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方法論記事

ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激

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DOI:

10.3791/54217

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2016年10月22日

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1Department of Rehabilitation Medicine, Chungnam National University Hospital, Daejeon, 2Department of Biomedical Engineering, Seoul National University College of Medicine, 3Institute of Medical and Biological Engineering, Medical Research Center, Seoul National University, 4Department of Biomedical Engineering, Seoul National University Hospital, 5Department of Nuclear Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Gangwon Do Rehabilitation Hospital, 7Department of Rehabilitation Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine

この記事について

サマリー

私たちは、ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)を適用し、25mmの字型コイルを両側の頂点から1cm外側に配置し、コイルを45°角度付けました。rTMSには、社内の水冷システムを20分以上使用しました。

要約

以前の齧歯類の反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)は、片側半球のrTMSの代わりに全脳刺激法を採用していました。これは、人間の被験者に使用されるプロトコルとは異なります。ラット脳の片側半球へのrTMSの適用が成功したことを報告します。rTMSは、小さな25mmの字型8のコイルを使用して、低周波(1Hz)、高周波(20Hz)、または偽の刺激プロトコルで脳の片側に送達されました。コイルの中心を両耳線上の頂点に対して 1 cm 外側に配置し、コイルを地面に対して 45° 角度にして、rTMS が反対側の皮質に及ぼす潜在的な直接的な影響を最小限に抑えました。また、自社製の水冷システムにより、20Hzの刺激周波数でも20分以上の磁気刺激を繰り返し行うことが可能になりました。即時の初期遺伝子(Arc、Junb、およびEgr2)の転写の増加は、偽刺激後よりもrTMS後に大きかった。20分間の1Hz rTMSを5日間連続して行った後、bdnf mRNAの発現は、刺激された皮質で反対側よりも有意に高かった。ここで提示するモデルは、その効果の半球間の違いを解析できるようにすることで、rTMSの分子メカニズムを解明します。

概要

反復経頭蓋磁気刺激（のrTMS）、非侵襲的脳刺激と神経調節のためのツールは、例えば、中枢性疼痛1,2、うつ病3、片頭痛4、さらに5~7ストロークのような様々な症状の治療に適用されています。急速に頭の上にコイルに電流を変更すると、大脳皮質、得られたニューロンの活性化に電界を誘導します。大脳皮質の興奮性刺激が終了した後30分以上続くことができるのrTMSによって調節することができます。

後の効果のrTMSの推奨メカニズムは、長期増強/うつ様効果8、イオンバランス9の一過性のシフトを含み、および代謝は10を変更します 。また、ディラザロら 。断続的なシータバースト刺激が刺激の両方で、管内のニューロンをピラミッドために興奮性シナプス入力に影響を与えることを示唆していますそして、反対側の半球11。

重大な制限は、しかし、臨床状況にオンベンチ証拠を翻訳から研究者を妨げてきました。まず、以前の動物実験において、のrTMSは、全脳刺激12のために使用しました。全脳刺激は、ヒトの研究9で使用されるプロトコルとは全く異なります。他の問題は、刺激の持続時間と関連しています。これは、少なくとも部分的に起因する効果的な冷却システムは、過去の小さなコイル用の利用できなかったという事実にあります。

近年では、精液の記事は、小さな動物の脳でのrTMSの実験では、これらの困難を克服するための方法を示唆して公開されています。これらの動物モデルにより、ラットの脳にも低周波のrTMS 13に応答して、人間と同様の皮質の興奮性の変化を示すことが明らかになりました。さらに重要なこと、のrTMSの細胞および分子メカニズムはますますBEIですngののrTMSの動物モデルを用いて調べました。その一例は、抑制性の特殊タイプが断続シータバースト刺激14に最も敏感であることが知られているということです。 rTMSのげっ歯類モデルは、このように、のrTMS誘発変化の分子基盤に大いに求められて質問を探索するための新しい機会を提供しています。 rTMSの小動物モデルはより実験室で使用することができる場合、それは大いに加速し、この分野での研究を強化することができます。

私たちは今、ラット脳の一方的な半球、前作15の延長にのrTMSを適用する方法を説明します。刺激誘発変化を刺激大脳皮質のrTMS誘発性の変化を研究するために、マイクロ陽電子放射断層撮影（PET）およびmRNAマイクロアレイを用いて評価しました。

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プロトコル

動物を用いた全ての手順を見直し、ソウル国立大学病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.実験のセットアップ

  1. 動物の準備
    1. 雄のSprague-Dawleyラット1週間は、実験を開始する前に、新しい環境に適応できるようにします。
      注：8週齢のラットを本研究で使用したが、現像または成人の脳研究の仮説に応じて選択することができます。
  2. 誘導のための吸入麻酔
    1. それぞれ、チャンバ及びノーズコーンを介し ％/ 75％酸素/窒素誘導し、維持麻酔を5％/ 60％〜40％に溶解したイソフルランの2％と25。適切な麻酔を確認するために、つま先のピンチにペダル引っ込め反射を廃止レベルに麻酔深度を調整します。
      注：目覚めた動物を使用すると、翻訳という点で、より良い選択であるが、のrTMSとtの間抑制する難しさがあることができますちょっと過度なストレスを受けやすいです。
    2. 直腸プローブで体温を監視し、恒温ブランケットを使用して、37℃で、それを維持します。ペダル引っ込め反射、温度、呼吸数や心拍数を使用して麻酔深度を監視します。
  3. スイッチオーバー保守のための静脈麻酔に
    1. アルコール綿棒で尾を準備します。 IV麻酔（ 図1A）への移行のための24ゲージの静脈カテーテルと外側尾静脈をカテーテルを挿入。動物への静脈内負荷プロポフォール（10 mg / mlでエマルジョンを用いて10分間かけての1mg / [kgの・分]）。プロポフォールのロードを開始した後、イソフルラン5分を中止してください。
    2. 以前の研究16のように、実験を通じて700μgの/（キロ・分） - 500の注入速度でプロポフォール鎮静を維持します。ノーズコーンを介して、0.8 L / minで酸素を補います。
      注：プロポフォールで麻酔はinhalによって皮質興奮性の潜在的な抑制を減少させることですエーションエージェント17-19。しかし、麻酔のrTMS実験では必須ではなく、起床動物を使用することもできます。麻酔法は、研究仮説を考慮して決定されるべきです。
    3. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を使用してください。
    4. 磁気刺激（2節を参照） 静脈麻酔への完全移行後10分を適用します。
  4. 回復条件
    1. 回復期の間、バイタルサインを監視します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。動物が手術を受けた場合は完全に回復するまで、他の動物の会社にそれを返しません。
      注：疾患モデルの手術が行われた場合、術後の疼痛管理が必要です。しかし、疼痛管理は、こののrTMS実験のために必要とされていません。

2.反復経頭蓋磁気刺激

  1. スティミュレータとコイル
    1. 25ミリメートル8の字コイルを介して二相性刺激を提供し、反復刺激を使用して刺激を適用します。両耳介のライン上の頂点に対して横コイル0.5センチメートルの中心を探して、地面にコイル45°角張ります。
      注：コイルの最大磁界強度は、磁気コイルが内蔵のホルダーにしっかりと装着されている4.0 Tです。
  2. 運動閾値
    1. コイルの中心で、ホットスポットでの運動閾値（MT）を決定するには、両耳介のラインおよび頭蓋冠の上に表面を平坦で頂点に横0.5cmに配置されます。これは、以前の研究20で使用したのと同じ方法論です。
      注：連続10刺激により反対側の前足に5以上の触知可能な収縮を惹起する最小刺激強度としてMTを定義します。刺激は主に一方的な刺激を確保するために、反対側の筋肉の収縮を引き起こしているかどうかを確認します。
  3. rTMSの応用
    1. 深い麻酔の安定した後のrTMS 10分を適用します。研究課題に応じて、大脳皮質から選択されたターゲットのrTMS部位でのコイルの中心を配置します。そして、刺激点におけるコイル中心と頭蓋骨の表面との間の直接的な接触を確実にするためにコイルを傾けます。
      注：たとえば、地面に角張るコイル45°は反対側皮質（ 図1Bおよび1C）上のrTMSの潜在的な直接の影響を最小限にします。
    2. 一方的な半球の20分のrTMSのセッションに動物を供します。ソフトウェアコンソールを使用して、低周波（1 Hz）で、高周波数（20ヘルツ）、または偽刺激プロトコルとのrTMSを提供し、100で刺激強度を設定 - MTの110％。
    3. 休むことなく1 Hzの刺激を実行します。ソフトウェアのコンソール入力 "20"分）のために、「1200」のショットを使用しました。 20 Hzの刺激のために、28に続く刺激の2秒を実施残りの秒。ソフトウェアのコンソール入力 "20"分 "1600"のショットを使用しました。
    4. 偽の刺激のために、頭蓋冠に垂直コイル（90°回転）を傾け、ヘッド表面（ 図1D）から2センチメートル離れたコイルの端を置きます。主装置にしっかりとコイルホルダを修正しました。実験中に手でコイルを保持する必要はありません。
      注：音響および他の非特異的効果を補償するために、明確な偽のプロトコルは、異なる刺激プロトコルのために使用されるべきです。例えば、1Hzの偽刺激は、1ヘルツのrTMSの実験のために使用することができます。
  4. 冷却コイル
    1. 1-および20-Hzの刺激周波数（ 図2）で20分以上のための反復磁気刺激を可能にするために水冷システムを使用してください。コイルまたは刺激の温度が監視されていないが、過熱を防止するために、実験の間、コイルの全長を囲む冷たい水を循環させます。
      注：市販の冷却ラットコイルを使用することもできます。
    2. 可能であれば、のrTMS機の加熱ゲージを表示することにより、コイルの温度を監視します。注：のrTMS刺激に関連する有害な影響はなかったです。金属の耳の識別タグが刺激コイルの近くで使用される場合、潜在的な火傷のリスクは、しかしながら、存在します。

3.マイクロポジトロン放出断層撮影

  1. 動物の準備
    1. （ステップ1.2.1と1.3.1を参照してください）メンテナンス用の誘導および静脈麻酔用の吸入麻酔を行っています。 MTの100から110パーセントの刺激強度で10分間動物に1ヘルツのrTMSを適用します。
    2. 分のrTMS刺激を終了した後、尾静脈カテーテルを使用して、生理食塩水0.5mlに溶解した2- [F-18]フルオロデオキシグルコース（18 FDG）を1mCiのを注入します。 18 FDGの取り込みのための30分を許可します。注：全体のマイクロ-PE中に麻酔下のラットを置きますT実験。
  2. 画像解析
    1. 刺激のunilateralityを再確認するために脳イメージング用PETスキャナーを使用してください。 3-D反復アルゴリズムで画像を再構成します。 rTMSによって誘発される代謝の変化を評価するために、横方向の脳切片21の画像に興味（関心領域）の領域を同定します。
  3. 安楽死
    1. ラットを深く麻酔している間、マイクロPET撮像を行った後、二酸化炭素を予め充填室にラットを安楽死させます。

4. mRNAのマイクロアレイ

  1. 安楽死
    1. それぞれ、チャンバ及びノーズコーンを介し ％/ 75％酸素/窒素誘導し、維持麻酔を5％/ 60％〜40％に溶解したイソフルランの2％と25。断頭される前に、つま先のピンチにペダル引っ込め反射を廃止のレベルに深く麻酔。
    2. 1-HzでのrTMSの1セッションの後に安楽死5分間ラットを刎ねます。
  2. 組織の収穫
    1. 折り畳まれた紙タオル、骨鉗子、microscissors、より大きな手術用はさみ、microforcep、第10または11手術用メスの刃、氷で満たされた蓋付き10cmのガラスシャーレを含む、使用のために、材料や手術器具をレイアウト、および1.5 mlのチューブ。カーカスの処分のためにビニール袋を準備します。
    2. anterioposteriorly頭蓋骨内の正中皮膚切開を行います。ぶっきらぼうに手術用ハサミでの軟組織と周囲の筋肉を解剖し、骨鉗子を使用して、頭蓋骨の一部を削除します。迅速に頭蓋骨から慎重に新鮮な脳を解剖。その後、マイクロピンセットとmicroscissorsを使用して氷の上に横たわっていました。氷冷生理食塩水中脳組織をすすぎます。
    3. 直ちにドライアイスに脳を転送し、その後、さらなる処理までチューブに-80℃で保管してください。
    4. 収穫前に脳組織を解凍します。
    5. 脳の背側を上に置き、目から脳組織を収穫マイクロピンセットとmicroscissorsを使用して氷上で（一次運動野におけるホットスポットの周り）大脳皮質をimulated。 1.5-mlチューブに採取した組織を置きます。
  3. RNA調製
    1. 溶解試薬22を使用して、組織ホモジネートからの全RNAを抽出します。 DNase消化とクリーンアップの手順とプロセス。 RNAサンプルと一定分量を定量化し、使用するまで-80℃で保管してください。
    2. 品質管理のために、260のOD比で、変性ゲル電気泳動によって、RNAの純度および完全性を評価する：280、および市販の分析装置上で分析します。
  4. 標識および精製
    1. ビオチン化されたcRNAを生成するために、市販のRNA増幅キットを用いて全RNAを増幅し、精製します。簡単に述べると、 - 逆転写T7オリゴ（dT）プライマーを用いてcDNAを総RNA 550 ngのを。合成し、in vitroでの第二鎖cDNAを転写した後、ビオチンNTPでそれをラベル。
    2. PUR後ification、分光光度計を使用してするcDNAを定量化します。
  5. ハイブリダイゼーションおよびデータのエクスポート23
    1. mRNA発現解析のための発現BeadChipを使用してください。 58℃で18時間 - 16各ラット-12発現のビーズアレイに標識した750 ngのcDNA試料をハイブリダイズします。ストレプトアビジンのCy3を用いてアレイ信号の検出を行います。
    2. 共焦点スキャナでスキャンアレイ。市販のソフトウェアを使用して配列データのエクスポート処理及び分析を行います。

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結果

十五8週齢の雄性Sprague-Dawleyラットは、MTの決意の別個の評価者間の信頼性解析に使用しました。筋肉のけいれんの触診を使用して、のMTは、2つの独立した研究者によって、すべてのラットで得られると、それぞれ33.00±4.21パーセント、最大刺激出力（％MSO）および33.93±0.88パーセントMSOとして測定しました。当たり障りのない-アルトマンバイアスは-0.93であり、契約の95％限界は7.26パーセントに-9.13でした。

（偽のrTMS群ではn = 1ヘルツのrTMS 4、およびn = 2）6 8週齢のラットのマイクロPET実験では、関心領域における18 F-FDGの取込みを平均として算出しました。同じ画像の両方の同側および対側大脳皮質のキャリブレーション後のNCI / ccで。反対側の領域における放射能を同側の領域で得られたデータを正規化するための基準として使用し、差動取り込み比（DUR）を算出しました。...

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ディスカッション

本研究の主な目的は、一方的なのrTMSの動物モデルを導入することでした。一方的な刺激は、人間のrTMSの研究の最も基本的な特徴の一つであるが、多くの研究が小動物でそれを採用していません。 112.5パーセントと133.3パーセントMTによる刺激が同側だけでなく、反対側のMEPを生成し、一方、しかし、ローテンバーグら 15は 、20ミリメートルの外ローブ径の8の字コイルを用いて100％MTの刺激と反対側のMEPを記録しました。大きな誘導電界が対側半球に影響を与えることができるので、これは可能性があります。したがって、我々の研究は、より多くの横方向のコイルを動かすと、それは一方的な刺激を強調するために傾斜させることにより、この前の仕事15,24の拡張です。我々は、マイクロPETはのrTMS後に刺激大脳皮質におけるグルコース代謝の局所的な増大（ 図3）を明らかにしたことを確認したため、この研究の主な目的は達成されました。

jove_contentコイルの ">場所と角度が、この実験における重要なステ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、韓国政府が資金提供する韓国研究財団の助成金（KRF-2008-313-E00458)によって支援されました。著者は、技術支援を提供してくれたJin-Joo Leeに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
直腸プローブ付きホメオサーミックブランケットド装置507222F
イソフルラン(フォランsol。Choongwae
Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml)Claris Lifesciences
反復磁気刺激装置 (Magstim Rapid2)Magstim Company Ltd
25 mm figure-of-8 coilMagstim Company Ltd1165-00
PET-CTGE Healthcare
QIAzol Lysis ReagentQiagen(米国特許第5,346,994号)
RNeasy Lipid Tissue Mini KitQiagen74804
RNeasy Mini Spin ColumnsQiagen(Mat No. 1011708)
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies
Ambion Illumina RNA amplification kitAmbion
Nanodrop 分光光度計NanoDropND-1000
イルミナ RatRef-12 エクスプレッションビーズチップイルミナ
アマシャムフルオロリンクストレプトアビジン-Cy3GEヘルスケアバイオサイエンス
ハーバー

参考文献

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