蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列その場でハイブリダイゼーション（FISH）線虫（Caenorhabditis elegans）

Summary

私たちは、反復配列の観察と定量化のために、線虫Caenorhabditis elegansの生殖腺と胚における蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の簡潔な手順を報告します。 私たちは、テロメアリピートとテロメアの代替的延長のテンプレート(TALT)という2つの異なる反復配列の観察と定量化に成功しました。

Abstract

テロメアは、染色体の末端を異常な融合と分解から保護するリボ核タンパク質構造です。テロメアの長さは、テロメラーゼまたはテロメアの代替延長(^{ALT)として知られる}代替経路によって維持されます1。最近、C.エレガンスはテロメアとALT2の研究のための多細胞モデル生物として浮上しています。ゲノム内の反復配列の可視化は、テロメアの生物学を理解する上で非常に重要です。テロメアの長さは、テロメア制限フラグメントアッセイまたは定量的PCRで測定できますが、これらの方法では平均化されたテロメアの長さしか得られません。それどころか、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、細胞内の個々のテロメアの情報を提供することができます。ここでは、蛍光in situハイブリダイゼーションによりC.エレガンスのテロメア長を決定する方法のプロトコルと代表的な結果を提供します。この方法は、形態に目立った損傷を引き起こさない、シンプルでありながら強力なin situ手順を提供します。蛍光標識ペプチド核酸(PNA)とジゴキシゲニン-dUTP標識プローブを用いることで、C.エレガンスの胚と生殖腺におけるテロメアリピートとALT(TALT)のテンプレートという2つの異なる反復配列を可視化することができました。

Introduction

テロメアは、異常な融合と分解か​​ら染色体末端を保護します。哺乳類テロメアは、Gリッチ六量繰り返し、TTAGGG、およびshelterin複合体で構成されています。線虫のテロメア反復配列は、哺乳動物（TTAGGC）のものと同様です。ほとんどの真核生物は、それらの染色体の末端にテロメアリピートを追加するには、テロメラーゼを利用します。しかし、10 -癌細胞の15％がテロメアの代替長くする^（ALT）3として知られているテロメラーゼ独立した機構を利用します。以前、我々はテロメアとTALTという名前のその関連配列は、重要な無菌性^2を生き延びテロメラーゼ変異系統のテロメアで増幅されたことを報告しました。

テロメア長は、定量的PCRにより、または合計テロメア^4,5,6,7-の平均長さを提供し、サザンブロットによって測定しました。全ゲノム配列データにテロメアリピートの回数を読むまた、全テロメア内容⁸の指標です。罪が、GLEテロメア長解析（STELA）は、それがテロメア⁹の空間的な情報を提供することができない、単一のテロメアの長さを提供することができます。 POT-1 :: mCherryをレポータータンパク質が生体内でテロメアの空間的な情報を提供していますがPOT-1は、タンパク質^10を結合一本鎖テロメアであるとして、それは、二本鎖テロメアの長さを表すことはできません。

上述の方法は、反復配列の平均の情報を提供するが、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体規模量、対象の個々の配列の空間的なパターンを観察することができます。代わりにDNAの精製、組織または細胞は、FISHにおける天然の空間情報を保存するために固定されています。このように、FISHは、テロメアリピートなどの個々の反復配列の観察のための定量的および定性的な両方のツールです。

このプロトコルは、両方のteloの同時検出のための効率的な方法を提供します前述の方法^11,12からの改良に基づく単なるおよびその他の繰り返し。C.エレガンスの幼虫や成虫は非常に分化した細胞と多細胞生物です。細胞の不均一性は、テロメアスポットの多数の定量分析に妨げます。分析した細胞の数を最大にするために、胚を単離し、FISH用ポリリジン被覆スライド上に広げています。また、このプロトコルは、免疫蛍光法と組み合わせることができます。

プロトコルが動作していることの証明として、我々は、2つの異なる反復配列を観察し、定量化することが可能であることを示します。 TALT1に対するDNAプローブは、ジゴキシゲニンdUTPをを取り入れたシンプルなPCRで生成しました。このTALT1プローブおよび蛍光標識されたテロメアPNAプローブを同時にハイブリダイズさせました。その後、ジゴキシゲニンは、標準的な免疫蛍光法によって検出しました。ここではTALT1はTRT-1にテロメアと共局在代表画像を提示します生存者。

Protocol

PCRによりジゴキシゲニンdUTPで1標識プローブ

1. 以前に^13を説明したようにジゴキシゲニンdUTPをを含む10×dNTPミックスでPCRラベリングを行います。
2. 製造者の指示に従ってスピンカラム精製を用いてPCR産物を精製します。
   1. プローブはより短い200bpのであれば、反応混合物からのスピンカラムクロマトグラフィーではなく、スピンカラム精製で無料ジゴキシゲニンdUTPをを削除します。

2.準備ポリリジン被覆スライド

注：全体の手順は、約2時間かかります。ステップのほとんどは、乾燥工程を除いて、室温で行われます。

1. スライドのクリーニング
   1. プラスチック容器にスライドを置き、簡単に蒸留水（DW）でスライドをすすぎます。水を除去し、1％のガラスクリーナーを含むDWで容器を満たします。
   2. 室温（RT）で50 rpmで15分間スライドを攪拌します。 DW 3でスライドを洗浄室温で5分間、回。
   3. 攪拌しながら15分間、70％エタノールでスライドを洗浄します。 70％エタノールを捨て、15分間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを配置します。
2. マルチウェルガラススライドのポリリジンコーティング
   注：それは染色手順を通じてサンプルの接着性を提供するので、スライドガラスのポリリジンコーティングは、重要なステップです。不十分なコーティングされたスライドは、サンプルが失われます。
   1. 蒸留水で（w / v）の0.01％にポリリジン原液を希釈します。きれいなガラススライドのウェルにポリリジン（w / v）の希釈した0.01％の20μLを加えます。
   2. 室温で5分間、ガラススライドをインキュベートします。
   3. 1時間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを置きます。
   4. 埃ボックスにポリリジンスライドを保管してください。

スライドガラス上のワームの3.固定（図1）

1. FISHのための準備胚
   注：収穫のワームをすべてト​​ンの前に彼細菌食品は、顕微鏡下で増殖培地を見て消費されます。飢餓は、成虫の産卵を低減し、卵の孵化を増加させます。詳細な方法は^、14,15に記載されています。
   1. 標準的な方法¹⁴に従って50ミリメートルペトリ皿にワームを育てます。
   2. すべての細菌の食物が消費された後、スパチュラで四半期の寒天培地をカット。汚染を防止するために切断する前へらを滅菌します。
   3. 100ミリメートル線虫の増殖培地（NGM）プレート上の寒天のすべてのピースを置きます。新鮮な細菌性食品に到達するためにワームのために逆さまに寒天片を回します。
   4. 48〜72時間後、M9バッファーでワームを収集します。 NGMプレート上のM9緩衝液5ml - 3を追加します。ワームを洗浄するNGMの表面上にピペットM9バッファー。
   5. ワームと液体を収集し、15mlチューブに追加します。
      注：30％ショ糖溶液中での収穫、遠心ワーム後の寒天の破片がある場合。破片をペレット化しているが、ワームは、上のフロート表面。
   6. 15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。 3分間300×gで遠心分離することによってワームをペレットし、M9バッファーの大部分を除去。このステップをさらに2回繰り返します。
      注：ワームはまだ遠心分離後、浮遊している場合は、値= 1に遠心分離機のブレーキレベルを設定します。
   7. 吸引しM9バッファー。ワームに漂白液を追加します。ワームの0.5ミリリットル当たり、次亜塩素酸の2ミリリットルをDWの6.5ミリリットルを追加し、5 M KOHの1ミリリットル。
   8. 50 rpmで3分間室温で揺らしながらワームをインキュベートします。 15秒間ボルテックスワームは、機械的にワームをせん断し、卵を露出させます。
   9. 漂白時に解剖顕微鏡下で管を観察します。ワームは半分に切断され、卵が放出されていることを確認します。成人の体のほとんどが解散されたときは、15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。
   10. 3分間300×gで遠心分離します。吸引しM9の大部分を、15 mlにボリュームを構成するために、新鮮なM9バッファーを追加します。繰り返し洗浄ステップ3回。
       注意：彼らは漂白工程を妨げるとして、ワームの過剰な量を使用することは避けてください。未満8分洗浄まで、全体的な反応時間をおいてください。過漂白卵は強い自家蛍光を生成します。
   11. 200μlの2％PFAを行うための4％パラホルムアルデヒド（PFA）を200μlまでのポリソルベート20（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水を加えます。
       注意：PFAは発癌性であるため、PFAを使用する前に、防護服、手袋、アイシールドを着用してください。
   12. ポリリジンコートスライドのウェルに2％PFAで卵の40μLを加えます。
   13. 加湿チャンバー内でスライドを置き、RTで15分間インキュベートします。スライドを内側に配置された直後の湿潤チャンバーを閉じます。
       注：固定された状態で卵がスライドの底に沈みます。
2. FISHのための解剖生殖腺の準備
   1. 収穫成虫はM9緩衝液1mlをピペットで50ミリメートルNGMプレート上で増殖させました。細菌性食品の前に収穫ワームが枯渇しています。
   2. 任意の細菌のウィットからワームを洗いますH M9緩衝液、2回。
      注：残留細菌はポリリジン被覆スライドに付着解剖生殖腺を妨害し得ます。
   3. 300×gで遠心分離することによりワームをペレット。 M9を取り外し、マイクロピペットによって空のNGMプレートにワームを転送します。
   4. ポリリジン処理したスライドのほかに2mMのレバミゾールを含むM9緩衝液30μlを追加します。
   5. 1ミリリットルチューブにM9バッファー500μlのを追加します。口のピペットでワームを転送するために、このバッファを使用します。
   6. M9緩衝液を含む1mLのチューブに毛管を配置することによって、M9緩衝液で口ピペットの先端を満たします。
   7. ワームの頭が口のピペットに入るように解剖顕微鏡下で、ちょうど大人のワームやドラッグ口のピペットの頭の前で口のピペットの先端を置きます。ワームのヘッドが先端に入ると、ワームの本体全体をチップ内に描画されます。
   8. 口のピペットを用いて、ポリリジンコートスライドにワームを転送します。
   9. のかみそり、カットを使用して、頭やスライド上のワームの尾の先端F。ワームが切断されると、生殖腺が飛び出します。生殖腺は、スライドに固執します。
      1. 1つのウェル中に少なくとも30ワームを準備します。複数のウェルをさらに30ワームのために使用することができます。
   10. 加湿チャンバー内でスライドを入れて、口のピペットでM9バッファーを吸引します。
   11. 加湿チャンバー内で室温で15分間2％PFAを20μlを添加することにより、サンプルを修正してください。

4.固定および透過処理

1. ドライアイス上にアルミニウムブロックを配置し、ディープフリーザーに保管（-80°C）。 -20℃に保管し、メタノールおよびアセトン。
2. PFA固定工程3.1.15または3.2.11た後、固定液の〜5μLを残しマイクロピペットを用いて固定液を除去します。
3. 試料スライド上の別のポリリジンコートスライドを入れてください。解決策が過剰である場合はペーパータオルで固定液を除去します。彼らは一緒に立ち往生しているしたら、スライドを移動しないでください。
4. スライドを凍結少なくとも15分間、アルミブロック上。
   注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。
5. スライドが凍結されている間、氷上で冷メタノールおよびアセトンを含むjarを置きます。
6. スライドを取り出し、サンプルを凍結クラックするためにそれらをねじります。上部のスライドを捨てます。すぐに5分間氷冷メタノール中にスライドを浸します。
7. 5分間氷冷アセトンにスライドを転送します。
8. 残留固定剤を除去するために、5分間、スライドをPBSTで3回洗浄します。次のステップに進むか、4℃で、100％エタノールでスライドを保存します。
   注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。

固定された細胞の5ハイブリダイゼーション

1. （PBSTはを10μg/ mlのRNase Aを含む）のRNase溶液20μlを追加します。 37℃で1時間湿潤チャンバー内のスライドをインキュベートします。
2. 15分ごとに（2×SSCT）ポリソルベート20で2回生理食塩水とクエン酸ナトリウムで二回スライドを洗浄します。
3. 20を追加します。ハイブリダイゼーション溶液μlの37℃のインキュベーターで加湿チャンバーを置きます。 1時間後、ピペッティングによりハイブリダイゼーション溶液を除去します。
4. ハイブリダイゼーション溶液を取り外す前に、プローブを準備します。プローブが二本鎖DNAである場合、乾燥ブロック上95℃で5分間加熱することにより、プローブを変性させます。加熱後、簡単に氷の上にプローブを冷却します。
5. サンプルにプローブを含むハイブリダイゼーション溶液10μlを加えます。 2,000及びDIG標識プローブのための、1の比率で使用濃度：200 PNAプローブ、1の比で使用濃度について。カバーガラスでサンプルをカバーしています。
6. ヒートブロック（80℃）で水に浸した紙タオルを置きます。湿度と温度を維持するためにヒートブロック上のプラスチックの箱のカバーを置きます。
7. 加熱ブロックの温度（80℃まで）安定した後、加熱されたペーパータオルの試料スライドを配置し、プラスチック製の箱のカバーを有するサンプルをカバーします。 3分間サンプルを変性。
8. 株式会社一晩37℃で湿潤チャンバー内のスライドをubate。

6.洗浄および免疫蛍光

1. 37°Cへのハイブリダイゼーション洗浄溶液（2×SSC、50％ホルムアミド）をウォームアップ。
2. 室温で5分間二回PBSTでサンプルを洗ってください。カバーガラスを外します。
3. 30分間、37℃でハイブリダイゼーション洗浄溶液中で試料を洗浄します。
4. RTでPBSTで試料スライドを3回洗浄します。注：室温で湿潤チャンバー内の後続のすべての手順を実行します。
5. ブロッキング溶液の20μlを添加して、湿潤チャンバー中、室温で1時間インキュベートします。
6. ブロッキング溶液を外し、FITC結合抗ジゴキシゲニン抗体溶液（1：200）を追加し、室温でまたは4℃で一晩3時間。

7.取付け・観測

1. 15分間ずつPBSTで2回サンプルスライドを洗浄します。
2. DAPIでマウント溶液10μlを加えます。カバーガラスとプレスを静かに置きます。余分な溶液を除去しますペーパータオルで。
3. 取付溶液の蒸発を防ぐために、マニキュアでカバーガラスのエッジをシール。
4. 共焦点顕微鏡下で観察します。高いバックグラウンドを持つ胚を除外します。 20核 - 4でフィールドに焦点を当てています。
5. 100X対物レンズで、製造元の指示に従って画像を撮影します。
   注：FITCのための488nmレーザーで、Cy3のための555 nmレーザーで、DAPI用の405 nmのレーザーを試料にエキサイト。

テロメアシグナルの8定量

注意：以前に¹⁶記載のように定量化が行われました。比較されるすべての画像は、露光時間と光源を含む同じ設定で撮影する必要があります。

1. tifファイル形式で画像をエクスポートします。
2. 画像解析ソフトウェアをダウンロードし、インストールします。
3. 画像解析ソフトウェアを実行し、ボタンを同意する]をクリックします。
4. オープンボタンをクリックします。イメージファイルをダブルクリックすることにより、テロメアFISHで画像を開きます。
5. クリック[編集] - [選択処理領域]、左クリックしてドラッグすることで、目的とする選択領域。すべての非特異的な染色を除外します。
6. [対策]をクリックして - 、[光学密度を見つけ]テロメア信号とチャンネルを選択し、.txtファイルに結果を保存するファイル名を入力します。
   注：結果の列の順序は、次のようにスポットの蛍光、スポットとスポットのエリアの背景強度を。
7. 値をコピーし、スポットの蛍光からのスポットのバックグラウンド強度を差し引きます。値は、現在、統計的に分析することができます。

Results

これは、以前にALTの生存者は、内部ローカライズ」ALTのテンプレート「テロメア維持²用（TALT）配列を複製することによって、低周波では、テロメラーゼ欠損変異体、TRT-1（ok410）から出てくることが報告されました。 PNAプローブを使用して、我々は解剖生殖腺（ 図2A）にテロメアを可視化することができました。かすかなテロメア信号は、TRT-1（ok410）とALTの生存者の両方で検出されました。ファジー信号は、それらが自家蛍光ではないかもしれないことを示唆している、唯一のDAPIと重なりました。間質テロメア様反復（ITR）は、一貫してCの研究にTRFアッセイで観察されますエレガンステロメア^4,10。 PNAプローブの高い特異性を考慮すると、それらは、ITRは、ゲノム全体に分散される可能性があります。

Discussion

私たちのプロトコルの主な利点は、細胞構造の形態に目立つダメージのない手続きの簡単さです。いくつかのステップは、C。のために最適化されましたこのプロトコルでFISH エレガンス 。成功FISHのための重要なステップは、プローブのラベリング、胚および浸透の固定を含みます。ジゴキシゲニンdUTPを標識方法は、PCRまたはニックトランスレーションにより使いやすい標識法を提供します。長い標的配列にラベルを付けるには、ニックトランスレーションが好ましいです。この場合、プローブは、プローブの侵入を容易にするために、適切な制限酵素で消化されるべきです。ビオチン標識プローブは、細胞質からのバックグラウンド信号を過剰に産生されているためビオチン-dUTPタグは推奨されません。内因性ビオチンブロッキング試薬が市販されているが、それは行われませんでした。

このプロトコルは、効率的な定量化のための細胞の密度を増加させるために、単離された胚を使用します。 Cの腸内核。エレガンスは、サイズが大きく、過剰な数と体細胞核の残りの部分に比べてテロメアスポットの強度...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNAプローブ	PANAGENE	カスタムオーダー
抗ジゴキシゲニン-フルオレセイン、Fabフラグメントロ	シュ	11207741910	PBSTで希釈した1:200を使用
ゴキシゲニン-dUTP	ロシュ	11573152910
ウシ血清アルブミン	SIGMA-ALDRICH	A-7906
パラホルムアルデヒド	SIGMA-ALDRICH	P-6148	数滴のNaOHを含むDWで加熱することにより、4%パラホルムアルデヒドを調製します。0.1ボリュームの10x PBSを追加します。
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton溶液			3x SSC、50% ホルムアミド、10% (w/v) デキストラン硫酸塩、50 μg / mlヘパリン、100 μg/ml 酵母 tRNA , 100 μg / ml超音波処理されたサケ精子DNA
ハイブリダイザイトン洗浄液			2x SSC、50%ホルムアミド
ホルムアミド	BIONEER	C-9012	有毒
メタノール	カルロエルバ
アセトン	カルロエルバ
ヘパリン	SIGMA-ALDRICH	H3393	は、ストック溶液デキストラン硫酸塩のために10mg / mlを作ります
	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			1 L DW 用 : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O、2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS、0.1% tween-20
ポリソルベート 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	商品名はTween-20
Poly-L-Lysine溶液(0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	M9
			を使用する前に新鮮な0.01%w/v溶液を準備します3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4、H2O to 1 L
漂白液			20% 次亜塩素酸ナトリウム、 0.5 M KOH
抗体バッファー			1x PBST、1 mM EDTA、0.1% BSA、0.05% アジ化ナトリウム (毒性)
ブロッキング溶液			5% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む抗体バッファーillustra
Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			1 L を作るには、1 L で 175.3 g の NaCl、88.2 g のクエン酸ナトリウム、H2O から 1 L、 pHを7.0に調整
2x SSCT	2x SSC
10x ジゴキシゲニン-dUTPミックス			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR精製カラム	Cosmo genetech	CMR0112
ガラスクリーナー / ULTRA CLEAN	Dukssan 純薬品	8AV721
マルチウェルスライドガラススライド	MP バイオメディカル
線虫増殖培地			1 L、NaCl 3 g、寒天17 g、ペプトン2.5 g、H2Oを974 mlに作製します。1 mLの1 M CaCl2、4 mg/mlコレステロール1 mLをエタノールに浸し、1 mLの1 M MgSO4、25 mlの1 M KPO4を加えます。
、Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100Xを使用しました。
湿ったチャンバーDW			に浸したペーパータオルで満たされたプラスチックボックス
	ピーター・ランズドープ博士	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502