工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Summary

このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。

Abstract

mRNAのタンパク質への翻訳は、基本的で高度に制御された生物学的プロセスです。ポリソームプロファイリングは、翻訳調節の解析におけるゴールドスタンダードと考えられています。ここで説明する方法は、さまざまな植物組織からポリソームを分画するための簡単で経済的な方法です。ショ糖グラデーションは、グラデーションメーカーを必要とせずに、各レイヤーを順番にフリーズすることで作成されます。次に、シクロヘキシミドとクロラムフェニコールを含む緩衝液で細胞質抽出物を調製し、細胞質および葉緑化リボソームをmRNAに固定化し、ショ糖勾配にロードします。遠心分離後、6つのフラクションが超遠心チューブを貫通することなく、グラジエントの底部から上部に直接収集されます。収集中、260 nm の吸光度を連続的に読み取って、全体的な翻訳活性のスナップショットを提供するポリソームプロファイルを生成します。次に、フラクションをプールして3つの異なるmRNA集団を調製します:ポリソーム、いくつかのリボソームに結合したmRNA。モノソーム、1つのリボソームに結合したmRNA。リボソームに結合していないmRNA。その後、mRNAが抽出されます。このプロトコールは、シロイヌナズナの苗木や成体植物、Nicotiana benthamiana、Solanum lycopersicum、Oryza sativaの葉など、さまざまな植物や組織で検証されています。

Introduction

タンパク質合成は、すべてのセル¹において不可欠とエネルギー的にコストのかかるプロセスです。まず第一に、細胞は、翻訳機構、リボソームの生産にエネルギーを投資しなければなりません。例えば、活発に分裂酵母細胞は毎分ほど2,000リボソームを生成します。このような生産は、総転写活性の60％及びセル²の全スプライシング活性の最大90％までを必要とします。また、エネルギーは、アミノ酸、アミノアシルtRNAおよびペプチド結合の合成に必要とされます。植物では、ATP ³の4.5〜5.9分子からペプチド鎖コスト1つのアミノ酸を付加します。したがって、変化する環境条件に対処することになる場合は特に、タンパク質へのmRNAの翻訳を調節する主要な部位であることは驚くべきことではありません。

リボソームとmRNAの関連で翻訳の開始段階では、規制の主なターゲットであります翻訳^4。翻訳の調節の結果、ならびに他の転写後調節ステップとして、タンパク質濃度の変動の40％のみがmRNA量^5,6によって説明することができます。このように、全mRNAの研究は、タンパク質存在量についての比較的低い情報を提供します。一方、リボソームとmRNAの関連は、翻訳に関与するそれらのmRNAへのアクセスを与えることによって、タンパク質存在量より深い洞察を提​​供します。積極的に翻訳されたmRNAはポリソームと呼ばれる構造で、いくつかのリボソームに関連付けられています。逆に、不十分な翻訳mRNAは唯一のリボソーム（モノソーム）に関連付けられます。その結果、mRNAの翻訳状態はリボソーム⁷との会合をモニターすることによって評価することができます。

このプロトコルは、6日齢のシロイヌナズナの苗、RNAのその後の単離、および結果の分析からポリソームの単離を記載しています。ポー川lysom​​esとmonosomesは、ショ糖密度勾配を介して分離されています。勾配は6画分に回収されます。ポリソーム、monosomesおよび軽質留分（以下、上澄み液と呼ばれる）、リボソームに関連付けられていないフリーの60Sおよび40SリボソームサブユニットとのmRNAが含まれています：画分の一部は、3つのよく分離された画分を得るためにプールされています。グローバル翻訳活性、およびポリソームプロファイルを比較することにより、曲線下面積の積分によって決定されるポリソーム/モノソーム比を生成することによって推定することができます。 mRNAおよびタンパク質は、次いで、異なる画分から抽出し、RT-PCR、定量RT-PCR、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ウエスタンブロットまたはプロテオミクスによる分析のために使用されます。このプロトコルは、他の植物との組織のために検証されています。

このプロトコルを実行するために必要な装置は、一般に、ほとんどの実験室で見られる：勾配メーカーは必要ありません。次のいずれかの防止加える前に、それぞれの層を凍結層の任意の組合せや外乱からの。いいえ管穿孔は、勾配のガラス毛細管を浸漬することによって達成することができる傾斜収集のために使用されません。したがって、高価な超遠心管が無傷のままであり、何度も再利用することができます。まとめると、これは本プロトコルポリソームプロファイリングのための簡単​​かつ安価な方法になります。

Protocol

20〜50％（w / v）のスクロース勾配の調製

注：勾配13.2 mlの超遠心分離管中のスクロースの4層（50％、35％および20％の2層）で形成されています。我々の経験では、2つの別個の層では20％スクロースを注ぐことは大いにポリソーム製剤の品質が向上します。

1. ストック溶液を準備します。すべてのソリューションは、RNアーゼおよびDNアーゼを含まないことを確認してください。
   1. 400 mMトリス塩酸pHが8.4、200 mMのKCl及び100のMgCl _2：10X塩溶液を準備します_。
   2. 200ミリリットルのために、1X塩溶液中のスクロースの137グラムを溶解：2 Mショ糖液を準備します。
2. 勾配を調製し、表1に記載されるように、塩溶液中のスクロース溶液を希釈。指定されたボリュームは6勾配のためのものです。

最終スクロース濃度	スクロース2M（ミリリットル）	塩溶液1X（ミリリットル）	最終巻。 （ml）を
50％	8.8	3.2	12
35％	12.9	12.1	25
20％	7.4	17.6	25
20％	5.8	14.2	20

表ショ糖液の1希釈は6勾配を作製しました。

3. 表2のとおり層を注ぎます。

スクロース層	50％	35％	20％	20％
巻。 （ml）を	1.85	3.65	3.65	1.35

層あたりのショ糖溶液を表2巻。

4. それぞれの層を注いだ後、次のショ糖の層を追加する前に、完全に凍結するまで℃の冷凍庫-40℃または-80にチューブを保持します。凍結は、通常、-40℃で2時間後に達成されていますが、次の層を注ぐ前に、約6時間を待ってお勧めします。最後の20％の層を凍結または実験の日に新たに追加することができます。
   注：次のいずれかを追加する前に、それぞれの層をフリーズすると、層の任意の混合または妨害から防ぐことができます。グラデーションは、少なくとも6ヶ月間℃の冷凍庫-40℃または-80に保つことができます。
5. それはまだ行われていない場合は、実験の日に勾配に最後の20％の層を追加します。そして、勾配は低温室または冷蔵庫内で解凍しましょう​​。

サイトゾル抽出物の調製

注：私たちはrecomm生体試料ごとに2つの勾配を使用して終了します。 300 mgを6日齢のシロイヌナズナの苗で作業するときに、2つの勾配を準備する植物材料の最適量です。以下翻訳活性組織を操作する場合、植物材料の量は600ミリグラムまで増加させることができます。

1. 液体窒素中で急速凍結することにより、1％スクロースまたは同等のメディアを補っ½ムラシゲ・スクーグ⁸培地上で増殖させ、収穫6日齢の実生
2. 液体窒素で予冷乳鉢と乳棒で挽く植物材料。
3. 予冷計量皿に粉末材料の300ミリグラムを秤量します。サンプルの融解を避けるために、迅速に、この手順を実行します。
   注：-80℃の冷凍庫にせいぜい1週間凍結サンプルを保管してください。
4. ^50μg.ml1、予冷ポリソームバッファー（塩溶液4X、5.26 mMのEGTA、0.5％（v / v）のオクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノールは、分枝状^{、50μg.ml-1}シクロヘキシミドの2.4ミリリットルを追加します。クロラムフェニコール）とピペットチップと混合することによって均質化します。 2 1.5ミリリットルチューブに移します。温暖化からサンプルを防ぐために、迅速に作業。
5. 破片をペレット化するために微量で4℃で15分間、16,000×gで遠心分離します。
   注：常に、RNAの分解を防ぐために4℃でサンプルを維持するために、RNアーゼ/​​ DNアーゼを含まない条件でのRNase / DNaseを無料ソリューションと作品を使用。ヘパリンは、RNAの保護を強化するために^{、300μg.ml-1}の最終濃度まで、ポリソーム緩衝液に添加することができます。ヘパリンは、下流分析を妨害することができるので、それは塩化リチウム析出の代わりにエタノール沈殿（参照ノート4.7）を行うことによりRNAを沈殿工程中に除去されなければなりません。

3.ポリソームプロファイリング

1. ペレットを乱さないように注意して上清をピペット。植物片がピペット注入された場合は、ステップ2.5を繰り返します。優しくpipettinによって勾配の上に上清をロードします一定のストリーム内のチューブの側壁の上にグラム。各1.5mlチューブ用の1の勾配を使用してください。
2. （SW41ローターを使用している場合例えば32,000 rpm）で超遠心機で、4℃で2時間45分間175,000×gでバケツや遠心分離機を予冷するために転送します。
3. 図1で説明したように傾斜収集システムを設定する。UVキュベットは、1 mm光路長を有しています。

図1勾配収集システム。UVキュベットは勾配の底部に下降するガラス毛細管にポリ塩化ビニルチューブにより接続されています。勾配は、システムを介して蠕動ポンプのおかげで進行します。 OD _260が連続的_に読み取られ、2ミリリットル画分を集めている。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

4. RTにフラクションコレクターを調整し、2ミリリットルの分画の収集を可能にするであろう速度でカルーセルを設定します。あらかじめ冷却したコレクションチューブを使用してください。
5. 傾斜収集システムにポリ塩化ビニルチューブで接続されたガラス毛細管を用いて下から上への画分を収集します。ポリ塩化ビニル管とガラス毛細管との間の接続を保護するためにプラスチックパラフィンフィルムを使用します。
6. 勾配の下から上に260 nmの吸光度を読みます。全体の勾配が収集されると、RNA抽出の前に氷上で回収チューブを配置します。

4. RNA抽出

1. 以下のように、遠心管をキャップした50ミリリットルで2勾配から回収した画分を、プール：
   ポリソーム：画分1〜3（11 ml）を
   Monosomes：画分4（4ミリリットル）
   上清：フラクション5と6（8ミリリットル）
2. 各画分に、1容量を追加します。 8Mグアニジン塩酸塩50μgのアクリルキャリアおよび1.5容量。イソプロパノール。
   注：アクリル担体はアルコール沈殿中の核酸の回収率を改善するための共沈剤として使用し、直鎖状アクリルアミドです。
3. チューブを転倒混和し、-20℃でO / N物を沈殿。
4. 超遠心機で4℃、（SW32ローターで32,000 rpm）で1時間175,000×gで遠心分離します。沈殿工程は、超遠心分離と互換性がありませんチューブ内で行われている場合は、適切なチューブに移します。
5. 上清を捨て、200μlのRNaseフリーのTE緩衝液（10mMのTris-HCl pHが7.5から1 mMのEDTA）でペレットを溶解します。新しい1.5 mlチューブに移します。
6. 1容量を追加することにより、RNAを抽出します。水飽和フェノール液（pH 6.6）および1巻。クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）。勢いよく混ぜます。 4℃で20分間、15,000×gで遠心分離します。新しい1.5 mlチューブに水相を転送します。
   注：酸フェノール液（pH 4.5）DNAの混入を最小限にするために使用することができます。
7. 1/10体積を添加することにより、RNAを沈殿させます。 3 M酢酸ナトリウムと3体積100％エタノール。 -20℃で20分間またはO / Nのため-80℃での沈殿を許可します。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。
   注：ポリソームバッファ（参照ノート2.5）にヘパリンを使用する場合は、適切に下流分析⁹に干渉する可能性ヘパリンの痕跡を除去するための塩化リチウム（LiClの）降水量の代わりにエタノール沈殿を行います。抽出した後、2.5 Mの最終濃度までのLiClを追加し、-20℃またはOで/ N 4℃で30分間沈殿を許可します。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。
8. 500μlの75％エタノールでペレットを洗浄。空気は、ペレットを乾燥し、30μlのTE緩衝液に溶解します。 RNAseを含まない1.2％アガロースゲル（100V、15分）、またはキャピラリー電気泳動法により電気泳動によってRNAの質を評価します。

5.データ解析

1. グラフィックおよびデータ分析ソフトウェアにエクスポートした生データ。
   注意： 図2AおよびBに示すように、生のプロファイルは、定性的な情報を与える：見ることができますポリソームピークの数、モノソームピークの高さ、および無料のリボソームサブユニットに対応する肩の存在を。
2. サンプル間のプロファイルの比較を可能にするために、プロファイルをマージします。各サンプルのモノソームピークのX値を決定するために、スクリーンリーダーツールを使用して、曲線の先頭に余分なデータポイントを除去することにより、モノソームピークを合わせます。曲線の最低点を特定し、そのY値（スクリーンリーダーツールを使用して）を決定します。 「セットの列値」機能を使って、0に最低点のY値を設定します。
3. 生プロファイル（ 図3C）からの曲線下面積を積分することによってポリソーム/ monosomes比を決定します。統合される領域の境界を定義するデータ選択ツールを使用します。そして、統合機能（分析 - 数学）を使用します。
4. ノーマライズ（スクリーンリーダーツールを使用して決定）モノソームピークの頂上のY値によって曲線のすべてのデータポイントを分割することによってモノソームピークにカーブ。列を選択し、[分析 - 数学の下で、ノーマライズを選択し、「指定した値で割った "メソッドを選択します。このステップは、ポリソームの相対レベル（ 図3D）の比較を可能にします。

図2.代表的ポリソームプロファイル。 シロイヌナズナ野生型（WT、生態型COL-0）と変異苗が長い一日の光周期（16時間明、8時間暗）下½ムラシゲ・スクーグ培地上で6日間増殖させました。 ：重量苗からの生ポリソームプロファイル。 B：変異苗からの生ポリソームプロファイル。 C：曲線Dの下の面積の積分によりポリソームとmonosomesの割合の決意：ポリソームPROFIレモノソームピークに正規化された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Results

文献では、ポリソームプロファイルは、多くの場合、すなわち、上から下へ、勾配が収集されている方法の結果として、軽質留分からの重質留分に示されています。ここで説明されたプロトコルで勾配が下から上に収集されているので、我々が表示さプロファイルは、重質留分（ポリソーム）で始まり、軽質留分（無料リボソームサブユニットとのRNA）（ 図2A）にアクセスしてください。それから6 2mLの画分にそれぞれ勾配を収集するが、ポリソームの含有量のより詳細な分析を行う必要がある場合、小さい方の画分を採取することができます。

マージとモノソームピーク（ 図2D）に曲線を正規化することは、異なるラインまたは増殖条件からのプロファイルの比較を可能にします。これは、独立して、開始のレベルのポリソームの相対的な量の情報を提供します。にもう一つの方法プロファイルをnalyze、曲線下面積を計算することが、一つはmonos...

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、ポリソームプロファイルを生成し、ポリソーム、単一リボソーム、またはリボソームを含まないmRNAを単離するための簡単で安価な方法です。さまざまなポリソーム分画法が文献に記載されています。ここで説明した方法は、必要な化合物のみを保持するように最適化されており、植物材料に適応しています。特に、界面活性剤¹¹ の量を減らし、クロラムフェニコールを緩衝液に添加して、クロロプラスチックリボソームをmRNAに固定しました(シクロヘキシミドがサイトゾルリボソームに対して行うように)¹² 。また、超遠心分離の総時間も短縮しました⁷。

高品質のポリソームプロファイルを得るには、集めたばかりの植物材料を使用し、すべてのステップを4°Cで行うことが不可欠です。翻訳活性が低い組織を使用する場合、より多くの植物材料をグラジエントにロードできます(最大600 mg)。

ポリソームプロファイルの分析は、細胞¹³ の全体的な翻訳状態と特定のmRN...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
超遠心チューブ、薄肉、ポリアロマー - 13.2 ml	ベックマン・コールター	331372
超遠心チューブ、薄壁、ポリアロマー - 38.5 ml	ベックマン・コールター	326823
ガラス毛細管	ドラモンド・サイエンティフィック	1-000-1000
超遠心	ベックマン・コールター	オプティマ シリーズ
超遠心分離機ローター SW41	ベックマン・コールター	331362
超遠心ローター SW32	ベックマン・コールター	369650
蠕動ポンプ	任意の
タイゴン R3607 ポリ塩化ビニルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	070534-22	ポリ塩化ビニルチューブ、2.29 mm
フラクションコレクター モデル 2110	バイオ・ラッド	731-8120
UV キュベット	Hellma	170.700-QS	クォーツ フロースルー キュベット
UV 分光光度計	Varian	Cary50	0.0125 秒ごとに読み取り
すべての化学物質	任意の		使用のみ 分子生物学グレード
Murashige and Skoog 基礎塩混合物 (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnaseフリー水	任意の
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィ	10083251
オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、分岐(Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Linear アクリルアミド(アクリルキャリア)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA precipitation carrier
OriginPro 8	OriginLab		解析ソフトウェア