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Summary

細菌性病原体とそれらのホスト間の相互作用を調査することは、生物学的研究の重要な領域です。ここでは、BLAM基板を用いたsiRNAの遺伝子サイレンシング中にQ熱リケッチアによってエフェクター転座を測定するために必要な技術を記載しています。

Abstract

Q熱リケッチア 、Q熱の原因物質は、複製ニッチを確立するために、タイプIVドット/ ICM分泌系に依存して細胞内病原体です。エフェクターのコホートは、ホストプロセスを操作し、複製のためのユニークなリソソーム由来の液胞の確立を可能にするために宿主細胞にこのシステム通って移動しています。特定の遺伝子のsiRNAを用いたサイレンシングし、βラクタマーゼ活性に依存するFRETベースの基板を用いて、エフェクター転位の測定：ここで提示された方法は、2つのよく確立された技術の組合せを含みます。これら二つのアプローチを適用すると、我々は、細菌の分泌システム機能およびエフェクター転における宿主因子の役割を理解し始めることができます。本研究では、Rab5AとRab7A、両方のエンドサイトーシス人身売買経路の重要な調節因子の役割を調べました。我々は、エフェクターの減少タンパク質をもたらすいずれかの発現をサイレンシングすることを実証translocation個の効率。これらの方法は、容易にまた分泌系を利用する他の細胞内および細胞外の病原体を検査するように変更することができます。このようにして、細菌のエフェクター転座に関与する宿主因子の全体像を明らかにすることができます。

Introduction

Q熱リケッチアは人獣共通ヒト感染のQ熱の原因となるユニークな細胞内病原体です。この疾患は、多くの場合、暴露¹の後に心内膜炎の年として現れる生命を脅かす慢性感染症に無症候性抗体陽転から延びる臨床症状の広いスペクトルに関連しています。ヒトへの感染は、反芻動物感染症、特に、乳牛、羊やヤギのための主要なリザーバと、主に汚染されたエアロゾルの吸入を介して行われます。これらの動物におけるコクシエラ感染は通常、無症候性であるが、感染は流産を引き起こす可能性と出産流体と胎盤内のかなりの細菌負荷は、ローカル環境^1を汚染することができます。このような汚染が公衆衛生と農業産業の両方に持つことができる巨大な負担の例は、最近オランダ²で発生したQ熱の流行で観察されました。 2007との間2010年には、Q熱の4,000以上のヒト症例が診断され、この流行はヤギ農場³の重大な汚染に連結されていました。さらに、 コクシエラは厳しい罹患率と死亡率^4を引き起こす細菌や必要な低感染量の環境安定性に米国疾病対策予防センター、によって分類され、潜在的な生物兵器です。

コクシエラは、2つの段階に存在する：天然源から単離されたフェーズIの生物は、非常に病原性であり、フェーズIIの生物は非常に生体内で減衰されます。例えば、 コクシエラバーネッティナインマイルフェーズIの生物のいくつかのin vitroで継代した後、フェーズII細菌は切り捨てリポポリサッカライド^（LPS）5で得られた不可逆的な染色体欠失を含有する製造されました。この株、C.バーネッティ NMIIは、組織培養モデルにおけるI相に表現型が類似しており、安全なモードを提供します研究室⁵にコクシエラの病因を研究する研究者のためのリットル。近年では、いくつかのブレークスルーは急速にコクシエラの遺伝学の分野を進めてきました。最も顕著なのは、純粋メディア（酸性クエン酸、システイン媒体- ACCM-2）の開発は、液体と^6,7固形培地上の両方でコクシエラの無細胞成長を可能にしました。これは、誘導性遺伝子発現システム、シャトルベクターとランダムトランスポゾンシステムを^8月11日を含むコクシエラために利用可能な遺伝子ツールの直接的な改善をもたらしました。最近では、標的遺伝子の不活性化のための2つの方法は、特定の病原性遺伝子の候補^12を検査するための道を切り開いて、開発されてきました。

肺胞マクロファージによる内在続いて、 コクシエラは膜結合区画内に高い数字に複製は液胞（CCV）を含むCoxiella-と呼ばれます。 CCVは、エンドサイトーシス人身売買番目のホストが必要ですラフ初期および後期エンドソームはリソソーム由来の細胞小器官¹³内に成熟するまで。このプロセスを通じて、CCVは、どちらかが一過現れるかを含め、液胞に関連付けられているが、Rab5の、Rab7、CD63およびLAMP-1 ^13-15、これらに限定されないままと宿主因子を取得します。宿主細胞内でコクシエラのレプリケーションが完全に機能するドット/ ICMタイプIVB分泌系^{（T4SS）8,16,17}に完全に依存しています。この分泌系はancestrally共役システムに関する多タンパク質構造であり、細菌タンパク質を送達するために、両方の細菌および液胞の膜にまたがる、宿主細胞質¹⁸に、エフェクターと呼びます。 コクシエラ T4SSは、機能的には十分に特徴付けタイプレジオネラニューモ ^19,20のIVBドット/ ICM分泌系に非常に類似しています。 コクシエラが酸性リソソーム由来に達するまで興味深いことに、T4SSとその後のエフェクター転座の活性化は発生しませんオルガネラ、約8時間の感染後^17,21。現在までに、130以上のドット/ ICMのエフェクターは^{9,17,22-24を}同定されています。これらのエフェクターの多くは、おそらく宿主細胞内コクシエラの複製中に重要な役割を果たしています。しかし、わずか数エフェクターは機能的に^25-29を特徴づけられています。

本研究では、宿主細胞の細胞質（ 図1）内のβラクタマーゼ活性を介して（以下BLAM基板と呼ぶ）CCF2-AM FRET基質の切断に依存する蛍光に基づく転位アッセイを利用します。目的の遺伝子は、構成的発現を提供するレポータープラスミドのTEM-1βラクタマーゼ（BLAM）に融合されます。 BLAM基質はFRET対を形成する2つのフルオロフォア（クマリンおよびフルオレセイン）で構成されています。フルオレセインおよびエフェクター転座の不在下で緑色の蛍光発光のFRETのクマリン結果の励起;しかし、Blaの場合M-エフェクター融合タンパク質が宿主細胞質に転位され、得られたβラクタマーゼ活性切断励起以下の青色蛍光発光を生成するFRETペアを分離BLAM基板のβラクタム環、。この転座アッセイはよくC.含むさまざまな細胞内および細胞外の細菌の範囲からエフェクタータンパク質を同定するためのアプローチとして実証されていますバーネッティ 、L.ニューモ 、L. longbeachae、 トラコーマクラミジア 、腸管病原性E.大腸菌 、 サルモネラ菌およびブルセラ ^17,30-35。

コクシエラエフェクター転上の特定の宿主因子の役割を決定するために、我々は、特定の低分子干渉RNA（siRNA）で、RNA干渉として知られている遺伝子サイレンシングのための十分に確立された方法を利用します。もともと線虫（Caenorhabditis elegans）で同定され、RNA干渉は、先天性defeに使用保存された内因性細胞プロセスであり、ウイルスだけでなく、遺伝子調節^36,37に対してNSE。配列特異的なsiRNAの結合後、mRNAの分解は、特異的な遺伝子サイレンシングまたはノックダウン³⁸で得られた（RNA誘導サイレンシング複合体）RISCを介して行われます。この研究では、siRNAは、エンドサイトーシス経路の重要な調節因子である2つのホストタンパク質、Rab5AとRab7Aを標的化するために使用しました。エフェクター転上Rab5AとRab7Aサイレンシングの影響は、Cを使用して確認しましたバーネッティ pBlaM-CBU0077。それは以前にコクシエラ ¹⁷のドット/ ICMの分泌系によって転位することが示されたようCBU0077を選択しました。

siRNAの遺伝子サイレンシング、ここでは説明fluorescencebased転座アッセイの両方を利用して、我々はコクシエラによってエフェクタータンパク質の転位に宿主因子の役割を確立するために始めています。このアプローチは、類似secretioを有し、両方の細胞内および細胞外の細菌の広い範囲に適用することができますエフェクタータンパク質のトランスロケーションを担当するN個のシステム。

Protocol

注： コクシエラバーネッティ RSA439 NMIIの成長または操作を含むすべての手順は、物理的封じ込めレベル2研究室で、地元のガイドラインに準拠した生物学的安全キャビネット内で実行する必要があります。以下に記載の逆トランスフェクションおよびトランスロケーションアッセイワークフローの概略図が図2に示されています。

C.の調製バーネッティ文化は、β-ラクタマーゼする（pBlaM-CBU0077を）CBU0077融合を表現（1日目）

1. 1X ACCM-2 ^6を準備します。
   1. 表1に列挙された成分を組み合わせる。6 M NaOHおよびフィルター滅菌し（オートクレーブしない）で4.75にpHを調整します。 ACCM-2は、4℃で保存された約3週間安定です。
2. C.を生成しますバーネッティ pBlaM-CBU0077株。
   1. CとしたHeLa 229細胞を感染大vacuolまでpBlaM-CBU0077通路を運ぶバーネッティ菌株ESは、細胞の大部分で観察されます。
      1. C.を育てます5％CO _{2、2.5％O 2}中、37℃で7日間通気キャップを有する75cm ²の組織培養フラスコ中の20 mlのACCM-2を含む3 / mlのクロラムフェニコールにpBlaM-CBU0077を運ぶバーネッティ株。
      2. 遠心分離C. RTで15分間、15,000×gでバーネッティ pBlaM-CBU0077文化。
      3. 再懸濁+ 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 3 / mlのクロラムフェニコール（維持培地）20mLのDMEMでペレット。ヒーラ229細胞の50％コンフルエント75cm ²のフラスコからメディアを取り出します。再懸 ​​濁したC.追加しますヒーラ229細胞にバーネッティ 。ヒーラ229細胞の感染が確立できるようにするために、5％CO ₂中で37℃で2日間インキュベートします。
      4. 175cm ²の組織培養フラスコに細胞を分割します。
         1. 75cm ²のフラスコから培地を除去し、10ミリリットル予め温めておいたPBSで2回単層を洗浄します。
         2. 1ミリリットルOを追加します。細胞を剥離するために5分- 3、37℃+ 5％CO ₂でのf 0.05％トリプシン-EDTA溶液と場所細胞。
         3. 維持培地10ml中に細胞を再懸濁します。維持培地の38ミリリットルを含む175cm ²のフラスコ中に再懸濁した細胞の2ミリリットルを追加します。
         4. 100％の密集度に到達し、大きな空胞が観察されるまで、5日-さらに3、5％CO ₂中37℃でインキュベートします。
   2. 175cm ²のフラスコから上清を収集し、感染したHeLa 229細胞をカバーし、感染した細胞を溶解するために15分間インキュベートする10ミリリットルのdH ₂ Oを追加します。
   3. RTで15分間、15,000×gで上清および溶解した細胞、ペレットを兼ね備えています。
   4. 10ミリリットルのdH ₂ O中に再懸濁ペレット繰り返し10ミリリットル注射器の少なくとも20倍に取り付けられた23G針を通して再懸濁を通過させることにより、さらに細胞を溶解します。細胞破片を除去するために5分間、500×gでペレット。
   <LI> C.を収集するために、RTで15分間、15,000×gで上清を除去し、ペレットバーネッティ 。
   5. 再懸 ​​濁C. DMEM + 10％FCS中バーネッティとは4に従って菌数を定量化します。 -80℃でDMEM + 10％FCS + 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）、アリコート50μlのストックマイクロチューブへとストアを使用して1×10 ⁹ゲノム/ mlに希釈します。
3. C.20μlの持つ3 / mlのクロラムフェニコールを含む予め温めておいACCM-2の10ミリリットルを接種します通気キャップ付き25cm ²の組織培養フラスコ内バーネッティ pBlaM-CBU0077株^17（1.2で生成されたストックから-80℃で保存）。 5％、37℃で7日間、CO _{2、2.5％O 2を}細菌培養物を成長させます。

2.リバースsiRNAのトランスフェクションおよびHeLa細胞の播種229細胞（DAY 4）

1. 初めての実験的なsiRNAを使用する場合の準備siRNAを次のように：
   1. 簡単に言えばsiRNAのペレットがチューブの底に収集されることを保証するために凍結乾燥したsiRNAを遠心分離します。
   2. 1×siRNAのバッファ（ 表2）の適切な量をピペッティングすることにより、20μMの最終ストック濃度にペレット化したsiRNAを再サスペンド。
   3. ソリューションをピペットで3ダウン – 10分 – 5倍管ごとに5を反転、RTで30分間、オービタルミキサーで混ぜると場所します。
   4. 簡単に言えば、siRNAは、チューブの底に収集されていることを確認するためのチューブを遠心します。
   5. 必要になるまで-20℃でマイクロチューブとストア内の50μlのアリコートにするsiRNAを分取。
   6. 必要なときに50μlのアリコートの株式（20μM）に1μMのsiRNAの使用濃度、1XのsiRNAバッファーのピペット950μLを生成するには。注：この1μMの作業濃度が繰り返さトランスフェクションのために複数回の凍結融解することができます。
2. 、DMEM + 10％FCSを配置、30分間37℃の水浴（または同等のもの）中0.05％トリプシンEDTAおよびPBSを使用前に加温します。
3. トランスフェクションの成分の調製
   注：以下のプロトコルは、黒壁や平らな、透明底の96ウェルマイクロプレートでのHeLa 229細胞のために最適化されています。トランスフェクション試薬は、siRNAの濃度は、細胞の播種密​​度の量の最適化は、異なる細胞株のために必要であり得ます。
   1. 各ウェルについては、0.1μlのトランスフェクション試薬、15.9μlの減少血清培地（トランスフェクションのために使用される最小必須培地は、 材料の表を参照）および1μMのsiRNA（40 nMのsiRNAの最終濃度とした）の4μLを使用します。 OTP、PLK1、Rab5AとRab7A用に別のマイクロチューブを使用してください。三重で各アッセイ条件を測定します。 96ウェルプレートのレイアウトの例が図3に示されています。
      注意：OTPおよびPLK1：このプロトコルは、2つのコントロールの使用が組み込まれています。 OTPは、オフターゲット効果を減少させるために最適化されているので、OTPは負、非標的対照として使用される4プールのsiRNAからなります。スクランブルsiRNAはまた、ネガティブコントロールとして使用することができます。プロアポトーシス経路を誘導することにより細胞株の数の大規模な細胞死におけるPLK1発現結果の損失、したがって、PLK1 siRNAは、細胞死がトランスフェクション効率と相関トランスフェクションのための陽性対照として使用します。
      1. 各実験のsiRNAトランスフェクションのために、個々のマイクロチューブに0.4μlのトランスフェクション試薬および63.6μlの減少血清培地を兼ね備えています。渦すべてのマイクロチューブ、室温で5分間複雑にコンポーネントを可能にします。
      2. トランスフェクション複合体を含む対応するマイクロチューブに各実験のsiRNAの16μlを追加します。渦と室温で20分間インキュベートします。注：トランスフェクション効率が低下するように、30分を超えないことが重要です。
4. 20分株式会社の間にubation（2.3.1.2）は、トランスフェクション試薬+減少血清培地+ siRNAの20μlを添加無菌黒、平らな透明底96ウェルトレイの適切なウェルに混ぜます。
5. すぐに20分のインキュベーション期間が完了し、シード/ウェル229細胞を3.92×10 ³細胞の密度でHeLa細胞からです。
   1. 収穫したHeLa予め温めておいたDMEM中でコンフルエントまたはサブコンフルエント75cm ²の組織培養フラスコから229の細胞+ 10％FCS、標準的な方法に従って、4.9×10 ⁴細胞/ mlの最終密度に細胞を再懸濁します。トランスフェクション効率が損なわれないようにするために、20分のインキュベーション期間（2.3.1.2）の間に細胞を準備します。
      1. 予め温めておいた10mlのPBSで二回のHeLa 229細胞の単層を洗浄します。
      2. 5分で細胞を剥離するために- 3は、37℃+ 5％CO ₂で、0.05％トリプシン-EDTA溶液と場所のHeLa 229細胞の1ミリリットルを追加します。
      3. 予め温めておいたDMEM + 10％FCの9ミリリットルに細胞を回収S.は、血球計数器を用いて細胞を計数し、DMEM + 10％FCSを用いて4.9×10 ⁴細胞/ mlの最終密度に細胞を調製します。
   2. トランスフェクション試薬+減少血清培地+のsiRNAミックスを含む各ウェルに4.9×10 ⁴細胞/ mlの密度でのHeLa 229細胞のピペット80μlの。これは、/ウェルの3.92×10 ³個の細胞の細胞密度に相当します。
      注：バックグラウンド減算はBLAM基板に必要とされます。
      1. 「ブランク」ウェル（ 図3）への細胞またはsiRNAを追加しないでください。その代わりに、三重に設定し、これらのウェルにDMEM + 10％FCSの80μlを添加します。
   3. 37℃+ 5％CO ₂で24時間インキュベートします。

3.メディアの変更（5日目）

1. 24時間後、真空源に接続されているマルチチャネルアダプタを使用してメディアを削除するか、または手動マルチチャンネルピペットで、新鮮なprewarmの100μlで置き換えますエドDMEM + 10％FCS。
2. 37℃+ 5％CO ₂でさらに48時間インキュベートします。
3. この時点で、視覚的に標準的な光学顕微鏡を用いて細胞の生存率を確認してください。リバーストランスフェクションが成功した場合、有意な細胞死は、OTPのsiRNAに比べPLK1のsiRNAを含むウェルにおいて観察されます。

定量PCRを用いて定量化コクシエラバーネッティ pBlaM-CBU0077株の4（7日目）

1. 10 mlのC. CO _{2、2.5％O 2（1.3）、}遠心分離、5％、37℃でACCM-2の成長の7日後RTで15分間、15,000×gでバーネッティ pBlaM-CBU0077文化。
2. 予め温めておいたDMEM + 10％FCSの10ミリリットル中に細菌ペレットを再懸濁します。 1：10と1を準備しますのdH ₂ Oを用いて培養の100希釈液（サンプル）
3. 定量PCRに必要なコンポーネントを設定します。
   注：gDNAを抽出は、予め行われ、-20°C UNTで保存することができますイルが必要です。
   1. 標準の調製。
      1. 製造業者の説明書に従って、gDNAを抽出キットを用いて7日間、5％CO _{2、2.5％O 2}中で37℃でACCM-2で増殖させコクシエラバーネッティ RSA439 NMII野生型株からのgDNAを抽出します。
      2. 260 nmでの吸光度でナノドロップ（または同等）を使用してのgDNA濃度（グラム/μl）を測定します。
      3. 以下、次の式を使用して、1μl当たりのゲノムコピー数を計算し、ゲノム/ mlの数に変換します。
         
      4. dH ₂ Oを使用して、新しいマイクロチューブに（100μlの最終体積で）10 ⁹ / mlにゲノム/ mlの数を調整これを10分間煮沸し、必要になるまで-20℃で保存することができます。
      5. 感染の日に、10 ⁹ゲノムから10 ⁵ゲノム/ mlに10 ⁸ゲノム/ mlの10倍連続希釈物を生成しS / mlストック。
         1. 10 ⁸ゲノム/ mlに生成するのdH ₂ O90μlの中に10 ⁹ゲノム/ mlのピペットを10μl。ミックスする渦。 10 ⁷ゲノム/ mlのを生成するためのdH ₂ O90μlの中に10 ⁸ゲノム/ mlのピペットを10μl。 10 ⁵ゲノム/ mlになるまでボルテックスし、繰り返します。
   2. 定量PCR反応を設定します。任意のピペッティング誤差を考慮するために25ウェルのためのマスターミックスを作成します。各ウェルに対して、10μlの定量PCRマスターミックスを使用します。 ompAプライマーミックス2μlの（4.3.2.2）とのdH ₂ Oの3μlの
      注：のOmpAは、Cの外膜タンパク質でありますバーネッティ^'39、以前⁴⁰に記載のように高度に保存された領域内に82塩基対部分は、プローブとして使用するために選択しました。
      1. 各標準（ _の dH ₂ O、10 ^{5、10 6、10 7、10 8、10 9}ゲノム/ mlに）設定し、サンプル（1：10と1：100希釈）を、96ウェルPCRは、それぞれ、重複または三重に）（非スカート板を離れて引き裂きます。適切なウェルにサンプルまたは標準の5μlを添加します。
      2. ompAフォワードプライマー（5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 '）の両方を希釈のdH ₂ Oを、使用し、プライマー（5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3を逆OMPA」4μMの最終濃度になるように）と同じマイクロチューブにまとめます。
         注： のompAプライマーミックスを予め用意し、必要になるまで-20℃で保存することができます。
      3. 250μlの定量PCRマスターミックス、50μlののompAプライマーミックス、75μlののdH ₂ Oと混合する渦を兼ね備えています。標準またはサンプルのいずれかを含むウェルに、このマスターミックス15μlのを追加します。
      4. すべてがチューブの底に集められるように、適切なウェルおよびパルス遠心PCRチューブに8-蓋PCRストリップキャップを置きます。
      5. 定量PCRミリアンペア上で以下のプログラムを設定しますチャイン：50℃20秒（ 図4A）のための1秒、60℃、95℃の45サイクル、続いて10分間、2分、95℃で、ため。
   3. 定量PCRからのCt（サイクル閾値）値を分析します。
      1. プログラムのエクスポート機能を使用してスプレッドシートにCt値を転送します。
      2. ^9〜10ゲノム/ mlの（ログ値として表される）を介して標準10 ⁵ゲノム/ mlの散布図を作成します。 3つのサンプルの中で、明らかな外れ値を捨てます。対数トレンドラインを生成し、グラフの方程式を決定します。
      3. 4.3.3.2で生成された式を用いて、試料中のゲノム/ mlの合計数を計算します。サンプルの：（100 1:10 1）最初の希釈を考慮することを忘れないでください。

5.逆の感染トランスフェクトした細胞（DAY 7）

1. Cで合計ゲノム/ mlに計算した後いがnetii pBlaM-CBU0077培養物を50μl/ウェル予熱用いDMEM + 10％FCSの最終容量300のMOIで細胞に感染させるために再懸濁した細菌培養物を調整し、感染に使用します。
   注：播種したHeLa 229細胞の予想される密度を通常の倍加時間と72時間は3.136×10 ⁴細胞/ウェルである後。 300のMOIで感染させるのに必要な細菌の量は、1.88×10 ⁸細菌/ mlに相当する50μlの、で9.408×10 ⁶です。
   1. 定量PCR（ゲノム/ mlで）（4.3.3.3）から算出される値を用いて、逆トランスフェクションされた細胞に感染するには、2 mlの最終容積で予め温めておいたDMEM + 10％FCSを使用して再懸濁した細菌を希釈します。
2. ブランクから既存のメディアを削除し、トランスフェクトされた細胞を逆転。
3. 適切なウェルに希釈した細菌（1.88×10 ⁸細菌/ ml）50μlのを追加します。ブランクとuの両方にDMEM + 10％FCSの50μLを追加ninfected井戸。
4. 37℃+ 5％CO ₂で24時間インキュベートします。

BLAM基板の6添加は転のレベルを決定するために（8日目）

1. BLAM基板6×ローディング溶液のためのソリューションを準備します。
   注：溶液A、BおよびCは、BLAM基質キット（ 材料の表を参照）内に設けられています。溶液Bは、室温で沈殿を形成することができます。使用前に37℃にこのソリューションを温め、沈殿物を溶解させる必要があります。
   1. 本キットを初めて使用する場合は、続いて乾燥溶液AにDMSO（BLAM基質キットに付属）の185μlを添加、-20℃で再懸濁した溶液Aを格納します。
   2. 必要になるまで-20℃で1ミリリットルのアリコートに予め、店舗中0.1Mプロベネシド溶液を調製します。
      1. 0.4 MのNaOH（100ミリリットルのdH ₂ O中1.6グラム）を準備します。
      2. 100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH 8（1.56グラムのNaH ₂ PO _4・2Hを調製<sUB 100ミリリットルのdH ₂ O中> 2 Oおよび1.41グラムのNa ₂ HPO _4）。
      3. 激しく攪拌することにより、0.4MのNaOHの22ミリリットル中プロベネシドの1.25グラムを溶解させます。
      4. 100の22ミリリットルmMのリン酸Na緩衝液pH 8を（溶液が濁って変わります）を追加し、そのフォームの沈殿物を溶解するために攪拌します。
      5. 1MのNaOH / HClを用いて（必要な場合）8にpHを調整します。
      6. 解決策はほとんど透明になるまで（<50°C）穏やかに勢いよく攪拌し、熱。
      7. 1ミリリットル量のフィルター（0.2μmの孔径）、アリコート。分注して-20℃で保管。
2. 各ウェルに、0.06μlの溶液A、0.54μlの溶液B、7.9μlの溶液Cと1.5μlの0.1 Mのプロベネシドを使用してください。最初のマイクロチューブに一緒に溶液Aの1.8μlのとB液の16.2μLを組み合わせることにより、30ウェルのためのマスターミックスを作成します。ボルテックスを用いてよく混ぜます。溶液Cの237μlの0.1 Mプロベネシドの45μLを加えます。すべてcomponenを結合する渦TS。
   注：6×ローディング溶液は、（暗所で）までの4時間安定であるが、使用する前にできるだけ近くに準備する必要があります。
3. 直接すべての空白に6×ローディング溶液10μlを追加し、既存のメディアを削除せずにトランスフェクトされた井戸を逆にします。
4. 暗所で室温で2時間プレートをインキュベートします。
5. 転座のレベルを決定するために、マイクロプレートリーダーを用いて蛍光の量を定量化します。
   注：次の手順では、ClarioSTARマイクロプレートリーダーに固有のものです。同等のマイクロプレートリーダーを利用することもできます。
   1. 読み取りモードとしてエンドポイントを使用して、新しい蛍光強度のプロトコルを作成します。
   2. 次のように基本的なパラメータを調整します。
      1. 96ウェルマイクロプレートを選択します。
      2. （1）入力410から10 nm励起および520から10 nm放射：光学設定で、次のユーザー定義の設定で2 multichromaticsを選択します。 （2）入力410から10 nm励起および450から10 nmの発光。よくMULT確認ichromaticsが選択されています。
      3. 直径3mmの軌道平均化を選択します。
      4. 視神経の下では、下部光学系を選択します。
      5. スピードと精度の下では、正確な選択。これは、ウェル当たり8つの領域に相当します。
   3. サンプルとして適切なウェルを選択することにより、プレートレイアウトを調整します。
   4. スタート測定を選択します。
   5. 蓋を外し、プレートリーダーにトレイを置きます。最大蛍光値に達しないようにするには、ゲイン値を確実に調整されます。これを行うには、逆OTP siRNAをトランスフェクトされた感染したウェルの1のゲイン調整を行います。これは、予想される最高転座に相当します。
   6. それぞれ、450 nmおよび青と緑色の蛍光520 nmの両方の410 nmおよび発光の励起で底の蛍光を使用して、すべての適切なウェルを測定するための測定を開始]を選択します。

結果の7.分析：

1. 比を計算します感染していないOTPサンプルに空白の削減や特急相対を以下の全てのサンプルについては520nm（緑、青）に450nmでの。
   注：以下の分析手順は、単純な表計算プログラムのために提供されます。
   1. マイクロプレートリーダーでエクスポート機能を使用して、スプレッドシートに520 nmおよび450 nmの発光波長（6.5）の両方に対して得られた生の蛍光値を転送します。
   2. 生の520 nmの蛍光値を加算し、ウェルの数で割ることによって520 nmの波長のための「ブランク」の読み（培地のみ、細胞なし）の平均を計算する（3）。空白の450 nmの波長値を使用して繰り返します。これらの値により、96ウェルプレート及びメディアにバックグラウンド蛍光を表します。
   3. バックグラウンド蛍光を引きます。 7.1.2で得られた値を使用すると、すべてのサンプル520 nmの蛍光値からブランク520 nmの波長の平均値を減算します。 450 nmの波長値に対して繰り返します。
   4. 450取得するには：520 nmの比は、ブランク補正した値（7.1.3）を使用します。それに対応する520 nmの値によって各サンプル450 nmの蛍光値を割ります。
   5. （7.1.4からの）520nmの比の値、ウェル（3）の数で割る：450を追加することによって、感染していないOTP比の値の平均値を算出します。
   6. 7.1.5で計算された非感染OTP比の値の平均値で7.1.4で計算された520 nmの比：450を分割することによって感染していないOTPと比較したサンプルの比率を計算します。

転位アッセイ後に細胞数を決定するために、核染色の8.追加（8日目）

1. 蛍光の定量化に続いて、マルチチャンネルピペットを用いて真空源または手動に取り付けられたいずれかのマルチチャネル・アダプターを使用して、すべてのウェルからの6×ローディング溶液を含む培地を除去します。
2. 4％PFA（パラホルムアルデヒド）溶液50μlを追加PBS中のすべての適切なウェルに細胞を固定します。 RTで20分間インキュベートします。
3. （8.1による）4％PFAのPBS溶液を除去し、PBS75μlので細胞を2回洗浄します。
4. 各ウェルに、例えばDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）のために、細胞透過性核染色の50μLを加えます。蛍光顕微鏡で画像を取得し、そのようなImageJの⁴¹のように、適当な画像解析ソフトウェアを使用してよくsiRNA処理後のそれぞれの中に存在する核の数を定量化します。

Representative Results

Discussion

分泌系、および細菌エフェクタータンパク質の宿主細胞の細胞質へのこれらのシステムの輸送は、多くの病原性細菌は、一意複製ニッチ内感染を確立するために利用する重要な病原性要素です。多くの研究グループの焦点は、細菌のエフェクターおよび宿主タンパク質およびこれらのエフェクターは、宿主細胞経路上に持っている影響力の間の相互作用を調査することでした。非常に限られた研究は、もしあれば、成功した細菌エフェクター転位のために必要であると宿主タンパク質の可能性を検討しました。

本研究では、偏性細胞内病原体Q熱リケッチア 、人獣共通感染Q熱の原因物質を使用していました。宿主細胞への侵入後、 コクシエラ含有液胞は、受動的に、それは非常に高い数字に複製し、酸性リソソーム由来の液胞に到達するまで、標準的なエンドサイトーシス経路を介して入稿します。別にアドバンタを取ってから通常のホストの人身売買経路のGEは、成功した複製ニッチを確立するコクシエラの能力はまた、機能タイプIVB分泌システム（T4SS）とそれに続くエフェクター転座^8,17に依存しています。この分泌系は、 レジオネラのよく特徴付けドット/ ICM T4SSに機能的に類似しています。これは、適切にそれぞれのコクシエラ遺伝子 ^19,20とレジオネラ菌の特定ドット/ ICMの変異体を補完することによって実証されました。 レジオネラとコクシエラ両方のT4SSsが複製に必須であるが、これらのシステムが活性化されるときのタイミングが全く異なっており、それぞれの複製ニッチの発散の性質を反映しています。 レジオネラ T4SSを直ちに宿主細胞およびエフェクターの急速な転座と接触したときにトリガされ、細菌がデフォルトエンドソーム-リソソーム経路を回避し、代わりにユニークなER由来の複製真空を作成することができますル^42。細菌は酸性のリソソーム由来の液胞^21に到達した後、これとは対照的に、 コクシエラのT4SSは、約8時間後に感染するまで活性化されません。

コクシエラは受動的にエンドサイトーシス経路を介して通過し、それがリソソームに到達するまで転システムが起動していないことを考えると、ユニークな機会は、エンドサイトーシス成熟を ​​研究するためのツールとしてコクシエラを使用するようにそれ自身を示します。エフェクターが転位される前に、CCVが酸性になるための必要条件は、宿主タンパク質の数は、エンドサイトーシストラフィッキング経路に関与するタンパク質、特に、宿主細胞質へのエフェクタータンパク質のトランスロケーションのために重要であるが、これらに限定されないことを示しています。特定の目的の方法でのsiRNAを活用し、我々は、エフェクター転上の特定の宿主タンパク質の役割を解明するために始めることができます。本研究では、真核生物のエンドサイトーシスtraffickiを調節する二つのタンパク質に焦点を当てました経路をngの、ひいてはコクシエラエフェクターCBU0077の移行をもたらすと予測されました。それぞれ初期および後期エンドソームとRab5AとRab7A制御膜融合、。制御OTPのsiRNA（ 図5B）と比較した場合、siRNAを用い、これらのタンパク質のいずれかをサイレンシングするCBU0077の移動効率の大幅な減少をもたらしました。ここに示されている代表的な結果は^、21我々の以前公開された調査結果を反映し、 コクシエラエフェクター転座にこれらのヒトRabタンパク質の重要性をさらに検証を提供します。この技術は、 コクシエラドット/ ICMエフェクター転上の他のホストのプロセスの影響を特徴づけるために使用されています。レトロマー複合体は、 コクシエラの細胞内複製のために重要であることが見出されました。 、レトロマーコンポーネントをサイレンシングするsiRNAを使用して、その後、転座アッセイを行うことにより、我々はそのレトロマーがその誘導する環境を作成するために必要とされる示すことができましたコクシエラエフェクター転^43。

ここに示した代表的な結果がRab5AとRab7Aをターゲットに感染したOTP制御およびsiRNAとの比較ですが、プロトコルは、実験的なニーズに応じて変更することができます。例えば、エフェクター転座のレベルはまた、スクランブルsiRNA又は非トランスフェクト細胞をトランスフェクトした細胞と比較することができます。

この特定の研究の焦点は、偏性細胞内病原体℃でした。エンドサイトーシス輸送に関与バーネッティおよびタンパク質は、しかし、中に記載される方法は、容易に病原性のための分泌系を利用する他の細胞内および細胞外の病原体に適合させることができます。確かに、ここで使用される宿主細胞質内のβラクタマーゼ活性に依存している蛍光ベースの転座アッセイは、すでに広く病原体^30-32,35,44の範囲を越えて使用されています。の当然のことながら、感染条件使用される特定の細胞株は、特定の細菌の感染の要件を反映するように適合されなければなりません。さらに、知られている内因性エフェクターは、β-ラクタマーゼをする内に記載された方法の成功に最も重要である融合しました。プロトコルの実装を成功させるための一つの重要な考慮事項は、ここで説明する細菌の侵入およびその後の複製に持つことができ、特定のホスト・ターゲットのサイレンシングへの影響です。ここでは、 コクシエラによってエフェクター転座は、24時間後の感染を測定しました。この場合、その他の細胞内細菌のために、宿主細胞への侵入を獲得する生物の能力が重要です。さらに、特異的な遺伝子サイレンシングもありますので観察転座のレベルを変化させる細菌の複製に影響を与える可能性があります。 siRNAのサイレンシングが大幅に細菌の侵入および/または複製、その結果、転座効率に影響を与えないことの確認は、顕微鏡または細菌の命数のいずれかを使用して達成することができます。転座データは、siRNA処理あたり感染した細胞の数に対して標準化することができます。細菌の複製は、 コクシエラは、24時間のインキュベーション期間の間に無複製に少しを受けるように、ここで提示されたデータを混乱させていません。

この方法は、目的の遺伝子の十分な抑制を確実にするために、宿主細胞へのsiRNAの効率的なトランスフェクションを必要とします。これを念頭に置いて、正しいトランスフェクション試薬を選択することが極めて重要です。別に試薬およびHeLa 229細胞のために最適化されたこの特定の研究に使用された条件から、から選択するための多数の他の試薬があります。異なるトランスフェクション試薬を用いて、ノックダウン効率が最も適切な試薬の両方が選択されていることを確認するためにRT-qPCRを使用して定量化したsiRNAは、具体的に選択された興味のある転写産物を標的とすることができます。本研究で提示されていないが、我々は以前にRTを使用してRab5AとRab7A両方のノックダウン効率を実証しています-qPCR ^21。さらに、ウェスタンブロットにより関心、確認の標的に対する抗体の使用は、特定のターゲットのsiRNAサイレンシングを確認することができます。

siRNAを用いたときのメモを取るために他の二つの重要な検討事項は、オフターゲット効果の可能性、およびトランスフェクトされた細胞の細胞生存率が含まれます。意図しないターゲットをも破壊されたときにオフターゲット効果が発生します。これは、表現型の変化につながることができますし、偽陽性になることがあります。本研究では、単一のホスト・ターゲットを沈黙させる4 siRNA二本鎖のプールを利用しました。特定の標的をサイレンシングする転効率の低下が生じた場合、この結果は、オフターゲット効果によるものではないことの検証は、4つのsiRNA二本鎖を分離し、転座アッセイを繰り返すことによって達成することができます。 4 siRNA二本鎖のうち少なくとも2つは、元のsiRNAプールに類似した表現型を示さなければなりません。この結果、一方は非常に確信できることが観察されたTRanslocation効率がオフターゲット効果によるものではありません。生産転座の結果の妥当性はまた、細胞の生存率に依存しています。転座アッセイ後の核染色の適用は、siRNAサイレンシング後の細胞生存率の列挙を可能にします。 PLK1の場合には、有意な細胞死は、容易に染色することなく観察することができます。しかしながら、落射蛍光顕微鏡を使用してより正確な表現を達成することができます。特定の宿主標的をサイレンシングすることにより、有意な細胞死が観察された場合、例えば50％の対照と比較して、正確な画像がエフェクターの転位への特定の宿主タンパク質の重要性に関して推測することができるとは考えにくいです。 Rab5AまたはRab7Aいずれかをサイレンシングする細胞生存率（ 図5C）にわずかな影響を有するが、本研究で示されるように、この減少が観察転データの正当性を否定するのに十分な発音されていません。細胞生存follに関して持つ別の考慮事項siRNAのサイレンシングを起因する有意な細胞死は、しばしば、転位率の上昇をもたらすという観察です。これは、適切にPLK1（ 図5A）について報告された転データによって実証されます。減少した細胞数は、感染の多重度が比例増加をもたらします。これは、感染率、従って転位率を増加させます。

本研究で提示されていないが、エフェクター転座の可視化には、無料の定量的な結果を得ることができます。別個の励起および発光光のロングパスダイクロイックミラーを取り付けた落射蛍光顕微鏡を使用して、細胞内BLAM基板蛍光の視覚的観察を提供することができます。 βラクタマーゼレポーターシステムの可能な代替は、アデニル酸シクラーゼレポーター系を利用することです。ここに記載のレポーター系と同様に、目的の遺伝子は、 のcyaA（カルモジュリン依存性アデニレートシクラーゼ遺伝子に融合されています</em>） 百日咳菌由来。エフェクター転座は、イムノアッセイELISAキットを用いて、細胞内サイクリックAMP（cAMPの）の定量によって測定することができます。 CyaAの活性は、宿主細胞質にのみ存在する宿主細胞カルモジュリン、に完全に依存するため、エフェクター転座は、cAMPレベルの増加によって確認されます。この方法はまた、細菌^45-47の様々なエフェクターの移動を測定するために成功裏に使用されているが、細胞内cAMPの定量化は、cAMP内に記載された方法と比較してよりtimeconsumingでプロセスを抽出するために、宿主細胞の溶解に依存します。 BLAM基質を細胞に直接添加することができ、蛍光は時間以内に測定することができるので、FRETベースのβラクタマーゼレポーターシステムを用いて、エフェクター転座の測定は、より効率的です。さらに、ここに記載された方法は、より簡単に、特に96ウェル形式で、高スループットの結果を生成するように適合させることができますで。

多くの細菌性病原体は、病原体の利益のために宿主細胞機能の調節を可能にする宿主細胞にエフェクタータンパク質を導入するタンパク質転位システムに依存します。 IV型分泌系は、 レジオネラ属 、 コクシエラ及びブルセラなどの細胞内細菌によって使用され、タイプIII分泌システムは、 クラミジアなどの病原体の範囲で利用され、Eを取り付け、effacing 大腸菌やサルモネラ菌 。病原体の範囲によってエフェクター転上の特定の宿主タンパク質の発現をサイレンシングの効果を比較することにより、分泌系または個々の病原体に特有の特定の種類によってエフェクター転位のために必要な宿主因子の理解は明らかにすることができました。これは、宿主 – 病原体相互作用の複雑さを研究するためのユニークなアプローチを提供します。

Materials

<strong>Reagents</strong>
Citric acid	Sigma	C0759	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Calbiochem	442611	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Fisher	S93248	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852	ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone	BD	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	Fisher	BP1424	ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin	Sigma	C4555	ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax	ThermoFisher Scientific	61870-036	ACCM-2 medium component
Chloramphenicol	Sigma	C0378	For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)	Dharmacon	D-001810-10-05	Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-003290-01-005	Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-010388-00-0005
5x siRNA buffer	Dharmacon	B-002000-UB-100	Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent	Dharmacon	T-2001-01	For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	51985-034	Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10567-014	For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)	Thermo Scientific	SH30071.03	Can use alternate equivalent product
DMSO	Sigma	D8418	For storage of Coxiella strain
PBS			For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA	ThermoFisher Scientific	25300-054	For cell culture
dH<sub>2</sub>O			For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep	ZYMO Research	D3007	Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Bioline	BIO-98020	Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM	Invitrogen	K1032	For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide	Merck	106469	Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic	Sigma	71505	Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate	Merck	106586	Probenicid solution component
Probenicid	Sigma	P8761	Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62251	Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&nbsp;
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS	Sigma	P6148	Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	430639	For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile	Corning	3603
75 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	430641	For growth of HeLa 229 cells
175 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	431080	For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer			For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates	4titude	4ti-0750/TA	For qPCR reaction
8-Lid chain, flat	Sarstedt	65.989.002	For qPCR reaction
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
<strong>Equipment</strong>
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge	Eppendorf	5810 R	For pelleting bacterial culture
Nanodrop			For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine	Aligent Technologies	401456	For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader	BMG LabTech		For measurement of fluorescence