エタノールへのリグノセルロースの生物変換のための堅牢なペントース発酵酵母の進化のための技術

Summary

適応進化と分離技術は、ヘキソースおよび酵素でペントース混合糖がundetoxified加水分解物を糖化し、40以上のグラム/ Lのエタノールを蓄積するために急速に消費することができますScheffersomyces stipitis株NRRL Y-7124の誘導体を得るために説明し、実証されています。

Abstract

リグノセルロース系バイオマスは、燃料グレードのエタノールやその他のバイオ製品の生産に役立つ、豊富で再生可能な原料です。前処理と酵素糖化プロセスにより、酵母で発酵できる糖が放出されます。従来の工業用酵母はキシロース(植物糖の最大40%を占める)を発酵させず、濃縮加水分解物では機能しません。濃縮加水分解物は、経済的なエタノール回収をサポートするために必要ですが、前処理中に発生する有毒な副産物が多く含まれています。無害化法は加水分解物を発酵可能にすることができますが、コストがかかり、廃棄物処理の負債が発生します。ここでは、適応進化および単離技術について説明し、不利な培養条件にもかかわらず、加水分解物を経済的に回収可能なエタノールに効率的に変換できる在来のScheffersomyces stipitis株NRRL Y-7124の誘導体を生成することを実証しています。改良された個体は、S. stipitis集団の自然な遺伝的多様性に依存する複数の選択圧と、エタノールまたはUV放射という2つの異なる加水分解物への曝露によって誘発される突然変異を使用して、進化する集団で濃縮されます。最終進化培養物は、優勢な分離株を回収するために希釈プレーティングされますが、進化のさまざまな段階でグリセロールで凍結された中間集団は、適切なストレス勾配を使用して選択培地で濃縮され、希釈プレーティングによって最も有望な分離株を回収します。分離物は、さまざまな加水分解物タイプでスクリーニングされ、キシロース取り込み速度とエタノール収率データの無次元相対性能指数(RPI)変換を含む新しい手順を使用してランク付けされます。RPI統計パラメータを使用して、全体的な相対性能平均を計算し、培養条件(栄養素や阻害剤が異なる)や速度論的特性などの複数の要因に基づいて分離株をランク付けします。これらの技術の適用により、親株の誘導体は、pH 5-6の酵素糖化加水分解物において、以下の改善された特徴を有しました:成長に先立つ初期遅延期の減少、グルコース-キシロース転移中のジオキシ遅延の減少、発酵速度の大幅な向上、エタノール耐性の改善、および蓄積が40g / Lまで。

Introduction

リグノセルロース系バイオマスの推定年間13億ドライトンは、エタノールの生産を支援し、米国は30％、その石油消費量を削減する可能性があります^。1グルコースとキシロースの豊富な植物バイオマス加水分解利回り糖混合物は、発酵阻害物質が必要な化学的前処理によって生成されますがヘミセルロースを分解し、酵素の攻撃のためにセルロースを露出させます。酢酸、フルフラール、およびヒドロキシメチルフルフラール（HMF）は、前処理の間に形成する多くの阻害剤の中で重要な構成要素であると考えられています。フォワードリグノセルロースエタノール産業を移動させるために、研究手順は、生存し、効率的に必要とされるそのような阻害化合物の存在下でヘキソース及びペントース糖の両方を使用するように機能し得る酵母株の進化を可能にします。例えばサッカロマイセス・セレビシエなどの伝統的な工業用酵母株、かなりの追加の弱点は、効率的にfermenできないことです植物バイオマスの加水分解物で使用可能なキシロースのt。

ピキアstipitis型株 NRRL Y-7124（5773 CBS）は、最近、名前が変更さScheffersomycesのstipitisは、よくキシロースをエタノールに発酵することが知られているネイティブのペントース発酵酵母である^。2,3ここに追求された株NRRL Y-7124の進化それが報告されているので、最適なメディアで^4,5,6。少しキシリトール副産物と40グラム/ Lを超えると経済的に回収エタノールを蓄積するネイティブの酵母株の最大の可能性を持っている、S。 stipitis株 NRRL Y-7124は0.41±0.06N・G / G、高細胞密度培養（6グラム/ L細胞）である^。7,8抵抗の収率で40時間（4 cm G / L / hr）で70グラム/ Lのエタノールを生産します発酵エタノール、フルフラールの阻害剤、およびHMFも報告されている、 ^図9およびS. stipitisは、商業規模のエタノールproductioで利用できる最も有望なネイティブペントース発酵酵母の中にランクされていますnはリグノセルロースから^。10我々の目的は、産業用途に適した株NRRL Y-7124のより強固な派生物に向かって進化を強制するために、多様なundetoxifiedリグノセルロース加水分解物とエタノールの選択圧を適用することでした。求められる改善された機能のうち、キーが濃縮された加水分解物中の速い糖取り込み率、より効率的な混合糖利用のための減少diauxy、エタノールおよび阻害剤の高い公差ました。 S.の応用undetoxified加水分解物へのstipitisは 、overlimingなどの加水分解物の無害化処理に関連した追加営業費用を排除するための研究の主要な焦点でした。

二つの工業的に有望な加水分解物は、進化を強制的に適用した：糖化アンモニア繊維拡張前処理トウモロコシ茎葉加水分解物（AFEX CSH）を酵素や酸で前処理スイッチグラスの加水分解液（PSGHL）を希薄^11,12 AFEX前処理技術がに開発されています。希薄酸前処理が最も一般的に酵素糖化用セルロース系バイオマスを露出するように練習し、現在最も低コストの技術を表しながら、発酵阻害物質の生成を最小限に抑えます。 PSGHLは、前処理後に残ったセルロースから分離可能であり、特徴的に加水分解されたヘミセルロースからキシロースが豊富ではなく、グルコースが低いです。 AFEX CSHとPSGHL組成物は、進化のプロセスを管理するために悪用された重要な側面が互いに異なります。 AFEX CSHはPSGHL（ 表1）と比較して、アミノ酸およびアンモニア態窒素源でフランアルデヒド及び酢酸インヒビターで低いが高いです。 PSGHLが優勢糖が利用可能であるキシロースの新たな課題が発生します。したがってPSGHLは、具体的には、加水分解に改善されたキシロースの利用のために利用可能な酵母の商用利用を防止弱点を豊かにすることが適切です。でもネイティブペントース発酵酵母の中で、次善の砂糖キシロオリゴへの依存SEは、細胞の成長をサポートすると修復はさらに難しいため、様々な理由のの加水分解物で次のようになります。による酸化還元不均衡への代謝に構造的完全性、および中断をセルに広範囲の損傷を引き起こす栄養不足、阻害剤⁹窒素の補給を、特にの形でアミノ酸は、発酵のためにかなりの運転コストを表すことができます。分離株のスクリーニングとランキングに窒素補給の影響は、スイッチグラス加水分解物で調査しました。

改善された個体はSの天然の遺伝的多様性に依存し、複数の選択圧を使用して進化する集団に濃縮しました2さまざまな加水分解物、エタノールまたはUV放射への曝露によって誘発される人口と突然変異stipitis。選択圧は、Sの進化の進行状況を調査するために並列に直列に適用されました成長し、加水分解において効率的に発酵することが目的のデリバティブに向かってstipitis（ 図1）。ますます困難な加水分解物中の官能集団の反復培養は固形分20％の負荷で調製12％グルカンAFEX CSHあるいはPGSHLのいずれかの希釈系列を用いたマイクロプレートで達成しました。連続培養におけるキシロースに対するエタノールの不自由な成長のアプリケーションさらに向上AFEX CSHは、キシロース利用の抑制をエタノールに少ない感受性を実証する表現型を濃縮することにより、集団を適応しました。後者の特徴は、最近、グルコース発酵以下の菌株NRRL Y-7124によってペントース利用に問題が示された。PSGHL上の⁸濃縮は次の加水分解物の機能性を広げるために調査しました。

推定は、Sの誘導体を向上しましたstipitis NRRL Y-7124は、最も一般的な集団からコロニーを選択するストレス状態と希釈平板の下で目標と濃縮を使用して、進化過程の各段階から単離しました。無次元相対性能指数（RPIS）は、速度論的挙動は、印加異なる加水分解物の種類および栄養補助食品を評価した全体的なパフォーマンスに基づいて、歪みをランク付けするために使用しました。様々な適応手順の成功は、Sの機能性を向上させるがリグノセルロース加水分解物でstipitisが以前undetoxified加水分解物に経済的なエタノール生産を実証する菌株は、以前に報告されていない、文書化されている^。13-17進化の手順を使用して、ここでより詳細に可視化するために、Slininger ら ^18を大幅^に超える改善された株を開発します親株NRRL Y-7124とAFEXのCSHで> 40グラム/ Lのエタノールを生産し、適切な窒素源を補充した糖化スイッチグラス加水分解物（SGH）を酵素することができます。これらの新規株は、エタノール産業の発展リグノセルロースにし、追加のゲノミクス研究棟の対象として今後注目されています以前に配列決定株NRRL Y-11545のもので、図1に図解さ進化のさまざまな段階の間に生成トップの株の¹⁹ゲノミクス研究はさらに菌株改良研究の前置きとして、開発中に発生した遺伝的変化の歴史を解明することになります。

Protocol

1.アッセイのための材料および装置の起動準備

1. 進化、単独での使用とランク付け手続きの前処理反応で18〜20％の初期バイオマス乾燥重量を使用して加水分解物を準備します。 Slininger らは詳細な方法のために2015年^18進化 、単離またはランク付けに使用される窒素サプリメントN1またはN2とAFEX CSH、PSGHL、およびSGHを準備するために参照してください。各加水分解型の組成については、 表1を参照してください。
   注：窒素比（C：N）に1モルの炭素：42に要塞SGH-N1 = SGH：SGHの窒素要塞は、以下のように定義さSGH-N1またはSGH-N2と命名した尿素を含む窒素源とし、ビタミン、遊離アミノ酸定義されたソースからのカゼイン、D、L-トリプトファン、L-システイン、及びビタミンからの酸（例えば、〜モル窒素Nの15％は第一級アミノ窒素（PAN）及びであること〜Nの85％が尿素です）。 SGH-N2 37に要塞化された= SGH：1 C：最も低コストの商用ソースOなどの尿素および大豆粉とNFのアミノ酸およびビタミンは、〜PANからNの12％、尿素88％を提供します。
2. ARS・カルチャー・コレクション（農業利用研究国立センター、ピオリア、イリノイ州）から親株の凍結乾燥文化、Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124（CBS 5773）を取得し、指示通りにグリセロールストック培養を準備します。 -80℃で、親酵母および10％グリセロール中でその誘導体の保存培養を維持します。
   1. 寒天プレート酵母麦芽ペプトンデキストロース（YM）にストリークグリセロールストック（3グラム/ Lの酵母抽出物、3グラム/ Lの麦芽エキス、5グラム/ Lペプトン、10グラム/ Lのブドウ糖、20グラム/ L寒天）とインキュベート48- 25℃で72時間^。8開発のプレートは液体前培養接種材料として使用する前に4℃で一週間まで保存することができます。
3. 準備最適なミディアム（ODM）、以前に親strでキシロースからエタノールへの最適な変換のために開発された工業用製剤手順²⁰と互換性の合成培地を定義AIN Scheffersomyces（ピキア）NRRL Y-7124を^{stipitis。7、}挑戦エタノールにもキシロース給電連続培養進化を発酵性能のバイオアッセイのためのすべての前培養し、培養物中で定義された培地を使用して。 ODMの組成を表2に参考のために記載されています。
4. 前述のように^、18は 620nmの_（620）での培養の吸光度を測定するために、適宜、cuvette-またはマイクロプレート読み取り分光光度計を用いて細胞バイオマスを分析します。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはより高いスループットのために、グルコース及びキシロースのロボット酵素決意を用いて培養試料中の糖類、エタノール、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（HMF）、および酢酸を定量します。

2. AFEX CSHのシリアル転送中に堅牢なデリバティブを充実

1. 株NRRL Y-7124の前培養を接種します。 75 mlのODM + 150グラム/ LのキシロースへYM寒天から転送細胞はO下で増殖する能力を維持するためsmoticストレス。シリコンスポンジで閉じた125ミリリットルフラスコ中の前培養は、（回転数150rpm、1 "軌道）を振とうしながら25℃で24時間プラグインキュベートします。
2. 使用するために冷たい水の中に百分の6から12グルカンAFEXのCSHの凍結アリコートを解凍します。必要に応じてpHを5に調整し、フィルタの前の96ウェルマイクロプレートに希釈系列を調製する滅菌。
3. 初期吸光度（620 nm）の_620≥0.1を可能にするために、ウェルあたり前培養を数マイクロリットルの接種、その後、ウェルあたり50μlのと加水分解物希釈あたり8ウェルを有するマイクロプレートを記入してください。湿度のための湿ったペーパータオルでプラスチックの箱に25℃で静的に24〜48時間培養します。
4. 初期A _620≥0.1を達成するために、目に見えて、新しい加水分解物希釈系列の各ウェルに_620> 1、転送1-5μlに成長した最も集中加水分解物希釈を使用しました。
5. 分光光度計を用いてマイクロプレートで増殖培養A _620を監視_します。未接種の希釈系列SER対照およびブランクとしてVES。プレートの蓋は、汚染を防止するために、監視中にオンのまま、との読みがそれに応じて調整されています。
6. 定期的に改善された株のその後の単離のために、または継続的な加水分解物希釈系列をreinoculatingで使用するための適応培養物のグリセロールストックを準備します。植民地化最大の加水分解物濃度の株式、プール4つのウェル（200μl）を調製しました。 -80℃で10％グリセロール中で細胞を凍結する、クライオバイアル中の20％の滅菌グリセロールで1：1を混ぜます。
7. 12％グルカンAFEXのCSHの伸びは24時間で一貫して表示されるまで繰り返して、2.3から2.6を繰り返します。

3. AFEX CSHに濃縮した後、単一細胞トレラントデリバティブを分離

1. ストリークは_{、（620〜0.1}初期）3マイクロプレートウェルのそれぞれに3％または6％グルカンAFEX CSH（pHは5）の50μLを接種するYM寒天培地への適応培養物のグリセロールストック、及び使用のスジを選択しました。ステップ2.3のように24時間マイクロプレート培養します。プールのレプリカYMまたは6％グルカンAFEXのCSH寒天への最高の加水分解物力強い成長と強度、および希釈プレートでTE植民地化井戸。 1として、後者を準備します。フィルタの1ミックス暖かいオートクレーブし30グラム/ Lの寒天液で12％グルカンAFEX CSHを滅菌しました。
2. グリセロールストック培養として凍結し、25℃で24〜48時間のインキュベーション後に成長を示す最高希釈プレートから5単一コロニーを選択してください。ストリークYMプレートに各コロニー。 24時間インキュベート。無菌ループでは、10％グリセロールの少量に細胞の先進連勝を転送し、細胞を懸濁し、-80℃で凍結するために2-3クライオバイアルに配布するミックス。

4.親と比較するとAFEX CSHトレラント誘導体の性能を評価します

1. テストは簡単な6％グルカンAFEX CSHバッチ培養で分離さ。
   1. 48時間プレートから転送細胞は_、620 = 10. 1μlの細胞懸濁液を調製してpH 7リン酸カリウム緩衝液（0.4 mM）のグリセロールストックから画線₆₂₀ = 0.2を初期する50μlの3％グルカン加水分解物の4つのウェルのそれぞれに接種するために、各サスペンション。ステップ2.3のように24時間マイクロプレート培養します。滅菌水で3：グルカンAFEX CSH 1を12％に希釈してpHが5で3％グルカンAFEXのCSHを準備します。
   2. 転送2 24時間のマイクロプレートウェルは、完全な強さの50％で使用されるpH 5 12％グルカンAFEXのCSHの25ミリリットル前培養に接種します。 〜150rpmで（1 "軌道）、25℃にて24時間、シリコンスポンジの閉鎖と50ミリリットルフラスコ中で前培養をインキュベートする加水分解物を1希釈することにより、半強12％グルカンAFEXのCSHを準備します。滅菌水で1。
   3. ₆₂₀ = 0.1を初期と同様の25ミリリットルの成長培養液に接種するために半強加水分解前培養を使用してください。 （4.1.2）上記のように成長培養をインキュベートし、毎日（0.2ミリリットル）をサンプリングします。バイオマスの蓄積_（620）および糖と発酵生成物（HPLC）の濃度を監視します。
2. また、リピッチ（ すなわち 、収穫とreuse）8％グルカン加水分解物のバッチ培養における試験のために6％グルカンAFEXのCSH成長酵母集団、前述のように¹⁸
3. 前述したように、12％グルカン加水分解物に供給することによりrepitched 6％グルカンAFEX CSH培養物の代わりに、さらなる試験集団^。18
4. 混合糖類とODMのバッチ培養で分離株のdiauxicラグをテストします。
   1. YMグリセロールスジからループ伝達によってシリコーンスポンジの閉鎖と125ミリリットルフラスコ中の150グラム/ Lのキシロースで75ミリリットルのODMの前培養を接種します。ステップ2.1のように24時間インキュベート。
   2. ODMはpH6.5で75グラム/ Lのグルコースおよび75グラム/キシロースのLを含むと同様の75ミリリットル試験培養物を接種するために予備培養物を使用してください。 25℃、150rpmでフラスコを振ります。毎日サンプル。
   3. 初期pHをpH 6-7デュを維持するために、試験培養物中で6.0±0.2に設定されている以外は代替的に、同様のプロトコルを使用して、グルコースおよびキシロースの発酵中diauxyの0-15 G / L酢酸の影響を試験します前述のように、酢酸消費を鳴らす^。18

5.エタノールチャレンジキシロース利用のために選択する連続培養を適用します

1. 60〜100グラム/ Lのキシロース、pHは6.3±0.2で20〜50グラム/ Lのエタノールで連続培養フィード培地としてODMを準備します。 ~0.5エタノール/ gキシロースの潜在的な収量を想定150グラム/ Lのキシロースの部分的な発酵をシミュレートするために、キシロースおよびエタノールの組み合わせを選択し、50〜70グラム/ Lの発生するエタノールの潜在的に対応する^。8
2. 連続培養の接種物を調製するために、エタノールフリーODM（100グラム/ Lのキシロースの75ミリリットルに48時間YMプレートからAFEX CSHトレラントコロニー（コロニー5に類似した例では、 図1）ループにより代表を転送し、この場合には）125ミリリットルフラスコインチ25℃、24時間、150 rpmで（1 "軌道）でインキュベートする。ボリュームを保持する最初の連続培養のそれと一致するように前培養ODMのキシロース濃度を選択してください。
3. pHは6.3±0.2でのODMの連続培養保持容量はコロニー5に類似AFEX CSHトレラント分離株（ 図1の前培養濃縮物の〜5〜10ミリリットルと+ 20グラム/ Lのエタノール100グラム/ Lのキシロースを持つ接種）は、最初の_620〜0.5で100ミリリットルを得ることができます。ジャケット100 mlのスピナーフラスコ中で25℃で培養保持容積（V _R）を維持し、200rpmで撹拌し、滅菌pH電極、pH調整および温度制御循環水浴を装備。
4. 最初は、細胞増殖が原因エタノール曝露に遅くなりますので、pHが作動ポンプを使用して投薬するフィード培地を設定します。このように、さらにpH低下を停止し、培養発酵は5.4にpHが低下したときに100グラム/ Lのキシロースおよび50グラム/ LのエタノールでpH-6.3 ODMを供給するためのポンプを設定します。廃液ポンプが連続的に培養表面をスキミングで100mlにボリュームを維持します。その結果、エタノール濃度は、継続的な代謝や摂食と共に上昇します。
5. 廃液測定し、連続培養物から生細胞濃度、製品および基質の分析のためのすべての48〜72時間のサンプル（1-2 ml）を描き、前述したように^。18生細胞濃度を見つけるには、内のサンプルの連続1：10希釈液を作りますバッファ（4.1.1を参照）と拡散板YM寒天培地に希釈（1.2.1を参照）。廃液回収率（Q）に基づいて、Sの例では、希釈率（D）（Q / V _R）を計算し、そしてstipitisは、それが0から0.01時間に変え^-1。
6. 濃縮で、その時点で最も普及している堅牢な入植を表す、30から100個のコロニーを形成するバッファリングされたサンプルの希釈液の生存性プレートから単離することにより、定期的にグリセロールストックを保存します。 10％グリセロールを約5 mlの洪水プレート重複クライオバイアルの調製を可能にします。メンテナンスや休息のために、連続培養を停止し、必要に応じて最新の（耐性）グリセロールストック（複数可）を使用して再起動します。
7. 、ほとんどのストリークグリセロールストック（複数可）を再起動するにはYM寒天培地に耐性集団とは、上記のようにインキュベーションのためにエタノールフリーODMの前培養物にループによって24〜48時間細胞を移します。前培養酵母の濃縮物を使用して₆₂₀ 0.5初期するODMのボリュームを保持している100ミリリットルに接種し、フィード培地の流れが再開される前に、文化はバッチ式固定相に成長することができます。
8. 文化は0.01時間^-1のキシロース上> 25グラム/ Lのエタノールの存在下で>で着実に成長することができた場合は、低で連続培養フィード（ODM + 60 30〜50グラム/ Lの範囲グラム/ Lのキシロース+エタノール）を起動希釈率は〜0.01時間^-1ボリュームを保持100mlに（最初にODM +60 G / Lキシロース+が20g / Lエタノール）。時間が経つにつれて、50グラム/ Lに向けてフィードにエタノールを上げます。グリセロールストックでの高度な集団をキャプチャします。
   注：低希釈率を維持することは、十分に高い細胞濃度の形成は、酸素の可用性とサポート発酵を低減することができます。
9. 任意選択的に、紫外線（UV）irradiatを適用グリセロールストック集団への毎月のイオンは、連続培養をreinoculateするために使用されます。
   1. 60グラム/ Lのキシロース、および単一の滅菌フラスコ内のすべての株式をプールを備えた（前培養のように）ODM 10ml中のグリセロールストックスジからの再懸濁コロニー。わずか6 / mlのプレートを4-5ペトリ皿の底部を覆うように、約5×10 ⁸の生細胞/ mlでプールした細胞懸濁液を適用します。標準的な使い捨てペトリプレートの6ミリリットルカバレッジを得るためには、表面張力を克服し、その後9ミリリットルを除去するために15ミリリットルを分配します。
   2. 生物学的安全キャビネット内の光源からのUVする各オープン培養プレートを公開します。希望の殺傷率> 90％を得るために、UV露光時間または距離を調整します。ここでは、ソースから約56センチメートルで45分間さらします。
   3. 照射前後の板細胞懸濁液を希釈します。コロニー形成単位に基づいて推定キル率。 S.のための例をstipitis、殺虫率は〜97％でした。
   4. 箔-COVにUV-さらされた培養物（24〜30ミリリットル）を転送50ミリリットルのフラスコをered、および生存細胞の割合が小さい〜1×10 ⁸生存可能なSに再入力できるようにするために24時間25℃、150rpmでインキュベート細胞/ ml stipitis。培養物をインキュベートしている間の写真の再活性化を防止することにより、ホイルカバーが突然変異を保持します。
   5. 〜1×10 ⁷生存細胞/ mlに連続培養を接種するために再増殖突然変異を誘発文化を使用してください。選択プロセスを継続するためにエタノールに富むODM + 60グラム/ Lキシロース媒体フィードを再起動します。

6.グリセロールストック集団を評価し、エタノールの存在下で改善されたキシロース発酵を持つものを同定

1. ストリークは、エタノールの存在下でのキシロースの最高の成長と発酵のための画面の最初のステップとして、YM寒天培地にグリセロールストック培養液を選択しました。
2. 150グラム/ LのグルコースとODMで75ミリリットルの前培養にスジ寒天からスクリーニングされる各進化人口を移し、125ミリリットルのフラスコ96でインキュベート試験培養物のための接種材料として使用する前に時間。大グルコース成長集団はキシロース資化のための酵素の誘導が必要になります。
   1. 60グラム/ Lのキシロース+ 30〜45グラム/ LのエタノールODMで40の_620の初期、及び25℃でインキュベートし、30ミリリットルに細胞を懸濁、各培養を収穫、誘導をテストするには、回転数150rpm（1 "軌道）シリコンスポンジクロージャで50mlフラスコ中。HPLC分析によってキシロースの取り込みを監視するために1日2回のサンプルを描画します。
3. また、Slininger らに記載されているように^、18は 、エタノールの存在下でのキシロース上での増殖を評価する125ミリリットルフラスコ中の150グラム/ LのキシロースとODMの75ミリリットルにループ伝達することにより、各進化人口の前培養を準備し、96をインキュベートします25℃、150 rpmで（1 "軌道）のhr。ODM + 60グラム/ Lのキシロース+ 125ミリリットルフラスコ中の30〜45グラム/ Lのエタノール25ミリリットル中0.1の低い初期₆₂₀に試験培養物を接種する。インキュベート25℃、300 rpmで、1 "軌道とサンプルでフラスコ。

7。エタノールが存在する場合PSGHLにキシロースを活用単一細胞コロニーを分離し

1. ステップ6の結果に基づいて、上に成長し、エタノールの存在下でキシロースを発酵させる優れた能力を示すグリセロールストック集団を選択します。ストリークプレートにこれらを使用してください。ストリーク次いで、プレートを細胞懸濁液を₆₂₀ = 0.5まで、96ディープウェルプレートで前培養を接種するために使用される₆₂₀ = 5の高密度緩衝細胞懸濁液を調製するために使用されます。 ODM + 50グラム/ Lのキシロース（なしエタノール）で1：PSGHLに1ミリリットル予備培養物が1で混合接種します。空のウェル96ウェル、通気低蒸発とディープウェルプレートを25℃で48時間、400rpmで、1 "軌道のためにカバーしています。独立した別のグリセロールストック集団で前培養をインキュベートします。
2. 1 PSGHL：ODM + 50 20、30、または40グラム/ Lエタノールでグラム/ Lのキシローストレラント入植を豊かにするために、各前培養物を使用して、16 1ミリリットルが1で_620〜0.5を初期する文化を複製接種。濃縮cultuをインキュベート前培養と同様にresは。
3. それぞれ異なるグリセロールストックについては、最も高いエタノール濃度が成長し、キシロース使用を可能と培養ウェルを収穫。グリセロール中に保存するために流行し、単一のコロニーを得るために、YM寒天培地に各細胞株をプレート。グリセロールストックの調製のためのYM寒天プレートに細胞株およびストリーク各あたり10個のコロニーを選択してください。

8.さらにAFEX CSH用として、PSGHLのシリアル転送中に堅牢な進化株を充実します

1. NRRL Y-7124（親）の前培養を準備し、AFEX CSHトレラントは隔離進化、および連続培養は、エタノールの存在下でキシロースを使用するために強化された能力を持つ集団に進化しました。 AFEX CSH加水分解物適応プロセス用（ステップ2.1）上記のようにグリセロールストック筋からのループによってODM + 150グラム/ Lキシロースの75ミリリットルを接種します。
2. 増大する濃度のシリーズを提供するために、水でPSGHLを希釈します。それぞれを使用して、3つの細胞株の各々について、96ウェルマイクロプレートを準備PSGHL希釈は50μlの8井戸を埋めるために。 _620〜0.1から0.5を初期する希釈系列の各50μlのマイクロ培養物に接種するために前培養物を使用してください。
   1. 文化はΔtimeあたり_ΔA620の安定した14-dの平均比で完全な強さの加水分解物で増殖することができるまで、上記（ステップ2）に詳述AFEX CSH加水分解物の適応と同じ手順を使用してPSGHLの強みを増加させる酵母の進化を続けますなどのシリアル転送は、追加の4ヶ月間継続しています。

エタノールチャレンジの有無にかかわらずPSGHLグラデーションを使用して9アイソ単一細胞コロニー

1. 単一セルがYM寒天培地に希釈メッキにより完全戦力PSGHL最終適応プレートから直接分離し得ます。先に説明した（ステップ3.2）としてグリセロールストックを準備するためにYMプレートに3つの細胞株とバーストリークのそれぞれについて、10大きなコロニーを選択してください。
2. 必要に応じて、より早い時点を探ります3つの細胞株の保存されたグリセロールストックから単離することにより進化過程。
   1. グリセロールストックスジからのループによって各細胞株について前培養物を接種し、30ミリリットルODM + 50グラム/ Lのキシロース上で24時間（50ミリリットルフラスコ、25℃、150 rpm）をインキュベートします。
   2. 初期A _620〜0.2にマイクロプレートウェルに50％のPSGHLの50μLを接種し、静的に48時間インキュベートすることにより予備培養からの加水分解物中の成長への挑戦細胞。
   3. （配信〜プレートあたり300-400生細胞）0から50パーセント強の加水分解物の範囲PSGHL勾配寒天プレート上に各富んだ文化の0.1ミリリットルを広げ、勾配の可能な限り最高の加水分解物濃度領域から細胞株あたり10単一コロニーを選びます²¹ストリークは、ステップ3.2のようにグリセロールストックの調製のためのYMにコロニーを選びました。
   4. 代わり勾配寒天プレートに接種する、9.2.3ステップの代替として_、620〜0.2が当初、96ウェルマイクロプレートのウェルに接種、WHEウェル再10〜40グラム/ Lの50〜100％の強度およびエタノールへの加水分解物の濃度の範囲を含むように設計されています。この場合、マイクロプレートを72〜96時間を開発し、そうでない場合はステップ2.3のように。希釈平板を介して成長を示す最も過酷な加水分解物、エタノールの組み合わせのウェルから10単一コロニーを分離し、ステップ3.2のようにグリセロールストックを準備します。

一次スクリーニングでは10、二つの栄養条件でPSGHL上のパフォーマンスを比較し、ランキングによって劣った分離株を排除

1. 30の5セットの画面にPSGHL性能の高スループットディープウェルプレートスクリーンを適用すると、上位6株を選択するためのコントロールとしてNRRL Y-7124親と（ 図1の進化例のコロニー5に類似）AFEX CSHトレラント分離株と一緒に隔離します各セットから（20％）は、二次スクリーニングレベル（ステップ12）に渡します。
2. ウェルあたり1ミリリットルを満たしたとWiを覆われたディープウェルプレート中の画面を行います黒のシリコーン低蒸発シール付き番目のステンレス製の蓋。インキュベーター/シェーカーのボードにすべてのプレートをクランプし、25℃、400 rpmで（1「シェーカー軌道）で動作します。開いた井戸によって異なる分離株の分離を可能にするためにパターンを埋めるすべてのディープウェルプレートを設計します。
3. 栽培を開始するには、30から調製したグリセロールスジからの細胞のビーズを選ぶ（ステップ3、7、および9）は、上記のようにして得られた分離株ODM + 50グラム/ Lのキシロースのウェルを複製し、48時間インキュベートします。
4. ODM + 10グラム/ Lグルコース+ 50グラム/ Lのキシロースで1：分離株を前培養のための挑戦媒体としては、PSGHL 1を混合することにより、50％のPSGHLを準備します。 30分離株2つの制御系統をスクリーニングするために、16の単離物の各々につき2つのウェルを有する2プレートは、異なる単離体の間に空のウェルを残して、充填されています。
5. チャレンジ文化、転送、分離株およびコントロールのそれぞれのための2つの50％のPSGHLチャレンジ培養ウェルのそれぞれにODMの前培養_{（620〜10）}の50μlの体積についてのinitiを取得しますアルA _620〜0.5および72時間インキュベートします。
6. スクリーニングは隔離のために異なる栄養豊かさの2つのテストメディアを使用してください：60％のPSGHL + ODM栄養素を。 75％PSGHL + ODM + YM栄養素と。 ODMは50グラム/ L砂糖（ステップ1.3）で使用するための標準としての強度の半分で（糖を除く）ODMの栄養素を追加します。指定されたように、3グラム/ Lの酵母抽出物、3グラム/ Lの麦芽エキス、5グラム/ Lペプトンの標準強度の半分で（糖を除く）YMの栄養素を追加します。
7. 2試験媒体のそれぞれに対して_620〜0.5 5の深い井戸を初期する千μLを接種するために、72時間、50％のPSGHLチャレンジ前培養液50μlを転送することにより、試験培養物を接種します。
8. それぞれが毎日隔離サンプル。エタノール上清を得るために、マイクロチューブ、遠心分離（5533×gで、15分）にウェルの内容物をピペットで、グルコースとキシロース高スループット分析します。分光光度計を用いて₆₂₀で、96ウェルマイクロプレート（200μL/ウェル）などのバイオマスを測定します。
9. 30の各セット内にありますolates（S. stipitis NRRL Y-7124のための5セットは株を進化させ）、ステップ以下11で説明したように相対的なパフォーマンス指標（RPI）を計算し、エタノール収率（供給初期砂糖ごとに蓄積された最大エタノール）に基づいて各株をランク付けするために使用するテストされ、キシロース消費速度の両方の試験媒体上の（最初の96時間当たりに消費キシロース濃度）。

11.ランクは相対的な性能指数（RPI）を使用した主PSGHL画面で分離さ

1. 一次スクリーニングに続いて、30が60％のPSGHLと75％PSGHL、すなわち 、実験ごとに2つの異なる栄養製剤でPSGHLに隔離する画面に5つの異なる実験のそれぞれに分離しランク付けするために、無次元の相対的な性能指標（RPI）を計算します。
2. 与えられた実験において試験分離株のグループ内の分離株の性能をランク付けに使用するための統計的パラメータFを計算します。F =（XX _平均 ）/秒。ここで、Xは、そのような収率（Y）として、性能パラメータでありますまたは速度（R）は、それぞれの個々の分離株について観察された、X _の平均とのながら、平均と標準偏差は、それぞれ、Xのすべてが所与の実験内の隔離のために観察されます。正規分布の場合、-2
3. 各実験で分離するために、レートに基づいて相対的なパフォーマンスを計算し、RPI _R =（2 + F _{R）100/4×、}と同様100/4×利回りに基づいて相対的なパフォーマンス、RPI _Y =（2 + F _Y）を計算。 RPIの値は（最高に最低）〜0から100パーセンタイルの範囲です。 RPIの_平均収量および速度寄与は、このアプリケーションでは同等の重みを与えている=（RPI _Y + RPI _R）/ 2を、次のようにそれぞれが与えられた加水分解実験内隔離のために次にRPI平均値を計算します。
   重要性が等しくないと考えられる場合、一般的に、収率および速度パラメータは重み付けすることができることに注意してください。
4. テストした加水分解物のn種類を横切って_全体的な RPIを計算します。 _全体的な RPI _{=ΣI = 1、nは} [（RPI _Y + RPI _R）/ 2] _I / N。それぞれが30の分離株と2つのコントロールの実験セットに分離することを検討してください。 〜150シングルコロニーの主な順位の間、キシロースに富むためにPSGHLを適応分離株、 _全体的に 、画面に適用される2 PSGHL製剤全体の速度及び収率のために計算されるRPI すなわち、60％のPSGHLおよび75％PSGHL、ここで、n = 2。
5. _全体的に 、各実験内RPIに基づいて、二次画面に渡す分離株の上部割合を選択します。この例では、株の上位20％（ すなわち、150の30の試験）を通過するように選択されます。

二次スクリーニングでは12、最高機能する堅牢な株を明らかにするために、複数の完全な加水分解物（> 100グラム/ L混合糖類）上のトップ一次スクリーニングの出演を比較

1. 6％の窒素、SGH-N1およびSGH-N2（組成2つのレベルで修正されたグルカンAFEXのCSHとSGHをトップPSGHLパフォーマーの比較最終順位表1のよう秒）。 PSGHLの主要なディープウェルプレート画面のトップパフォーマーだった30分離株を選別コロニー5、 図1の例に類似し、2つのコントロール（親株NRRL Y-7124とAFEX CSHトレラント分離株（（10と11ステップ） ）。
2. 以前のように1ミリリットルODM + 50グラム/ Lのキシロースの深井戸を複製し、ディープウェルプレートシステム（ステップ10.2）で48時間インキュベートし、グリセロール筋からの細胞のビーズを選ぶことによって栽培を開始します。その後）〜10で_620を取得するために72時間、ディープウェルプレートシステムで50％SGHチャレンジ培養物にODMの前培養液50μlを転送し、インキュベートします。シュガーレスODM + 50グラム/ Lのキシロース（pHは5.6）で1：SGH 1を混合することにより、50％のSGHを準備します。
3. 分離株のそれぞれについて、初期テスト文化〜2.0 A _620を得るためにチャレンジ文化の3つのウェルからの細胞ペレット（15分、2711×gで）でSGH-N1またはSGH-N2の16ミリリットルのアリコートを接種します。 25＆＃で試験培養物をインキュベート176; C、シリコーンスポンジの閉鎖と25ミリリットルフラスコ中で毎分180回転（1 "軌道）試料フラスコ毎日PSGHL画面ごとに分析します。
4. 同様に、画面はチャレンジ培地および試験培地を調製する際に使用するためのpH 5.2で6％グルカンAFEXのCSHとステップ12.2と12.3のように分離し、今回代替SGH-N1およびSGH-N2。それは十分な窒素が修正なしであるため、水で1：50％強度のチャレンジの文化について、1に希釈し、6％AFEXのCSHを使用しています。
5. 繰り返して、結果を再現するために12.1から12.4を繰り返します。

13.ランク_全体の複数の完全な加水分解物のレート用途にRPIを使用した二次スクリーニングにおける分離株のパフォーマンス

1. 酵素の二次スクリーニングで試験されている一次スクリーニングからの分離株の上位20％のそれぞれ（〜150のうち30）をランク付けするために、相対的なパフォーマンス指標（RPI）を計算するには、栄養豊かさを変化させるの加水分解物製剤を糖化しました。
2. 各スコア3酵素糖化前処理加水分解物の配合物に対して行わキシロース消費速度とエタノール収率に基づいて二次スクリーニングにおいて試験分離株AFEX CSH（I = 1、2）、SGH-N1（i = 3,4）とSGHを含む、二重に実行-N2（i = 5,6）。
3. _I / N、N = 6 RPI _{全体的 =ΣI = 1、nは} [（RPI _Y + RPI _R）/ 2]：各単離のための_全体的な RPIを計算し、さらに優れた分離株のリストを精査するために、このランキングのパラメータを適用。
   注：Sliningerらの手順に従って、フラスコ培養におけるSGH-N2加水分解に優れた分離株の動態を実証する¹⁸

Results

S.のstipitisは AFEX CSH、PSGHL、およびエタノールチャレンジキシロース給電連続培養を含めた3つの選択培養液、の組み合わせを使用して発生した。 図1は、分離株と一緒に行わ進化実験の模式図は、最も効果的に実行するかがわかっ示し全体的に、または最も効果的にテストした加水分解物のいずれかで。 表3は、これらの優れた分離株のNRRL受託番号を示しており、それぞれの株が単離された濃縮された集団を達成するためのプロセスに適用される適応応力をまとめたものです。いくつかの分離株は、1つまたは2つの加水分解物のタイプに優れた相対的なパフォーマンスを持っているように見えるが、11分離株の7は、これらのほとんどは進化の過程で、単一型で公開されると攻撃したにもかかわらず、加水分解物の種類のすべてでうまく行きました。ここで撮影した様々な進化的アプローチの成功は、 図2に示されてい-図7および表4。

Discussion

いくつかのステップは、進化のプロセスの成功に不可欠でした。まず、成功したアプリケーションのために必要とされる目的の表現型に向かって人口の進化を推進するための適切な選択圧を選択するためのキーです。以下の選択応力はS.のために選択しました開発をstipitisし、所望の表現型について濃縮を導くために適切なタイミングで適用される：12％（酢酸およびフランアルデヒドおよび他の阻害剤の低レベルの存在下で成長し、多様な糖の発酵を強制的に）グルカンAFEX CSHの増加強み。キシロースは、（diauxic遅延を低減するために、キシロースの酵素誘導を強制）エタノール濃度の増加に伴って連続培養を供給する。そして、（高酢酸、フラン、および他の阻害剤の存在下でのキシロースの成長と発酵を強制的に）PSGHLをロードし、固形分20％の強度を増加させます。第二に、グリセロールの凍結によって進化酵母集団を維持することが重要です人口サンプルのtocks濃縮プロセスが進行するにつれて。人口のこのようなスナップショットは、進化の進行状況を文書化するために、必要に応じてその後の単離を可能にするために、またはぶりに進化プロセスを再起動するた...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec、キシラナーゼ(endo-1,4-)	Novozymesが含まれています製品	番号 www.novozymes.com、	1-919-494-3000
Cellic Htec、セルラーゼとXyalanase	が含まれています ノボザイ	製品番号 www.novozymes.com なし	、1-919-494-3000
トーストしたニュートリソイ粉	アーチャーダニエルズミッドランド株式会社(ADM)	63160	ADM、4666 Faries Parkway、ディケーター、イリノイ州  1800-37-5843
プルロニックF-68(界面活性剤)	シグマ-アルドリッチ	P1300	グマ-アルドリッチ
ディフコビタミンアッセイカサミノ酸ベ	クトンディキンソンアンド	カンパニー228830	複数のサプライヤー:例、フィッシャーサイエンティフィック、VWR、ダイ
ガーD、L-トリプトファン	Sigma-Aldrich	T3300	複数のサプライヤー: e.g.、Fisher Scientific、VWR、Daigger
L-cysteine	シグマ-アルドリッチ	C7352	サプライヤー:例えば、フィッシャーサイエンティフィック、シグマ-アルドリッチ
バクト寒天ベ	クトンディッキンソンと会社	214010	複数のサプライヤー:例えば、フィッシャーサイエンティフィック、VWR、ダイガー
バクト麦芽エキス	ベクトンディキンソンアンドカンパニー218630		複数のサプライヤー:例えば、フィッシャーサイエンティフィック、VWR、ダイガー
バクト酵母エキス	ベクトンディキンソンアンド	カンパニー212750	複数のサプライヤー:例えば< / em>、フィッシャーサイエンティフィック、VWR、ダイガー
ペプトンタイプIV大豆	フルーカ	P0521-500g	から複数のサプライヤー:例えば< / em>、フィッシャーサイエンティフィック、VWR、ダイガー
アデニン、>99%粉末	シグマアルドリッチ	A8626	CASの73-24-5。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例えば< / em>、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
シトシン、>99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例えば< / em>、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
Guanine、SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例えば< / em>、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
Thymine、99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例えば、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
Uracil、99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例:、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
デキストロース(D-グルコース)、無水、認定ACS	フィッシャーケミカル	D16-500	CAS 50-99-7。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例:< / em>、Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
D-Xylose、アッセイ>99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6。他のブランドを使用することもできます。複数のサプライヤー:例:、Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
96ウェル、平底プレート	Becton Dickinson Falcon	351172	複数のサプライヤー:例:、Thermo-Fisher、VWR、Daigger
Wypall L40ワイ	パーKimberly-Clark		タオルをマイクロプレートボックスに入らせて加湿用、複数のサプライヤー例:、 サーモフィッシャー、uline、ダイガー
コーニング目盛り付きパイレックスフラスコ、125 ml、狭い開口部(ストッパー#5)	コーニングライフサイエンスガラス	4980-125	複数のサプライヤー:例えば< / em>、サーモフィッシャー、VWR、ダイガー
イノーバ42Rシェーカー/インキュベーター、2.5 cm(1 ")回転	ニューブランズウィックサイエンティフィック(1-800-631-5417)	M1335-0016	複数のサプライヤー:例:、エッペンドルフ、サーモフィッシャー。2.5 cm(1インチ)スローを備えた他のシェーカー/インキュベーターを使用できます。
4つの深い井戸MTPの版のためのDuetzカバー	クランプ Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (米国)、1-650-578-1396
96の深い井戸の版のためのDuetzシステムのサンドイッチ カバー	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (米国)、1-650-578-1396
Duetzシステムのシリコーン シール(0.8 mmの黒い低いevap) 96の深い井戸の版カバー	のための Applikon バイオテクノロジー	V0W1040027	applikon-biotechnology.com(米国)、1-650-578-1396
Duetzシステムサンドイッチ	カバーApplikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com(米国)、1-650-578-1396
96ウェル、2 ml正方形井戸ピラミッド底板、天然ポピプロピレン	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com(米国)、1-650-578-1396
Bellco 32 mmシリコンスポンジプラグクロージャー、125 mlフラスコBellco		1924-00032	、カタログ番号は1203K27
Bellcoスピナーフラスコ、1968-ガラスドーム、シール可能なフランジタイプ、100mlの作業容量です。このデザインは製造されなくなりました。	ベルコ	1968-00100 (オリジナル Cat.いいえ。	ジャケット付き容器には、循環水浴による温度制御のための下部入口ポートと上部出口ポートがあります。容器は外径75mm、高さ200mmです。~45° に 4 つのサイドポートがあります。角度と1つのトップポート。ポート開口部は、サイズ0のネオプレンストッパー(ポートの内径21-22mm)に適したサイズです。
Mathis Labomat IRドライヤーオーブン	MathisAg	Typ-NBR BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
デュアルチャンネル生化学分析装置	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com、96ウェルマイクロプレートフォーマットの急速糖アッセイ用ロボットシステム
PowerWave XSマイクロプレート分光光度計	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com