ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

サマリー

有糸分裂はすべての生物にとって重要であり、欠陥はしばしば癌や発達障害を引き起こします。このイメージングプロトコルとゼブラフィッシュをモデルシステムとして使用することで、研究者は生きた脊椎動物の有糸分裂と、有糸分裂プロセスに欠陥がある場合に生じる多数の欠陥を視覚化することができます。

要約

有糸分裂は、生物の増殖および分化に重要です。プロセスは非常に動的であり、短い時間枠内で適切なクロマチン凝縮、微小管動原体結合、染色体分離、および細胞質分裂を達成するために、イベントを命じする必要があります。繊細なプロセスのエラーは、出生異常や癌を含む、ヒトの疾患につながることができます。ヒトの有糸分裂の疾患状態を調査する従来のアプローチは、多くの場合、ヒトの疾患を研究する自然な生理機能および有利な発達/組織特異的な文脈を欠いている細胞培養系に依存しています。このプロトコルは、高解像度、脊椎動物のシステムにおける染色体ダイナミクス、ゼブラフィッシュで、視覚化する方法を提供することで、多くの障害を克服します。このプロトコルの詳細が含ま分裂細胞の動的な画像得るために使用することができるのアプローチは以下となります。in vitro転写、ゼブラフィッシュの繁殖/収集、胚の埋め込 ​​み、およびタイムラプスイメージングを。最適化とMODIFこのプロトコルのicationsも模索されています。 H2A.F / Z-EGFP（ラベルのクロマチン）を使用し、mCherryを-CAAX（ラベルの細胞膜）のmRNAを注入した胚、AB野生型で有糸分裂、 オーロラの ^hi1045、およびesco2の ^hi2865変異体ゼブラフィッシュが可視化されます。ゼブラフィッシュにおける高解像度のライブイメージングは​​1つが統計的に有糸分裂欠陥や有糸分裂進行のタイミングを定量化するために、複数の有糸分裂を観察することができます。また、不適切な（ すなわち、会合欠損、染色体のmissegregation、 等 ）有糸分裂プロセス及び不適切な染色体結果（ すなわち、異数性、倍数性、小核、 等）を定義質的側面 ​​の観察が観察されます。このアッセイは、組織分化/開発の観測に適用され、変異体ゼブラフィッシュ及び薬理学的薬剤の使用に適していることができます。有糸分裂の欠陥が癌や発達障害になります大幅につながる方法の可視化疾患の病因の理解を高めます。

概要

有糸分裂は、生体内の増殖、分化、および再生のための重要な細胞プロセスに不可欠です。正確な準備と間期におけるDNAの複製の際に、細胞は分裂するプライミングされます。有糸分裂の第一期、前期は、サイクリンB / Cdk1のの活性化によって開始されます。前期は、染色体にクロマチン材料の凝縮によって特徴付けられます。核膜の内訳は、前期と中期の間の遷移で発生します。前中期では、中心体は、紡錘体形成のための核形成中心は、動原体の添付ファイルの検索で微小管を拡張しながら反対の極に移行し始めます。取り付け時には、変換は微小管の添付ファイルを-終了すると張力は、中期板^1を形成^する染色体を向けます。すべての染色体が正しく接続されている場合、スピンドルアセンブリチェックポイントが満たされ、一緒に姉妹染色を保持コヒーシン環が切断され、および微小管は妹を引っ張って短くされています後期^2,3の間に反対の極にクロマチド。最終段階、終期は、二つの新しい核の周りに核膜のセルと改革の伸長を伴います。細胞質分裂は、2つの新しい娘細胞^4-6の細胞質を分離することにより、分割プロセスを完了します。キー有糸分裂経路（ すなわち、紡錘体形成チェックポイント、中心体の複製、姉妹染色分体の接着など ）の変更は、中期停止、染色体のmissegregation、およびゲノム不安定性^7-10をもたらすことができます。最終的には、有糸分裂を制御する経路における欠陥は、有糸分裂およびライブでの欠陥、脊椎動物、多細胞生物^10-16の可視化を必要と、発達障害やがんを引き起こす可能性があります。

ゼブラフィッシュの胚は透明な組織、マイクロインジェクションの容易さ、および迅速な開発によるライブイメージングのための偉大なモデル生物としての役割を果たす。ゼブラフィッシュを用いて、この原稿の全体的な目標はにありますライブ5D有糸分裂^17（ 図1C）の（寸法X、Y、Z、時間、及び波長）イメージングの方法を記載します。別の有糸分裂経路における欠損変異体ゼブラフィッシュの使用は、このような欠陥の結果を示しています。このプロトコルについては、オーロラBおよびEsco2変異体は、これらの欠陥を説明するために選択しました。オーロラBは、紡錘体形成と微小管の添付ファイルに関わる染色体パッセンジャー複合体（CPC）の一部であるキナーゼです。また、細胞質分裂^18,19内の分裂溝の形成のために必要とされます。ゼブラフィッシュでは、オーロラBの欠乏は畝間誘導、細胞質分裂、および染色体分離²⁰の欠陥につながります。 Esco2は、他の一方で、姉妹染色分体凝集^21,22のために不可欠であるアセチルトランスフェラーゼです。したがって、中期、後期の遷移²³で適切な染色体分離を確保するために、コヒーシンの安定化リングのSMC3部にコヒーシンをアセチル化。ゼブラフィッシュにおけるEsco2の損失をCHにつながりますromosome missegregation、早期の姉妹染色分体の分離、ゲノム不安定性、およびp53依存性および非依存性アポトーシス^24,25。在庫状況により、 オーロラの ^hi1045、および^hi2865変異ゼブラフィッシュをesco2に（以下、それぞれ、aurB ^{メートル/メートル}と呼ばれ、esco2 ^{m / m）の}この手法^25-27を説明するために使用されます。

蛍光タグ付き細胞機構とのカップリング共焦点顕微鏡は、有糸分裂^25,28,29の間にクロマチンと細胞膜動態を可視化する研究を可能にしました。蛍光タグ化ヒストンは、歴史的にクロマチンを可視化するために使用されてきました。ヒストンは、染色体^30を構成^するヌクレオソーム構造を担当している4異なる対（H2A、H2B、H3、およびH4）からなる核タンパク質です。 H2Bは間違いなく中の蛍光タンパク質のための最も使用されるヒストンですがマウスおよび細胞培養、ヒストン2Aの使用、家族Z（H2A.F / Z）はゼブラフィッシュ^31,32で使用するために十分であることが判明しました。コンカナバリンA及びカゼインキナーゼ、例えば、1-γは、細胞膜に局在し、以前にウニとショウジョウバエ^33,34に細胞膜を可視化するのに有効なことが示されています。他の研究では、CAAX蛍光標識タンパク質が細胞膜を標識することが示されており、ゼブラフィッシュ³¹に成功したしました。 CAAXは、farnesyltransferasesやgeranylgeranyltransferasesなどの翻訳後修飾酵素によって認識されるモチーフです。これらの酵素による修飾は、タンパク質は、このように細胞膜^35を標識^する 、膜結合になることが。

ゼブラフィッシュでの使用前に、このプロトコルは、クロマチンと細胞膜を標識するためにH2A.F / ZとCAAXを使用することにしました。この方法の適用は、個々の染色体を観察するために、研究者は、個々の細胞レベルで有糸分裂を監視することができますダイナミクスは、だけでなく、同​​時に組織分化と発達に影響を与える可能性のある複数の細胞分裂を監視します。この記事では、個々の細胞レベルでの有糸分裂の際に染色体の分離のダイナミクスを画像化に焦点を当てます。この原稿の中に、いくつかの有糸分裂を観察する分割時間を計算し、有糸分裂の表現型を解読する能力が示され、説明されます。これらのパラメータを用いて、生理学的に関連するデータを収集することができ、有糸分裂の欠陥の影響を受け、いくつかの疾患状態に適用されます。

プロトコル

1. in vitro転写

1. 酵素^31を消化NotI制限によってPCS2-H2A.F / Z-EGFPおよび/ ​​またはPCS2-mCherryを-CAAXベクトルを線形化。 インビトロ転写キットに RNAを用いて、製造業者のプロトコールに従って、各テンプレートから5 'キャップされたmRNAの産物を生成します。
2. 精製キットを用いてキャップされたmRNAを精製します。製造元の指示に従ってください。 RNaseフリーのH ₂ Oで溶出
3. 分光光度計を用いて260 nmの吸光度によってRNAの濃度を決定します。 （OD ₂₆₀のx希釈×40 / mlの）。
4. 各H2A.F / Z-EGFPおよびRNaseフリーH ₂ OでmCherryを-CAAXのためμL/ 100 ngのにRNAの希釈RNAの濃度が低すぎると、蛍光が減少または存在しないことになります。明るいサンプルは、光毒性および光退色に対する懸念を軽減します。一方、あまりにも多くのRNAは有毒であることおよび/またはオフターゲット効果を引き起こす可能性があります。
   注：残りの保管-80℃の冷凍庫で精製したmRNA。

2.ゼブラフィッシュの繁殖、胚コレクション、およびmRNA注入^36-38

1. 二つの領域にタンクを分離し、ゼブラフィッシュの施設で使用される養殖システムの水でそれぞれ飼育タンクを埋めるために障壁と繁殖タンクを組み立てます。
2. 不時の繁殖を防ぐために、飼育前夜反対側の障壁と二人の女性の魚の片側に2男性の魚を置きます。
3. 翌日、氷の上に先に調製したmRNA混合物を解凍。新鮮な養殖システムの水で飼育水槽内の水を交換し、障壁を取り除きます。障壁が引っ張られた直後、28.5°Cに射出成形金型を温め、マイクロインジェクションのための機器を設定します。
   注：射出成形金型については、ゲルラッハ³⁶を参照してください。
4. 茶こしを使って15分とEとのきれいな100×15ミリメートルペトリ皿に卵をすすぐ - 卵ごとに10を収集3ブルー（5のNaCl、0.17のKCl、0.33mMのCaCl ₂を、0.33 mMのMgSO ₄を、10 ^-5％メチレンブルー）。 E3ブルーは、真菌の増殖を防止し、仔魚の適切な発展を確実にするために使用されます。交配と胚コレクションの詳細については、ゲルラッハ³⁶とPorazinkski ³⁷を参照してください。
5. 埋め込 ​​み1セルは、温めた射出成形金型に胚を上演し、胚の所望の量（ 図1A）に卵黄の中にRNAを注入します。実験に必要とされるよりも15％以上の胚の胚性注射を行うことで、自然胚の死と未受精胚のためのアカウント。ゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクションに関する詳細については、ゲルラッハ³⁶とPorazinkski ³⁷を参照してください。
   注：mRNAの初めての使用のためには、前5D撮影を行うには（5 DPFまで肉眼発達障害と定義される）蛍光および生存のために最適な用量を決定するために、用量曲線分析を行います。 150から200 ngの/μlの胚に注入は、したがって、それは最終濃度ための良い出発点であり、多くの場合、最適な濃度です。
6. 慎重に修正された9「ガラスパスツールピペットを用いて、金型から注入された胚を抽出します。ピペットを変更するには、それがボールを形成するまでブンゼンバーナーを使用して、エンドを溶かします。
7. 100×15ミリメートルのペトリE3ブルーディッシュと28.5℃のインキュベーターに家に注入された胚を置きます。
8. 六時間の注射後、プレートから任意の死亡または未受精胚を削除し、クリーンE3ブ​​ルーを追加します。 28.5℃でのハウスは、胚。

3.イメージングのためのライブゼブラフィッシュ胚（図1B）の調製と埋め込み

1. 撮影前の2時間は、蛍光解剖顕微鏡を用いてGFPのための注入された胚を選別します。 E3ブルーと新しい100×15ミリメートルペトリ皿に明るい緑色のGFP発現胚を置きます。
2. アガロースE3ブルー100mlに低融点1gを添加することによって、1％低融点アガロースのストック溶液を沸騰。アガロースを使用した後、アルミホイルでフラスコを覆います。原液は、1ヶ月までのために有用なままです。
3. 17×100mmの培養チューブに小分けした溶融寒天の3ミリリットルを。使用するまで42℃の水浴中で培養管を配置することによって、アガロースを暖かく保ちます。ゼブラフィッシュ胚^36を麻酔するために、脱イオン水で15 mMのトリカイン溶液を調製します。
   注：以前の時点で撮像が望まれる場合、寒天の濃度は^0.3％39限り低く低下させることができます。
4. 15 mMのトリカイン、スクリーニングの胚、低融点アガロース、E3ブルー、および解剖光顕微鏡に35ミリメートルのカバーガラス底の培養皿を持参してください。慎重に＃5ピンセットで胚の絨毛膜を除去します。 3胚のためにこれを行います。
5. 麻酔する別の容器にdechorionated胚を置きます。カバーガラスボトムディッシュの蓋は、多くの場合、この目的のために使用されます。トランスファーピペットを用いて、3滴（約150μl）を追加15 mMのトリカインの5ミリリットルE3青（カバーガラスボトムディッシュの蓋を使用している場合）または胚が十分に麻酔をかけてきたまでの一品に。 1％溶融アガロースチューブに15 mMのトリカイン溶液を - （200μlの約150）また、3-4滴を追加します。
6. カットオフピペットチップから1cmとP200のピペットを用いて、カバーガラス底皿に麻酔胚を移します。余分なE3ブルーを削除：トリカインソリューション。
7. 胚が誤ってお互いに近いドリフトしないことを保証するために別々の各ドロップを保ち、胚を超えるトリカインソリューション：低融点アガロース10μlの - ゆっくりと5を追加します。
   警告：アガロースがあまりにも暖かくている場合、それは胚を損傷します。寒天を維持するために良好な温度は42℃です。
8. 21 G 1½針を使用して、静かに所望の位置にアガロースで胚を向けます。タイムラプスイメージングのための倒立顕微鏡を使用する場合、possibなどのカバーガラスに近い関心領域（ROI）を配向ル。
   注意：一般的な目的のために、テール領域が比較的薄い組織（ 図1A）に配向し、明確化のしやすさを提供しています。そのような卵黄フィン折り目を囲む上皮層などの他の組織は^、28,29を使用することができます。これらの組織は、しかし、これらの領域がわずか数細胞層の厚さ、偉大な明快さを提供しています。このプロトコルのためには、できるだけ多くの細胞分裂を取得するテール領域画像に有益です。
9. 寒天の部分凝固のためのいくつかの分を許可します。その凝固をテストするために、寒天の小片を分割するために針を使用してください。寒天の片が落下から引き離すことができた場合、次のステップに進みます。
10. 低融点寒天が埋め込まれた胚の上にドームを形成すると全体カバースリップをカバーしています。寒天は、共焦点画像（ 図1A）のための皿を移動する前に固化することを可能にします。
11. 寒天凝固過程（約10分かかります）中に3mlのO調製（約250μl）を15 mMのトリカインの5滴とF E3ブルー溶液は、撮像中に埋め込まれた胚の上に配置されます。

ライブゼブラフィッシュ胚^40,41の4 5D共焦点イメージング

注：他の共焦点システムを使用して5D撮影を行う方法の詳細については有賀⁴⁰とオブライエン^41を参照^してください。 Z-intervalには、Zスタック、Z深度、時間間隔、および5Dの定義は、 図1Cを参照してください。

1. イメージングソフトウェアを開き、60X NA 1.4対物レンズに顕微鏡を設定します。対物レンズにイマージョンオイルを塗布し、顕微鏡ステージ上にスライドホルダーに培養皿を置きます。軸コントローラを使用して、対物レンズの上に興味のある胚を中心と培養皿を満たすために上向きの対物レンズをもたらします。
2. アイピースのアイコンをクリックして、顕微鏡でGFPフィルターに切り替えます。 ROIに焦点を当てています。 Oカバーガラスに最も近い組織になります着目最良の撮像結果ffer。
3. インターロックを外します。 （ソフトウェアで予め設定された波長）GFPとmCherryをチャンネルを選択し、通常のオプションを平均ラインを設定します。
4. A1スキャン領域のツールを開くには、「表示/取得コントロール/ A1スキャン領域」コマンドを使用します。
5. スキャンを開始します。スキャン領域を可能なゼブラフィッシュの限りで満たされているように、軸コントローラを使用して、胚を置きます。レーザー出力は、この時点で最適である必要はありません。不要な光退色を避けるために、レーザーパワーを下げます。
6. ND取得コントロールパネルを開くには、「表示/取得コントロール/ ND取得」コマンドを使用します。
7. Z-スタックパラメータを設定するためにスキャンを開始します。細胞は、もはや表示されている場所へのZ-スタックセルにフォーカスがないどこに上限値と下限値を設定します。イメージング分野に拡張してもよい成長と細胞運動のためのサンプル上記3μmの空間を可能にします。このプロに示す数値のためのZスタックトコールは、胚の尾部に40ミクロ​​ンのZ深さをカバーしました。
8. 2μmのZ-間隔のステップサイズを設定します。平均すると、細胞は直径が10μmです。したがって、2μmの各セルのために分析されるイメージングデータの5区間を生成します。
   注：取得することができる画像の深さはZ間隔に依存します。 Zの解像度が可能（大Z-深さ）などの有糸分裂を受けて、多くの細胞として画像化するためにZ次元での全体的な深さを得るために犠牲にされています。逆が真であるZ深さを（小Z深度）犠牲にしながら、その中に、ステップサイズを小さくすることにより、Z分解能が得られます。
9. 画像レーザパワー、HVを調整し、レベルを相殺しました。このプロトコルで実証実験のために、以下のレーザーパワー、HVを使用し、GFPチャネルに対して、それぞれ、対応するレベルで設定レベルをオフセット。 5、120 - - 2 140、および-11 -9。 mCherryをチャネルに対して、それぞれ、次のレーザパワー、HVを使用して、レベルをオフセット。 3から6、120から140、および-3へ-8。パラメータを設定したら、サンプルの光毒性および光退色を引き起こす可能性があり、不必要なレーザー露光を防止するためにスキャンを遮断してください。
10. 2倍のライン平均のアイコンを選択します。 「いいえ、平均は「大幅に」平均4倍のラインが「スキャン時間を増加させながら、粒子の粗い画像を生成しません。 2倍のライン平均を使用すると、最高の画質と最速のスキャン時間を提供します。
11. 実験のために必要な適切な時間間隔と持続時間を選択します。野生型分割のために、2時間2分の時間間隔は、（ 図1、図2、図3A、および図3Bにおいて使用される）、有糸分裂の持続時間を決定するのが最良です。より長い30分間紡錘体チェックポイントを活性化部門は、図3Cに示されているように、蛍光を維持するために4つの時間、5分間隔のために適しています。
12. 「ファイルに保存」ボックスをチェックし、それが取得されているときに自動的にファイルを保存するファイルに名前を付けます。すべてのPAダブルチェックラメータが正しく設定され、「実行を開始「ヒットしています。
13. 買収は、3次元形式でファイルを表示するには、完了すると、ボリュームのしきい値アイコンをクリックしてください。

結果

図2は、AB、野生型ゼブラフィッシュテールの広視野ビューを使用して、多くの細胞分裂を観察する能力を示しています。 7上の有糸分裂細胞は、14分間の時間枠（ 動画1）に結像されます。 2時間の時間経過の中で、40以上の有糸分裂のイベントが捕捉しました。平均して、50分裂する細胞は、ABとAUR Bは^{M / m個の}胚（ 図2B）で30分裂細胞で観察されました。撮像された細胞の数を考慮して、撮像された細胞の数に有糸分裂細胞の割合は、（ 図2C）を算出しました。このデータは、AURのB ^{/ M胚}において有糸分裂を通過する細胞のより低い数（ 図2B）が、撮像される細胞の少ない数が存在しないことを示唆しています。このようなイベントの統計的に有意な数を取得する能力は、統計的検出力に役立ちます。

...

ディスカッション

この方法を使用すると、1が生体内および時間依存的に二つの新しい細胞を形成するために核エンベロープの崩壊、微小管動原体の添付ファイルによって中期板の形成、及び姉妹染色分の分離を推測することができます。細胞は天然の生理学で撮像されているので、ゼブラフィッシュで有糸分裂を観察する能力は、固定サンプル、細胞培養系に比べて有利であり、組織は、使用する蛍光タンパク質を可能にする透明であり、それらが比較的速く開発し、タイムラプスイメージング取得することができます。このプロトコルのための大人のゼブラフィッシュの使用は、皮膚や目ではない厚い組織のために取得することができる限られたZ-深さに制限されています。 H2A.F / Z-EGFPおよびmCherryを-CAAXを発現するトランスジェニック動物は、同じ目的のために使用することができるが、異なる変異体ゼブラフィッシュへのmRNAの注入の汎用性と使いやすさは、遺伝的交雑よりも有利です。有糸分裂の分析である状況で3日後に受精（DPF）以降の胚に必要な、トランスジェニック動物が原因で、この急速に発展する生物におけるRNAの半減期に必要であろう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pCS2ベクター	K. Kwan		目的のプラスミド用
NotI-HF制限酵素	New England BioLabs	R3189S	プラスミドの制限消化用
mMessage SP6キット	Life Technologies	AM1340	in vitro転写用
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	mRNAの精製用
100 x 15mm ペトリ皿	フィッシャー科学	FB0875712	胚を収容するため
マイクロインジェクション金型	自家製		マイクロインジェクション中に胚を保持するため
アガロース II	アムレスコ	0815-25G	胚の埋め込み用
トリカイン	Sigma-Aldrich	E10521-10G	胚の麻酔用
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9888	UltraPure H2O 塩化カリウムに溶解した胚水(E3 Blue
			の場合 UltraPure H2O
カルシウム二水和物			E3 Blue)の場合、UltraPure H2
Sulfate	Fisher Scientific	M7506に溶解した胚水(E3 Blue)の場合	胚水(E3ブルー)用、UltraPure H2O
メチレンブルーハイドレート	Sigma-Aldrich	MB1	胚水(E3ブルー)用、UltraPure H2O
100 mm培養チューブ	に溶解 フィッシャーサイエンティフィック	50-819-812	溶融寒天用
35 mmガラスカバースリップ底培養皿	MatTek Corp	P35G-0-20-C	No.0 20 mmガラス 胚埋め込み用
#5ピンセット	デュモン	72701-D	胚の解剖用
21 G 1 1/2ゲージ針	ベクトン・ディキンソン	305167	寒天に胚を配置するため
解剖顕微鏡	ニコンAZ100		胚のスクリーニングと埋め込みのために、どの解剖スコープでも共
焦点顕微鏡	ニコンA1+		タイムラプスイメージング用
共焦点ソフトウェア	NIS Elements AR 4.13.00		画像の取得と処理用

からの贈り物 ) 塩化に溶解した胚水(O Magnesiumに溶解 を行います