工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Summary

このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。

Abstract

mRNAのタンパク質への翻訳は、基本的で高度に制御された生物学的プロセスです。ポリソームプロファイリングは、翻訳調節の解析におけるゴールドスタンダードと考えられています。ここで説明する方法は、さまざまな植物組織からポリソームを分画するための簡単で経済的な方法です。ショ糖グラデーションは、グラデーションメーカーを必要とせずに、各レイヤーを順番にフリーズすることで作成されます。次に、シクロヘキシミドとクロラムフェニコールを含む緩衝液で細胞質抽出物を調製し、細胞質および葉緑化リボソームをmRNAに固定化し、ショ糖勾配にロードします。遠心分離後、6つのフラクションが超遠心チューブを貫通することなく、グラジエントの底部から上部に直接収集されます。収集中、260 nm の吸光度を連続的に読み取って、全体的な翻訳活性のスナップショットを提供するポリソームプロファイルを生成します。次に、フラクションをプールして3つの異なるmRNA集団を調製します:ポリソーム、いくつかのリボソームに結合したmRNA。モノソーム、1つのリボソームに結合したmRNA。リボソームに結合していないmRNA。その後、mRNAが抽出されます。このプロトコールは、シロイヌナズナの苗木や成体植物、Nicotiana benthamiana、Solanum lycopersicum、Oryza sativaの葉など、さまざまな植物や組織で検証されています。

Introduction

タンパク質合成は、すべてのセル¹において不可欠とエネルギー的にコストのかかるプロセスです。まず第一に、細胞は、翻訳機構、リボソームの生産にエネルギーを投資しなければなりません。例えば、活発に分裂酵母細胞は毎分ほど2,000リボソームを生成します。このような生産は、総転写活性の60％及びセル²の全スプライシング活性の最大90％までを必要とします。また、エネルギーは、アミノ酸、アミノアシルtRNAおよびペプチド結合の合成に必要とされます。植物では、ATP ³の4.5〜5.9分子からペプチド鎖コスト1つのアミノ酸を付加します。したがって、変化する環境条件に対処することになる場合は特に、タンパク質へのmRNAの翻訳を調節する主要な部位であることは驚くべきことではありません。

リボソームとmRNAの関連で翻訳の開始段階では、規制の主なターゲットであります翻訳^4。翻訳の調節の結果、ならびに他の転写後調節ステップとして、タンパク質濃度の変動の40％のみがmRNA量^5,6によって説明することができます。このように、全mRNAの研究は、タンパク質存在量についての比較的低い情報を提供します。一方、リボソームとmRNAの関連は、翻訳に関与するそれらのmRNAへのアクセスを与えることによって、タンパク質存在量より深い洞察を提​​供します。積極的に翻訳されたmRNAはポリソームと呼ばれる構造で....

Protocol

20〜50％（w / v）のスクロース勾配の調製

注：勾配13.2 mlの超遠心分離管中のスクロースの4層（50％、35％および20％の2層）で形成されています。我々の経験では、2つの別個の層では20％スクロースを注ぐことは大いにポリソーム製剤の品質が向上します。

1. ストック溶液を準備します。すべてのソリューションは、RNアーゼおよびDNアーゼを含まないことを確認してください。
   1. 400 mMトリス塩酸pHが8.4、200 mMのKCl及び100のMgCl _2：10X塩溶液を準備します_。
   2. 200ミリリットルのために、1X塩溶液中のスクロースの137グラムを溶解：2 Mショ糖液を準備します。
2. 勾配を調製し、表1に記載されるように、塩溶液中のスクロース溶液を希釈。指定されたボリュームは6勾配のためのものです。

最終スクロース濃度

スクロース2M（ミリリットル）

塩溶液1X（ミリリットル）

Results

文献では、ポリソームプロファイルは、多くの場合、すなわち、上から下へ、勾配が収集されている方法の結果として、軽質留分からの重質留分に示されています。ここで説明されたプロトコルで勾配が下から上に収集されているので、我々が表示さプロファイルは、重質留分（ポリソーム）で始まり、軽質留分（無料リボソームサブユニットとのRNA）（ 図2A）にアクセスしてください。それから6 2mLの画分にそれぞれ勾配を収集するが、ポリソームの含有量のより詳細な分析を行う必要がある場合、小さい方の画分を採取することができます。

マージとモノソームピーク（ 図2D）に曲線を正規化することは、異なるラインまたは増殖条件からのプロファイルの比較を可能にします。これは、独立して、開始のレベルのポリソームの相対的な量の情報を提供します。にもう一つの方法プロファイルをnalyze、曲線下面積を計算することが、一つはmonos.......

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、ポリソームプロファイルを生成し、ポリソーム、単一リボソーム、またはリボソームを含まないmRNAを単離するための簡単で安価な方法です。さまざまなポリソーム分画法が文献に記載されています。ここで説明した方法は、必要な化合物のみを保持するように最適化されており、植物材料に適応しています。特に、界面活性剤¹¹ の量を減らし、クロラムフェニコールを緩衝液に添加して、クロロプラスチックリボソームをmRNAに固定しました(シクロヘキシミドがサイトゾルリボソームに対して行うように)¹² 。また、超遠心分離の総時間も短縮しました⁷。

高品質のポリソームプロファイルを得るには、集めたばかりの植物材料を使用し、すべてのステップを4°Cで行うことが不可欠です。翻訳活性が低い組織を使用する場合、より多くの植物材料をグラジエントにロードできます(最大600 mg)。

ポリソームプロファイルの分析は、細胞¹³ の全体的な翻訳状態と特定のmRN.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
超遠心チューブ、薄肉、ポリアロマー - 13.2 ml	ベックマン・コールター	331372
超遠心チューブ、薄壁、ポリアロマー - 38.5 ml	ベックマン・コールター	326823
ガラス毛細管	ドラモンド・サイエンティフィック	1-000-1000
超遠心	ベックマン・コールター	オプティマ シリーズ
超遠心分離機ローター SW41	ベックマン・コールター	331362
超遠心ローター SW32	ベックマン・コールター	369650
蠕動ポンプ	任意の
タイゴン R3607 ポリ塩化ビニルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	070534-22	ポリ塩化ビニルチューブ、2.29 mm
フラクションコレクター モデル 2110	バイオ・ラッド	731-8120
UV キュベット	Hellma	170.700-QS	クォーツ フロースルー キュベット
UV 分光光度計	Varian	Cary50	0.0125 秒ごとに読み取り
すべての化学物質	任意の		使用のみ 分子生物学グレード
Murashige and Skoog 基礎塩混合物 (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnaseフリー水	任意の
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィ	10083251
オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、分岐(Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Linear アクリルアミド(アクリルキャリア)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA precipitation carrier
OriginPro 8	OriginLab		解析ソフトウェア