このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

15.3K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

2016年7月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この原稿は、低酸素/再酸素化下で培養された免疫精製されたヒト絨毛性細胞栄養細胞のユニークなin vitroモデルを示しています。このモデルは、メラトニンなどの有望な治療法が、酸化ストレスの増加や胎盤機能の変化に関連する妊娠合併症に対する保護効果を研究するのに適しています。

要約

このプロトコルは、絨毛の細胞栄養膜細胞が連続的な酵素消化を経て、密度遠心分離、培地勾配分離、免疫磁気精製によって胎盤からどのように単離されるかを説明しています。in vivoで観察されたように、初代培養中の単核絨毛性細胞栄養膜細胞は、72時間後に多核合胞体栄養膜細胞に分化します。正常酸素症(8%O2)と比較して、低酸素/再酸素化(0.5%/ 8%O2)を受ける絨毛性細胞栄養膜細胞は、子癇前症、早産、子宮内発育制限などの妊娠合併症でin vivoで観察されるものと同様に、酸化ストレスと内因性アポトーシスの増加を受けます。この文脈では、低酸素/再酸素化条件下で培養された一次絨毛栄養膜は、ヒト胎盤で変化するメカニズムとシグナル伝達経路をよりよく理解し、特定の妊娠障害から保護する効果的な薬剤の探索を促進するためのユニークな実験システムを表しています。ヒト絨毛栄養膜はメラトニンを産生し、その合成酵素と受容体を発現します。メラトニンは、その保護抗酸化作用により、子癇前症および子宮内発育制限の治療薬として提案されています。この論文に記載されている一次絨毛性細胞栄養膜細胞モデルでは、メラトニンは正常酸素状態の栄養膜細胞に影響を与えませんが、低酸素/再酸素化によって破壊された合胞体栄養膜細胞の酸化還元バランスを回復させます。したがって、初代培養中のヒト絨毛栄養膜細胞は、低酸素/再酸素化中の胎盤機能に対するメラトニンの保護効果の背後にあるメカニズムを研究するための優れたアプローチです。

概要

ヒト妊娠全体にわたって、単核幹細胞である胎盤栄養膜細胞は、急速に増殖し絨毛またはextravillous細胞栄養芽層細胞のいずれかに分化します。 Extravillous細胞栄養芽層が侵入し、子宮壁のらせん動脈を改造します。絨毛細胞栄養層は、他の一方で、多核合胞体（シンシチウム）1を形成するために、増殖し分化し、ヒューズを続けます。絨毛栄養膜の恒常性の維持は、胎児の幸福と健康な妊娠のために不可欠です。実際には、絨毛栄養膜は、酸素と栄養素の母体胎児の交換を可能にし、妊娠に不可欠なホルモンを産生します。また、合胞体栄養細胞は、母体の血液循環と直接接触している唯一の細胞型であり、本質的な物理的および免疫学的障壁を提供します。したがって、合胞体栄養細胞は恒常性維持のため、アポトーシスおよび交換を受けなければならないとAVOしますID胎盤病理2-5。

Kliman らによって開発された技術。1986年の6個のヒト胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離するためには、絨毛栄養膜分化に関与する分子メカニズムの研究を可能にすることによって、胎盤の研究に革命をもたらしました。密度遠心分離メディア（ポリビニルピロリドン、またはパーコールによってコーティングされたコロイダルシリカ粒子）で分離に続いてトリプシンおよびDNアーゼによる逐次酵素消化に基づいて、この古典的な技術は、現在、絨毛栄養膜細胞を単離するためのゴールドスタンダードとして認識されています。技術は、磁気免疫精製、これらの細胞の表面上の特異的抗原の示差発現に基づいて、非栄養膜細胞から絨毛細胞栄養芽層を分離する手順によって最適化することができます。私たちは、原因絨毛細胞membran上のその発現の欠如にヒト白血球抗原ABC（HLA-ABC）を選びました電子7,8。

胎盤は、妊娠中の酸素レベルの劇的な変化を受ける器官です。妊娠初期では、酸素の比は、第二及び第三のトリメスターに生理学的に非常に低い（2％O 2）が、酸素の穏やかなレベルに増加する（8％O 2）です。 Tuuli ら 9は、胎盤絨毛内部の栄養膜環境のin vitroでの再生が酸素化レベルでの挑戦とばらつきがあっても表現型の変化につながる可能性があることを説明しました。したがって、妊娠8,9の第三期中の胎盤絨毛に見られる酸素分圧を模倣するために正常酸素として8％の酸素を採用することが示唆されます。 Chenら 10は、広く栄養膜細胞培養における酸素分圧に関連するいくつかの変数を検討し、細胞周囲環境の酸素レベルを決定することの重要性を実証しました。絨毛中の酸素の濃度が増加する傾向にあります脈管形成に起因します。常に胎盤絨毛増加の血流および過酸化水素（豊富な反応性酸素種）のレベルは、脈管11,12を制御する重要な信号です。妊娠合併症、脈管形成の欠如は、低酸素状態を生成し、そしてより重要なことには、酸素の間欠的な変形は、（低酸素/再酸素化と呼ばれます）。これらの条件は、胎盤と胎児の生存率13,14を損なう酸化ストレスの異常な増加につながります。次のように栄養膜細胞が低酸素/再酸素化のエピソードの間に生体内で受ける改変は、in vitroで模倣することができる。彼らは合胞体栄養細胞に分化するまで、絨毛細胞栄養層は、酸素正常状態（8％O 2）下に維持されています。次いで、それらを酸素正常状態（再酸素化）の追加の18時間、続いて4時間、低酸素条件（0.5％O 2）に供されます。この低酸素/再酸素化のアプローチを使用して、元のトロホブラスト特定の妊娠合併症で観察されているように、調節解除酸化還元状態と内因性アポトーシス8のレベルの増加をhibit。したがって、これは胎盤性低酸素症/再酸素化に関連した妊娠合併症に対処するために新たな予防・治療法を評価するインビトロモデルに有用です。

胎盤細胞は、例えば、酸化ストレスおよび胎盤機能不全15を回避する能力など、いくつかの重要な機能を有し、メラトニンを生成します。ここで、我々は、分子細胞および機能レベル8で胎盤栄養膜細胞におけるメラトニンの保護効果を実証するために使用される実験的なアプローチとセルモデルを提示します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

胎盤は、インフォ患者の同意と倫理委員会（CHUMサンリュック病院とINRS-研究所アルマン-フラピエの承認を得て、直ちにCHUMサンリュック病院、モントリオール、QC、カナダでの合併症のない妊娠からの自発的な膣分娩後に得ましたラバル、QC、カナダ）。

絨毛細胞栄養芽層細胞の1単離および精製

  1. ソリューションとメディア
    1. 4℃で1％の体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸塩）とストアを含むダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（DMEM-HG）を補完することにより、トランスポートメディアを準備します。
    2. 10％ 体積/体積のウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM-HGを補充することにより一次培地を調製し、25 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1％ 体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlのペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸ナトリウム）し、4℃で保存します。 37°Cの前にウォームメディアつかいます。
    3. 生理食塩水（0.9％重量/容量の塩化ナトリウム）の4 Lを準備します。
    4. 1×HBSS（pH7.4）中に25mMのHEPESを添加することによって改変ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を準備します。
    5. 修正されたHBSS（1.1.4で調製した）で消化溶液、硫酸マグネシウム（MgSO 4）、塩化カルシウム（CaCl 2）、トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼIV（DNアーゼIV）、および1％ 容量/容量の抗生物質（新鮮な4つのボトルを準備10,000単位/ mlのペニシリンG、100ミリグラム/ mlストレプトマイシン硫酸塩） を表1に示します。
    6. 密度遠心分離メディア勾配を準備
      1. 10％の体積/体積 HBSS 10倍で密度遠心分離培地を補充することによって密度遠心分離培地溶液を準備します。
      2. 密度遠心分離培地溶液で14アッセイチューブを準備し、 表2に記載されているように、HBSSを変更しました。
      3. 精力的にグラデーションにその内容を追加する前に、各濃度の溶液（ステップ1.1.6.2）を混ぜます。優しく最高濃度（70％）で始まる、蠕動ポンプ（1ml /分）を有する50mLのガラス遠心管に濃度溶液を加えます。勾配の各層の適切な分離を維持するために、管壁に対するソリューションを排出することによって液滴を避けてください。
        1. 蠕動ポンプの非存在下では、パスツールピペットで非常に優しく層を適用します。
    7. 2％ 容量/抗真菌体積抗生物質/（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlで硫酸ストレプトマイシン）で（材料の表を参照）ランニング緩衝液を補充することにより、最終的なランニングバッファーを準備します。 4℃で保存。
  2. 絨毛細胞栄養芽層の分離
    注意：使用無菌手術用機器、ガラス製品、ピペット、フラスコなど
    1. 絨毛細胞栄養芽層の分離の日に、37℃の水浴中で、及びFBS 70mlを（ステップ1.1.5）からの消化液を温めます。注：FBSの使用50mlを消化し、遮断します一度解凍した氷の上に置くことができる凍結工程（1.2.22）用の20ミリリットルを残り。
    2. 出産後、できるだけ速やかに（ステップ1.1.1から）氷冷輸送媒体で実験室に（1時間未満）の胎盤をもたらします。
    3. 液体ゴミ箱に輸送媒体と胎盤血を捨てます。胎盤の重量を測定し、冷生理食塩水に浸します。
    4. 測定し、以下の機能解析：臍帯の長さを、臍帯ローカライズ;胎盤長さ、幅、形状（楕円形、円盤状）。膜の色;子葉構造病理。注：データは、結果セクションに提示されています。
    5. （コードの周りに追加の半径1cmの円とそのベースで、 すなわち ）その胎盤の挿入と一緒にへその緒を切ります。後で組織学的分析のために、組織学的、組織固定溶液（ホルマリンの10％）300mlに浸します。
    6. 5×5×5cmの立方体に全体胎盤をカット。生理食塩水ゾル中に完全に（4倍X〜1分）洗浄ution（0.9％）食塩水が透明になるまで、血液細胞を除去します。リンス液は捨ててください。
    7. 時計皿では、血管や石灰化を除去するために胎盤膜およびミンチ組織を削除します。鉗子でしっかりと血管を持ち、Metzenbaumはさみバックを使用して組織を削除します。
      1. ブフナー漏斗でみじん切り胎盤を置きます。生理食塩水緩衝液の約100ミリリットルですすいでください。細分化した組織の35グラムが得られる（プラスチック計量ボートとスケールを使用） - 30までミンチ続けます。 35グラムの準備 - 必要に応じて、3つの追加30まで得ることが胎盤の残りの部分をミンチ。この間、氷の上に秤量ボートにみじん切りの組織を置きます。
        注：このステップは1時間に約45分かかります。
    8. トリプシン処理フラスコに35グラムみじん切り胎盤組織 - 30を追加します。トリプシン処理フラスコに調製した消化溶液1（ 表1）の150ミリリットルを移し、よく混ぜます。
    9. でトリプシン処理フラスコを置きますこれ以上50未満サイクル/分の速度で30分間水浴を振って、手動で均質な消化のために5分ごとにトリプシン処理フラスコを混ぜます。
    10. 最初の消化の終わりに、水浴からトリプシン処理フラスコを削除し、胎盤組織を沈降するために1分間それ（45°）を傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、上清の約80ミリリットルを除去し、廃棄します。組織を吸引することは避けてください。
    11. トリプシン処理フラスコに消化溶液2（ 表1）100mlのを転送します。よく混ぜ、ステップ1.2.9を繰り返します。
    12. 第二の消化の終了時に、水槽からトリプシン処理フラスコを取り外し、1分間それを45°傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、80ミリリットルの上清を除去し、静かにセルストレーナー（100μmのメッシュ）で遠心分離管に移します。 FBSの2ミリリットルの遠心分離管がいっぱいになるたびに入ったビーカーに濾過した上清を転送します。
    13. 記載したように、第3の消化を行います第二の消化（1.2.11および1.2.12）並行して75ミリリットル消化溶液3を用いて、消化2用の1.2.16.1にステップ1.2.15を実行します。
    14. 消化溶液4（75ミリリットル）を用いた第3の消化とまったく同じように第四の消化を実行しますが、上清の最大量を収集します。消化3並列に1.2.16.1に、手順1.2.15を実行し、そして最終的に消化4。
    15. （消化2、3から4）上清13.5ミリリットルの部分に、1 15ミリリットル遠心管に各部分を等分。 22.8センチメートル長いガラスパスツールピペットで、非常に静かに、ゆっくりと別のレイヤーを作成するために、各チューブの底にFBSの1.5ミリリットルを配置します。 FBSおよび上清を混在させないでください。室温で1250×gで20分間ブレーキなしのチューブを遠心。
      注： 図1に示すように遠心分離した後、4つの層は、チューブ内に表示されているトリプシンおよび栄養膜細胞の分離は、過剰な細胞消化を回避します。
    16. 真空ポンプ、aspirと食べたし、上清（消化液）と2層の間に白っぽい膜を含むFBS層を捨てます。温かい細胞培養培地1ml（; NO FBSなしHEPESとステップ1.1.2）と（トロホブラストと赤血球​​層）ペレットを再懸濁します。
      1. すべてのチューブから再懸濁した細胞を収集し、1チューブでそれらを組み合わせます。チューブはすべて消化の終わりまで室温で放置します。注：すべて消化した後、通常の収量は再懸濁された細胞（消化あたり1）の3つのチューブです。
    17. 暖かい細胞培養培地で15ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で10分間、1250×gで遠心分離します。真空ポンプで上清を取り除きます。ペレットを吸引しないでください。
    18. 優しく暖かい細胞培養培地の1ミリリットルで3つの管から得られたペレットを再懸濁します。 1チューブでその内容をプール。 8ミリリットルを得るためには、温かみの細胞培養培地でボリュームを完了します。
    19. 非常に静かに分離卒業生に細胞懸濁液をレイヤーパスツールピペットでient。室温で507×gで30分間ブレーキなしで遠心します。
    20. 遠心分離した後、バックライトでの勾配で細胞の異なる層を識別します。密度遠心分離培地の50％ - 層栄養膜を含むと40の間の細胞の混入を探します。真空ポンプで、上位層（> 50％）を取り外します。
    21. パスツールピペットで関心のある層に位置して細胞を回収し、50mlの遠心管に移します。細胞培養培地で50ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で1250×gで10分間遠心します。
    22. 無菌条件下で、上清を捨て、FBS 20mlでペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。氷の上で、無菌ジメチルスルホキシド（DMSO）の2.22ミリリットルを追加し、反転させる穏やかに混合します。極低温バイアルへの細胞懸濁液のアリコート1.5ミリリットルを、-80℃で一晩凍結し、液体窒素タンクに移します。
  3. 栄養膜精製
    1. 製造元の指示に従ってすすぎとバッファを実行し、磁気浄化機器の新しいフィルターカラムを取り付けます。負の1、正1と正の2ポートをきれいにしてから、製造元の指示に従って、各ポートの下に50ミリリットルチューブを紹介する「クリーンプログラム」を実行します。
    2. 37℃の水浴中で迅速ステップ1.2.22で凍結した細胞を解凍。冷たいランニング緩衝液の20ミリリットルと穏やかに50ミリリットルチューブを再懸濁細胞に細胞を移します。 450×gで5分間、4℃のためのチューブを遠心。
    3. 上清を捨てます。冷たいランニング緩衝液で洗浄ステップを繰り返します。生存率を測定する血球計数器を用いて細胞を数えます。遠心分離を繰り返して（5分、4℃で450×gでの場合）。上清を注意深く取り除きます。抗HLA-ABC抗体をマウスの1％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlを追加します。 4℃で30分間インキュベートし、ミクシィ静かに5分ごとにngの。
    4. 冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、このステップを繰り返します。抗マウス二次抗体結合磁気ビーズの10％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlで再懸濁細胞。静かに5分ごとに混合、15分間4℃でインキュベートします。
    5. 冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。 5ミリリットルの冷ランニングバッファーで上清と再懸濁を捨てます。
    6. 磁気精製装置を用いて栄養膜細胞を分離します。負のポートで細胞を回収し、冷ランニングバッファーの20ミリリットルを追加します。
      注：栄養膜細胞は複雑なHLA-ABCが含まれていない、したがって、他の細胞型から分離し、負の1ポートに向けられています。
    7. 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、ゆっくりと20ミリリットル暖かい初代培養培地で細胞を再懸濁します。 usin細胞を数えますGAの血球計数器は、生存率を決定します。
    8. プレート以下の密度で細胞：0.15×10 6細胞/ウェルで96ウェルプレート、1.6×10 6細胞/ウェルで24ウェルプレートおよび4.5×10 6細胞/ウェルで6ウェルプレート。 37℃で、5％CO 2でプレートをインキュベートします。
    9. および/ ​​または18を免疫細胞化学により16,17フローサイトメトリーによって栄養膜細胞の純度を確認してください。
      注：免疫精製細胞の純度は、サイトケラチン7およびビメンチン17-19に対するFITC結合モノクローナル抗体を用いて決定しました。このプロトコルは、。Lanoixらにも詳述されている2008年7。
    10. 少なくとも4時間後、未付着細胞を除去した後、8％O 2（ 図2およびセクション2を参照）で構成されて正常酸素室にプレートを転送するために温かい培地で細胞を2回洗浄します。

2.インビトロ Inductio酸素正常状態のnおよび低酸素/再酸素化

  1. インキュベータ室操作（セット・アップするための図2Aを参照）。
    1. 層流フード中で、乾燥を避けるために、インキュベーターチャンバーの底に滅菌水を含むペトリ皿を置きます。その後、チャンバーの優れた棚の上に先に調製した細胞培養プレートまたはフラスコ（ステップ1.3.10）を配置。
    2. フード外、ガスホース（ 図2A：図5a、b及びc）にチャンバー（入口ポート）を取り付けたガス（8％O 2または0.5％O 2）のチューブに到達する（ 図2A：7）。チャンバーの両方の入口および出口ポートを開きます。このとき、ガスレギュレータ（ 図2（a）は ：4）閉じたままにする必要があります。
    3. 注意深くガス調整弁を開き（ 図2A：4）。完全にチャンバ内の空気を置換する25リットル/分の空気流で4分間のフラッシュ。
    4. チャンバーをフラッシュした後、次に入口をガスレギュレータを閉じ、OUチャンバーのtletポート。
    5. 流量計の出口ホース（ 図2A：5C）抜い室の入口ポートからの37℃で細胞培養インキュベーター内でチャンバを置きます。
    6. ステップ2.1.3の後にガス1時間でチャンバーを充填することにより、培養培地中で、現在のプレート、フラスコ内に存在し、溶存空気を交換してください。
    7. 繰り返して、他のガス組成のために2.1.6に2.1.1ステップ（ 例えば 、妊娠初期の栄養膜培養の9のための2％のO 2）。
  2. 酸素の割合（ 図2B-C）を確認
    1. チャンバ内（細胞なし）の細胞培養培地中の酸素の濃度を確認するために、酸素のアダプタに接続された酸素電極を使用します。電圧計に酸素電極を接続します。
    2. 既知の酸素含有量（ 例えば 、0％でのガスの溶液を曝露することによって、同じ溶液（ すなわち 、細胞培養培地）で検量線を作成し21％酸素）。測定値は各濃度について安定化された後、チャンバー内の媒体中に電極を導入します。
      注：酸素濃度10内の任意の偏りを回避するために、同じ深さですべての測定を行います。
  3. 栄養芽細胞で正常酸素および低酸素/再酸素化の誘導。
    1. 適切な細胞培養フラスコ、プレートまたはペトリ皿に一次栄養膜細胞を追加した後、必要に応じて治療を行います。
    2. 並行して、チャンバ内に、特定の条件ごとに24時間（ 図3）を再生するために所望のガス混合物に細胞をさらします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

経膣分娩で得られた正常期間胎盤から絨毛栄養膜細胞の単離と免疫精製は、1×10 8の生細胞が得られました。胎盤は、350グラムの重量を量った円盤状の形状と透明膜で4センチ、直径19センチ、でした。いいえ子葉奇形は検出されませんでした。臍帯は傍局在と56センチメートルの長さを有していました。純度は、ビメンチンおよびサイトケラチン7マーカーを用いたフローサイトメトリーによって評価しました。細胞の98％以上が免疫精製から得られた絨毛栄養膜細胞の純度を確認し、サイトケラチン7ビメンチンについて陰性および陽性でした。絨毛細胞栄養芽層細胞を1mMのメラトニンの存在下または非存在下で正常酸素条件下で96ウェル培養プレートに添加しました。絨毛細胞栄養芽層の生化学的分化は、以下のようにβヒト絨毛性ゴナドトロピン（β-hCGの）分泌のレベルを決定することによりモニターしました以前1,7,20,21説明。形態的分化とアポトーシスは、抗デスモプラキン及び抗カスパーゼ切断サイトケラチン18、中間フィラメント7,22を用いて免疫蛍光法に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

哺乳類では、胎児の発育が十分な胎盤機能に直接依存しています。健康障害の発生起源は、その後の人生で明らかに病気の原因は早期開発に胎盤が胎児プログラミング30-32で機構的な役割を持っていることをさかのぼることができ仮説に基づいています。胎盤は胎児の成長と発展の重要なメディエーターである：それは、栄養移動を規制する有害な暴露から保護し、主要な内分泌機能を有しています。 Kliman らによる開発。実行可能な一次細胞栄養層を分離するための再現可能な技術のは、正常および異常な胎盤機能6の研究で画期的な出来事です。多くの研究者は、胎盤生理18,20,33,34を理解するために、in vitroで特定の条件を再現するために、この技術を適応しています。 Petroff らによって記載されたように 、多くの手順は、単離されたCYTOの精製および堅牢な収率を保証するために重要です栄養膜細胞18。例えば、消化ステップは、生存可能な単離された細胞栄養層のより多く、そ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

カナダ自然科学工学研究評議会（NSERC（(no.262011-2009)からのCVへの助成金とMarch of Dimes Social and Behavioral Sciences Research）CVおよびJTSへの助成金：およびMinistère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec （FRQ（Nature et technologies）およびArmand-Frappier INRS財団からのLSFへの学生資格による支援を受けています。 Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATEのHCから、Canadian Institutes of Health Research(CIHR)とFRQ-SantéのAAHT、NSERCのJBPへ。Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) と Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT から EMAS へのフェローシップによって。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
湾曲したメッツェンバウムはさみシャンドン9212手術器具(細胞分離)(2ユニット)
スプリンター鉗子ファイン41/2フィッシャーブランド13-812-42手術器具(細胞分離)(2ユニット)
はさみ4.5 Str解剖フィッシャーブランド08-940手術器具(細胞分離)(2ユニット)
ガーゼスポンジ10 cm x 10 cmディナルヘルス
長方形ガラスグラタンディッシュパイレックス1105397ガラス製品(2.8リットル)
ファンネルブフナークアーズテック社10-356Eガラス製品(直径114ミリメートル)
時計ガラス pyrex9985100EMDガラス製品
ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%Sigma-AldrichHT501128-4L組織組織固定液
トリプシン化フラスコウィートン355395ガラス製品 (1 ユニット)
使い捨て培養チューブKimble73750-13100ガラス製品
ホウケイ酸ガラス パスツールピペット (22.8 cm)フィッシャーブランドK63B1367820Cガラス製品
250 ml ガラス ビーカーフィッシャーブランドKFS14005250ガラス製品
キャップ付きガラス メディア ボトルフィッシャーブランドKFS14395250ガラス製品 (8 ユニット)
50 ml コレックス チューブ コーニング8422-A(1ユニット)
15 ml ポリスチレン遠心チューブコーニング430791
50 ml ポリスチレン遠心チューブコーニング430829
10 ml セロジカルピペットコーニング11415038
セルストレーナー 100 μm ナイロンコーニング431752
吸収ライナーサイエンスウェア1199918
500 mlボトルトップフィルターコーニングポア:0.22 &マイクロ;m /ミディアムおよびHBSS調製
mlのリオジェニックバイアルコーニング430488
凍結容器、Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
蠕動ポンプPharmacia Fine ChemicalsP3モデル
振とうウォーターバスフィッシャーモデル127
真空ポンプABM4EKFS6CX-4
塩化ナトリウムフィッシャーブランドEC231-598-3生理食塩水0.9%
ハンク緩衝塩溶液(Hbss)Sigma-AldrichH2387数量:消化液1Lに対して9.25(1バイアル)
ドロキシピペラジンエタンスルホン酸(Hepes)Life Technologies15630-080消化液1Lに対して25ml(1M)
プシンI型Sigma-AldrichT80039,888 U
デオキシリボヌクレアーゼIV型ロシュ10-104-159-001402,000 U
塩化カルシウムSigma-AldrichC4901100 mM
硫酸マグネシウムBaker2500-01800 mM
ダルベッコs Modified Eagle Medium High Glucose (DMEM)Life Technologies10564-045
ペニシリン/ストレプトマイシン 硫酸塩HycloneSV30010
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644密度遠心分離培地勾配。容量:36 ml
イソプロパノールAcros42383-001050 ml
ジメチルスルホキシドSigma-Aldrich472301
Automacs マグネティックセパレーター ミルテニー・バイオテック003
オートマック コラム Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs ランニングバッファー Miltenyi Biotec130-091-221
http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 Automacsリンス液 Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
抗ヒト HLA Abc 精製クローン W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82抗マウス
抗体 抗マウス Igg MicrobeadsMiltenyi Biotec130048401
マルチプル ウェル プレート -  6 ウェル ウィズ蓋コーニング3335細胞結合面
マルチプルウェルプレート -  24 ウェル蓋付き コーニング3337セル結合面
マルチプルウェルプレート -  96 ウェル 蓋付きコーニング3300セル結合面
モジュラーインキュベーターチャンバー Billups-RothenbergMIC-1012つのセットは、正常酸素と低酸素/再酸素化条件を同時に生成するために必要です
シングルフローメーターBillups-RothenbergSFM3001
50 mm インラインフィルターWhatman6721-5010PTFE、細孔:1.0 & マイクロ;m
ガスレギュレータプロスターPRS3012332個セットは、ノルモキシアと低酸素/再酸素化条件を同時に生成するために必要です
ガスホース クラスVi クリア 5/16 Parker100-050701023個入り ~ 0.5 m
17 mm 調整可能ガスホースクランプタイラップTHCSS-16
Normoxia ガスボンベ PraxairNI CDOXR1U-Kサイズ K (3rd トリメスターの組成: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Normoxia ガス ボンベ PraxairNI CDOXR1U-Kサイズ K (3rd トリメスターの組成: 5% CO2、0.5% O2、Bal. N2)
酸素微小電極 INC84477
酸素アダプター微小電極 INC3572
ROS 検出試薬: CM-H2DCFDA InvitrogenC-400
β-hCG ELISAキット DRG internatinalEIA-4115
Anti-Vimentin purified antibodyeBioscience14-9897宿主:マウス
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) 抗体 Abcamab119697ホスト: マウス
Alexa Fluor 488 ヤギ Anti-mousse IgG H&L抗体ライフテクノロジーズ A-11029
カー3610207332 ヒ トリ型ー

参考文献

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

Beta hCG
メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。