下流の実験に必要な骨髄培養10mlの料理の数を推定します。
    注： - 10×10 7日目6細胞の各ディッシュは、最初の播種及び収率で2×10 6の骨髄細胞5が必要です。
    1. アリ、5分間、314×gでスピンダウンし、新しいチューブにメッキのための細胞の総数をQUOT上清を吸引し、BMC培地中4×10 6細胞/ mlで細胞を再懸濁。
  6. GM-CSF（組換えまたは上清を含むGM-CSFから）200ngの含有BMC培地の9.5ミリリットルを持つ新しい滅菌100ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿を準備します。 10 mlの2×10 5細胞/ mlの最終濃度のために、ペトリ皿の中央に4×10 6細胞/ mlの骨髄細胞の500μLを加えます。
    注 ：滅菌ペトリ皿ではない組織培養皿を使用することが重要です。セルを追加するときは、細胞が中央に集中し、播種後、メディアの変更中皿に乱れを最小限に残っていることを確認します。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。これは、培養中0日です。
  7. 3日目に、細胞の各ディッシュにGM-CSFの200 ngのを含有する新鮮なBMC培地の10ミリリットルを追加します。外乱Oを最小限に抑えるように注意してください懸濁液中の細胞を濃縮し、F。細胞培養物の総容量は、現在20 mlです。
  8. 100Xの倍率で光学顕微鏡下で細胞を観察します。多数の非接着細胞（丸）といくつかの接着細胞（フラット）を確認します。花の3つまたは​​4つの似た花弁の群における細胞は、増殖を示し、見ることができます。
  9. 6日目に半分の培地交換を行います。慎重に、滅菌50mlコニカルチューブにメディアの10ミリリットルを削除し、5分間314×gでスピンダウンし、吸引して上清を捨てます。
  10. GM-CSFの20 ngの/ mlを含有する新鮮なBMC培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁し、穏やかにボルテックスし、20mLの総容積の元の細胞培養皿に加えます。顕微鏡下で細胞を観察します。
    注：7日目文化が付着平らな細胞と丸い非付着細胞の密な雲と密集度が70％以上である必要があります。

3.収集し、フローサイトメトリーのためにBMDCとBMDMsの準備

  1. 4℃ですべてのバッファを保管してください。
  2. 培養上清の10ミリリットルは、約30度、垂直皿を傾け、残りの10ミリリットルをピペットで皿を洗った後、50ミリリットルコニカルコレクションチューブに細胞を採取するために10日目に7日目から細胞を採取、最初の転送皿の上から文化の。この洗浄を5回、三分の一の皿を回転するたびに繰り返します。
  3. 同じコレクションチューブに細胞の残りの10ミリリットルを移し、プレートと付着細胞を廃棄します。
    注：洗浄は非接着および緩く接着細胞を除去します。フラット接着細胞を洗浄に耐性です。一般的に、5〜 -ルッツらが、10日目6細胞5×10 - 6、非接着細胞を7日目に一枚の板から期待されている10×10と2。 10日目で報告された10×10 6個の細胞を付着細胞を正常に取得されません。しかしながら、これらの細胞は、非接着性細胞と比較する必要がある場合次のように、それらを除去することができます。接着細胞を除去し、別のチューブに収集するために、非接着細胞を除去した後、皿に1×PBS、pH7.4中0.7 mMのEDTAの5ミリリットルを加え37℃で5分間インキュベートし、上下にピペット。
  4. 5分間、314×gで採取した細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。 4℃で5ミリリットルの滅菌BMC培地で再懸濁は、渦は穏やかに混合し、トリパンブルーと血球計数器を使用してカウントします。
    注：各料理は5得られます- 7日目培養物から10×10 6非接着細胞を。今から、4℃で、すべての手順を実行します。
  5. フローサイトメトリー分析5mlのポリスチレン丸底チューブに2×10 5細胞を各試料の移送のために、それぞれに4°C（1× ​​リン酸緩衝生理食塩水、2mMのEDTAおよび2％ウシ血清アルブミン）でFACS緩衝液300μLを加えますサンプル。
  6. 5分間、314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。見える白、不透明なペレットを守ってチューブの底。
  7. 非標識のFc受容体抗体の100μl中に再懸濁細胞（骨髄腫細胞株を作製する2.4G2から使用1/10上清）をFc受容体結合をブロックし、4℃で20分間インキュベートします。そして、静かにボルテックス、各サンプルに300μlのFACS緩衝液を追加し、5分間314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。
  8. 0.2μgの/ mlでのCD11c-PeCy7100μl中に細胞を再懸濁、0.25μgの/ mlの群Gr1、パシフィックブルー、0.05μgの/ mlのMHC​​II-APC、およびFL-HAは、約2μg/ mlのは、マクロファージや樹状細胞を識別します。
    注：以前に21を説明したようにFL-HAは、フルオレセイン及び雄鶏櫛ヒアルロン酸ナトリウム塩を使用して社内で調製しました。
  9. 細胞表面への結合を可能にするために4℃で20分間インキュベートします。その後、4℃で5分間314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引、優しく渦、各サンプルに300μlのFACS緩衝液を追加します。注：バイオ場合蛍光ストレプトアビジンで9 - tinylated抗体が3.8を繰り返し、3.8で使用されています。
  10. 混合し、5分間、314×gで細胞をスピンダウンするFACS緩衝液の別の300μlを、穏やかにボルテックスで細胞を洗浄。上清を吸引し、0.1を含むFACS緩衝液200μl中に細胞を再懸濁 - 非生存細胞を標識するためにヨウ化プロピジウムまたはDAPIの1mlあたり0.2μgのを。細胞は、今、フローサイトメトリー分析の22の準備ができています。
    注：集団の詳細についての結果と図3を参照して 、どのように細胞をゲートしました。

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結果

この方法の主要なステップを要約するフローチャートを図1に示されている。培養の異なる時点での骨髄培養物の密度および形態を、図2に示されている。1日目に、細胞は、小さなスパースしかし3日目によるものですより多くの細胞が存在し、いくつかは大きく、数が付着し始めています。 6日目までに一定の接着性および非接着性画分（ 図2A）があります。収穫前7日目文化を示しているだけでなく、分離接着性および非接着細胞画分10日目図2Bに存在したCD11c +細胞のより高い割合で10 -文化は7日目から収穫することができます。接着性画分は、非接着性画分を除去する光の洗浄後に残った細胞からなります。非接着画分を大幅にデジタル拡大イムでより明確に見ることができる樹状形態、を有する細胞について濃縮されます図2Bの挿入図で年齢。非接着性画分を除去された後（7日目または10日目）上述のように、細胞は、重要な細胞表面マ...

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ディスカッション

本稿では、我々はルッツら 6から採用された単一のマウス骨髄培養からGM-CSF由来のマクロファージや樹状細胞を生成する方法を提供します。この培養中の未成熟DCおよびマクロファージを区別する結合MHCII発現およびFL-HAは、以前は困難であった、（ 図3Cを参照します）。これは、一緒にHelft ら 19による別のレポートで、以前はDCのみであると考えられていたGM-CSF誘導されたBMDC培養内の不均一性を示しています。 Helft ら 19はまだも大幅なマクロファージ集団を発見したBMDCを生成するために、全く異なる培養条件を使用していました。 GM-CSF誘導されたマクロファージは肺胞マクロファージに似ており、FLT3リガンド補足BMDC培養は、古典的と形質のDC 3,4を生成するのに対し、GM-CSF誘導DCは、炎症性樹状細胞に似ています。種々のDCおよびマクロファージの集団はまた、 インビボ未において

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開示事項

著者には金銭的な利益相反はありません。

謝辞

この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）（グラントMOP-119503）とカナダの自然科学・工学評議会（NSERC）のカナダの研究所によって資金を供給されました。 NSERCもYDする夏のstudentshipsをサポートし、AA YDは、4年間のフェローシップ賞とブリティッシュコロンビア大学（UBC）によってサポートされ、AAは、大学院生の修士賞（CGS-M）とCIHRでサポートされています。我々は、 図2の画像を生成するために使用される顕微鏡の支援のためにカルバンRoskelleyに感謝します。我々はまた、UBC動物とフローサイトメトリー施設からの支援を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フローサイトメーターBD LSR-II
全自動倒立顕微鏡 ライカ DMI4000 B
遠心分離機 サーモフィッシャーST-40R
バイオセーフティキャビネットNuaireNU-425-600
シリンジ1 mlBD309659 26
1/2ゲージニードルBD305111
50 mlコニカルチューブ コーニング357070*ファルコンブランド
エッペンドルフチューブ(1.5 ml)コーニングMCT-150-C
5 mlポリスチレン丸底チューブコーニング352052
解剖ツールファインサイエンスツール *色々 *解剖ハサミ、デュモン鉗子、標準鉗子 
血球計算盤 Reichert1490
滅菌 100 mm x 15 mm ペトリ皿コーニング351029*ファルコン ブランド
2-メルカプトエタノールサーモ フィッシャー21985-023
塩化アンモニウムBDHBDH0208-500G
ウシ血清アルブミンフィッシャー バイオ試薬BP1600-1
ブレフェルジン AシグマB7651-5MG
EDTASigmaE5134-1KGエチレンジアミン四酢酸
ウシ胎児血清サーモフィッシャー16000-044
ハンクス バランス塩溶液サーモフィッシャー14175-095 
HEPESサーモフィッシャー15630-0804-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
L-グルタミンSigmaG8540-100G
LPS 超高純度Invivogentlrl-3pelps
MEM 非必須アミノ酸溶液 サーモフィッシャー11140-050
ペニシリン/ストレプトマイシン100xサーモフィッシャー15140-122
リン酸カリウム一塩基性BDHBDH0268-500G
塩化カリウムBDHBDH9258-500G
組換えGM-CSFペプロテック315-03-A
オンドリコームヒアルロン酸ナトリウム SigmaH5388-1G*蛍光素化ヒアルロン酸
RPMI-1640の製造に使用 サーモフィッシャー21870-076ピルビン酸ナトリウムなしグルタミンなし。37 °Cを使用してから使用できます。
塩化ナトリウムフィッシャー 5271-10  
リン酸ナトリウム二塩基性シグマ50876-1Kg
ビン酸ナトリウムシグマP5290-100G
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンフィッシャーバイオ試薬BP152-5
パンブルーシグマT8154
抗Fc受容体(非標識)、組織培養上清N/AN/Aクローン:2.4G2
抗CD11c PeCy7eBioscience25-0114-82クローン:N418
抗Gr-1 eFluor450eBioscience48-5931-82クローン:RB6-8C5
抗MHCII APCeBioscience17-5321-82クローン:M5/114.15.2
ビオチン化抗MerTKAbcamBAF591ヤギポリクローナルIgG
ストレプトアビジンPEeBioscience12-4317-87
ヨウ化プロピジウムΣP4170-25MG
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)ΣD9542-5MG
ピルトリ

参考文献

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