初代ヒト胎盤（絨毛）及び脱落膜の器官培養を確立するための簡単な方法が記載されています。絨毛および脱落膜器官培養は、人間の母体胎児の界面での病因を研究するための貴重なツールです。通性細胞内細菌リステリア菌による感染が実証されています。
この記事について
サマリー
要約
胎盤は、種間の解剖学的変動の大きな度合いを示しています。最良のヒト胎盤の生物学及び病態生理学を理解するには、ヒトの細胞および組織を用いた実験を設計することが不可欠です。器官培養の利点は、三次元（3D）構造組織および細胞外マトリックスの維持です。ここで説明する方法の目標は、ex vivoでヒトの妊娠組織器官培養し、72〜96時間のために彼らの健全な培養維持の成功確立です。プロトコルは、手術室から新鮮な研究承諾、胎盤および脱落膜標本の即時処理を詳述します。これらは、そうでなければ廃棄される豊富な標本です。 3Dの器官培養を確立するために、適切な組織を選択する方法についての形態学的な詳細を含むこれらの試料の無菌コレクションの詳細については、提供されています。胎盤絨毛および脱落膜組織を2〜3mmで粉々に顕微解剖されていますそして数日間の行列が並ぶトランスウェルフィルター上に別々に配置し、培養しました。絨毛および脱落膜器官培養は、ヒト宿主 - 病原体相互作用の研究に適しています。他のモデル生物と比較して、これらのヒトの培養物は、宿主特異性の可変パターンを示す病原体感染のメカニズムを調べるために特に有利です。例として、我々は臨床的に関連する、通性細胞内細菌性病原体リステリア菌で胎盤および脱落膜器官培養の感染を実証します。
概要
母体胎児の界面での感染症や炎症は、女性と子供の罹患率と死亡率の主要な供給源を表します。病原体はこれらの組織に感染する方法を理解することは、早産や胎児死亡などの疾患を予防し、治療するための新規戦略の開発のために重要です。しかし、母体胎児のインターフェイスの高い種間のばらつきは、実験調査を複雑にしています。さらに、ほとんどの微生物病原体は、このように多くの動物モデルは、完全にヒトの感染症を再現することはできません、ホスト特異性を示します。このような、リステリア菌などの他は、宿主特異1の複数の中間レベルを示しているが、特定の生物（ インフルエンザ菌 、 チフス菌 、 コレラ菌 、および多数の他）は、ヒトにおいて厳密に病原性です。特異性は、免疫回避4、普及3、植民地化2を含む、病因の多くの側面に記載されているホストアップ、および栄養取得5。したがって、最適なホストモデル系を選択することが最も重要です。
胎児細胞と母体の血液から成る、胎盤は急速に妊娠6にわたって開発器官です。簡単に言えば、ヒト胎盤は、母体血を浴びた胎児「絨毛」ツリー状の構造で構成されています。ガスおよび栄養交換が絨毛木の表面に並ぶ栄養芽細胞と呼ばれる特殊な胎児の細胞層にわたって発生します。母体の子宮粘膜内層、非妊娠女性に子宮内膜と呼ばれる、胎児胎盤ユニットを収容するために脱落膜に構造的および機能的に変換します。絨毛木は脱落膜にセル列を固定から移動絨毛外栄養膜（EVT）によって子宮に固定されています。母体胎児のインターフェイスは、したがって、脱落膜と胎盤から構成されています。
器官培養技術は、ここに記載さL.を含むどこで、どのように臨床的に関連するヒト病原体を検査するために使用されていますmonocytogene sおよびトキソプラズマ原虫は 、胎盤関門2,7を渡ります。これらのex vivoでの器官培養は、 生体組織構造内で複製し、間違いなく生理的に人間の胎盤形成のための関連性の高いモデル系です。追加の培養技術は、3Dマトリックスに埋め込まれた全臓器外植片、器官スライス、および組織または幹細胞オルガノイドを含みます。これらのオプションの詳細については、総合的な最近のレビュー8を参照してください。このプロトコルは脱落膜と胎盤絨毛の別々の培養のためであることに注意してください。胎盤細胞と脱落膜細胞との間の相互作用を研究するため、共培養技術が好ましい場合があります。私たちは、栄養膜媒介脱落膜血管リモデリング9-11を研究する研究者によって使用され、以前に記載絨毛-脱落膜共培養技術に興味のある読者を参照してください。
プロトコル
実験は、ヘルシンキ宣言で表現原則に従って実施しました。この研究は、カリフォルニア大学の治験審査委員会、サンフランシスコ（CHRの＃11から05530）によって承認されました。すべての患者は、サンプルとその後の分析の収集のための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。組織を脱同定検体として採取しました。
注：研究者がその制度ヒト被験者の審査委員会の承認を得なければなりません。妊娠歴または胎盤異常に基づいて試験片の除外は、特定の研究のニーズに応じて異なります。
注：適切な安全条件（バイオセーフティーレベル2）は、このプロトコル12のすべてのステップのために利用されるべきです。
コレクションの日の前に1.準備、
- オートクレーブストレーナー/収集のための鉗子、および顕微解剖用ハサミ/ピンセット。
- 十分な洗浄緩衝液の量（試料あたり500ミリリットル）（再準備）レシピについては、 表1にFER。
- 0.22μMの滅菌濾過されたコレクションのメディアの適切な量を（試料当たり100ミリリットル）（レシピについては表1を参照）を準備します。
- 一定分量外マトリックス（ECM、詳細については、 試薬の表を参照）長期保存のために。
- -20℃で固体の形で保管ECM。最高のパフォーマンスを得るために、繰り返し凍結融解を避けます。雪解け4℃で粘性の溶液に、ボトル、およびチルドピペットチップと低温室で300μlのアリコートを準備します。分注して-20℃で保管。
新鮮な組織の2コレクション
注意：新鮮なヒト組織で作業する場合、研究者は血液媒介病原体の伝播を防止するためのユニバーサル注意事項（OSHA）に従う必要があり、適切な制度的な訓練を受けていなければなりません。手袋、眼の保護、および白衣を含む適切な個人用保護具は、必要です。
- 輸送オートクレーブ・ストレーナ（試料ごとに）、オートクレーブ、鉗子、洗浄緩衝液（カーボイ）、収集培地（50mlコニカルチューブ内の試料につき25 ml）で、スプレーボトル、10％漂白剤、70％エタノール、組織収集トレイ、シャーピー、およびアイスバケット/病院/診療所にクーラー。
注：標本は手術室に近い部屋に位置する研究指定空間に収容されます。滅菌組織培養フードは必須ではありませんが、コレクションが迅速に行われるべきと以下に説明するように、研究者は、表面を適切に消毒する必要があります。 - ウォッシュの場所カーボイをシンクに隣接バッファー、10％の漂白剤、70％エタノールで栓をスプレー。光源（光パッドやライトボックス）に置き、ガラス組織収集トレイ、および10％の漂白剤、70％エタノールで消毒します。空気乾燥することができます。
- 試料準備室に手術室から臨床医のキャリー標本を持っています。シンクでは、組織を数回すすぎ、滅菌手持ちストレーナの上に試料を注ぎました時間バッファは、光源の上に消毒ガラストレイにバッファ内の標本全体を転送します。
注：臨床医による組織の評価が最優先であり、臨床医は口頭で彼/彼女は、評価が終了したことが示された後、このようにして、次の手順をのみ実行されます。 - コレクションの胎盤の絨毛および脱落膜（ 図2Aと3A）を選択し 、50ミリリットルコニカルチューブを分離するために転送するために滅菌ピンセットを使用してください。妊娠期間でチューブにラベルを付けます。
注：優先在胎齢は、それぞれ、9未満週間で、胎盤および脱落膜未満16週間。機関では、各試験片の一部だけは、適切な組織は、臨床病理学的診断のために維持しなければならないとして、研究目的のために調達されています。 - 研究室に氷上で保存および輸送標本。
- コレ間に10％漂白剤、70％エタノールを用いて上記のように複数の試料を収集するために、ガラストレイをサニタイズ各試験片のction。
器官培養プレートの調製
注：以下の手順は、組織培養フード内で無菌技術を使用して行われるべきです。解剖顕微鏡は、無菌領域内に配置されることが理想的です。しかし、これは、長い微小切開が迅速に行われ、器具は、70％エタノール中で頻繁に浸漬するように絶対的に必要ではありません。
- 氷上で解凍ECMバイアル（複数可）。ピペッティングにより混合し、氷冷コレクション培地で1：ECM 1に希釈します。ピペットは、ゆっくりと気泡を導入しないようにします。 6ウェル組織培養プレートの各ウェルは、この懸濁液100μlを必要とし、3-4器官培養物を収容します。
- 6ウェル組織培養プレートの各ウェルに置きトランスウェルインサート（孔径0.4μM）。
- コートは、各ECM /メディア懸濁液の薄層（100μl）を用いて挿入するトランスウェル。
- 氷の上にプレートを置き、すぐにestablishmenに進みます器官培養のトン。また、前、後の使用のために4℃でパラフィルムや店舗でそれをラップし、その場合には組織収集にプレートを準備します。 ECMが乾燥ますように長い6時間以上保管することはお勧めできません。
4.設立オルガンの文化
注：この手順は、別のトランスウェルに脱落膜器官培養および絨毛器官培養を配置する方法について説明します。組織が接触していません。脱落膜及び絨毛が互いに直接接触している共培養技術に興味を持って研究者らは、先行文献9,10を参照することができます。
- コレクション媒体に二回の試験片をすすぎ、各すすぎの間千×gで遠心。解剖顕微鏡のステージ上に滅菌ペトリ皿や場所に組織を転送します。顕微鏡に隣接し、氷上で6ウェルプレートを保管してください。
- 、ハサミやピンセット解剖滅菌スプリンガーで組織をマイクロ解剖2〜3ミリメートル絨毛器官培養を確立するために、S（ 図2A）。
注：絨毛器官培養は、2または3支店を持つ、著名な絨毛外栄養膜（EVT）セル列11と小、よく血管新生した「木」です。 ECMへの絨毛外栄養膜の侵入が最もこれらの若い年齢13で発音されるように、<9週妊娠初期の検体からのみ絨毛組織を活用することが重要です。 - 著名なEVTセル列とよく血管新生した絨毛を選択します。 EVTセル列は球根、「ファジー」、「ふわふわ」が終了する（ 図2（a）の矢印の先を参照）として可視化されます。
- 各トランスウェルに3または4絨毛木を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。ツリーがECMと個別の凝集した枝の上に平らに配置されているように枝を調整します。
- 3ミリメートル3脱落膜器官培養（ 図3A）を確立するために、無菌スプリンガー解剖ハサミやピンセットで脱落膜組織をマイクロ解剖。
注：標本は2投を含んで（左右の組織片、 図3A）脱落膜組織、壁側脱落膜と被包脱落膜の着色したタイプ。 - 壁側脱落膜の3ミリメートル3作品を作成するために、はさみで切り取ります。被包脱落膜は、これらの培養のために使用されていません。任意の凝固母体血を離れていじめるために鉗子を使用してください。
- 各トランスウェルの中に脱落膜の3-4個を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。
- 井戸の底に収集メディアの1ミリリットルを追加します。 5％CO 2中で37℃で一晩プレートをインキュベート
- 実験のためには、正常な妊娠初期の胎盤の酸素張力を模倣する相対的な低酸素（3％O 2）で絨毛器官培養を維持することが重要です。
注：研究室のオプションは、小さな既存のインキュベーター内に収まる低酸素インキュベーター室、または酸素濃度を低下させるために外部のN 2ガ スを導入し、トライガスインキュベーターが含まれます。 - （絨毛または脱落膜培地の1ミリリットルを追加タブル1）トランスウェルの上部に文化の12-16時間後。
注：文化の中で最初の一晩の間にメディアが存在しない場合は、絨毛外栄養膜細胞の列が（絨毛文化）に侵入することを可能にし、組織のために（絨毛および脱落膜の両方）しっかりとECMに埋め込まになること。我々の経験では、脱落膜器官培養は、96時間、72時間および絨毛器官培養に生存したまま。我々は、この時間枠内に収まる実験のエンドポイントをお勧めします。絨毛および脱落膜培地の組成については、 表1を参照してください。脱落膜媒体が脱落膜化状態（ 表1）を維持妊娠ホルモン（プロゲステロン、17βエストラジオール）を補充しながら絨毛培地は、FBSの高い割合を有します。
L. 5.準備モノサイトゲネスの文化
注：L.の長期保存に関する詳細なプロトコルの場合モノサイトゲネス 、及びTHIの文化と成長ブレインハートインフュージョン（BHI）ブロスおよび寒天中の生物は、Wang らを参照してください。14
- 単一L.ピック画線BHI寒天プレートからコロニーをモノサイトゲネスおよびBHIブロスの3ミリリットルを接種します。
- L.をインキュベート30℃で、斜めの位置で、一晩（16時間）文化をモノサイトゲネス 。
注：これらの培養条件は、細菌増殖が定常期に到達することを可能にするL.モノサイトゲネスは、宿主細胞の浸潤15を増加させる30℃にて鞭毛れます。
L.との器官培養の6感染モノサイトゲネス
- 温かいPBSおよび絨毛または脱落膜媒体（ 表1）37℃です。
- ECMに侵入しなかったため、十分に浮遊している任意の器官培養片を除去するために滅菌ピンセットを使用してください。
- 慎重にトランスウェルの底からメディアを吸引除去します。静かに戦争の1ミリリットルをピペットで二度、上下のトランスウェルをすすぎますウェルにPBSをM、と慎重の間で吸引します。優しく上下のトランスウェルに抗生物質を含まない絨毛または脱落膜メディアの1ミリリットルをピペット。器官培養を乱さないように注意してください。
- 組織は、抗生物質が除去されていることを確実にするために、少なくとも時間抗生物質を含まない培地中でインキュベートしてみましょう。
注：L.の固定相での密度モノサイトゲネスの文化はミリリットル当たり約1×10 9コロニー形成単位（CFU）です。器官培養物を感染させるために使用される細菌の数は、実験的なニーズを満たすために経験的に決定されるべきです。 - 野生型L.のためにモノサイトゲネスルーチン感染実験は（ウェルあたり培地1ml中に4×10 7 リステリア菌 ）一晩の1:50希釈で堅牢な侵入を示しています。抗生物質を含まない絨毛または脱落膜媒体中の細菌の数を適切に再懸濁します。
- トランスウェルの上部から吸引したメディア。静かに接種物の1ミリリットルを追加します。 37でプレートをインキュベート細菌の侵入を可能にするために、5％CO 2でC°。
- 上下のトランスウェルから培地を吸引することにより、細胞外細菌を除去します。温かいPBSでウェルを2回洗浄します。 50μgのml -1のゲンタマイシンを補った絨毛または脱落膜メディアの1ミリリットルを追加します。 5％CO 2中37℃でプレートをインキュベートします。
注：L.モノサイトゲネスは 、細胞外の培地中で増殖する細胞の内部で成長し、細胞外空間にアクセスすることなく、細胞間から広がる可能性が通性細胞内細菌です。ゲンタマイシンは、細胞外L.に殺菌効果がありますモノサイトゲネス 、したがって細胞内のLの測定を可能にします成長をモノサイトゲネスおよび器官培養16を介して広がります。
注：再現性L.絨毛および脱落膜器官培養のモノサイトゲネス感染は5時間のインキュベーション時間で発生します。ゲンタマイシンの添加前のインキュベーション時間は、実験的なニーズおよびABに基づいて修正することができます組織に侵入する生物のility。より良好な感染の最も脆弱な解剖学的部位を理解するために、より短いインキュベーション時間は2を使用することができます。 - 実験期間中、5％CO 2中37℃でプレートを維持します。各ウェル毎日でメディア全体を変更します。
注：私たちの経験では、L.感染し脱落膜器官培養は、72時間、48時間および絨毛器官培養に生存したままモノサイトゲネス 。
組織病理学のための7ハーベストオルガンの文化
- 30ミリリットルのPBSで16％の株式アンプルの10ミリリットルを希釈することにより、4％パラホルムアルデヒドの新鮮な溶液を調製します。 4°Cで保存4％パラホルムアルデヒド、光から保護され、1週間以内に使用します。使用前に室温に持参してください。
- 上下のトランスウェルから培地を吸引。ゆっくり室温でPBSでウェルを2回すすぎます。静かに完全に器官培養をカバーするために上部トランスウェルに1ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを追加します。
- インキュベート20分間室温で4％パラホルムアルデヒドです。これは組織の過剰な固定につながる可能性があるとして、より長いインキュベーション時間を避けてください。
- 吸引しパラホルムアルデヒド、室温でPBSでウェルを2回すすぎます。 （「凍結固定」）10月媒体、凍結、クライオスタットのセクションにおける固定器官培養を埋め込みます。一般的には、固定凍結組織は、固定前なしの凍結組織よりセクションに容易です。
注：10月の埋め込 みや凍結切片上で完全なプロトコルについては、公表されたプロトコル17,18から関連するセクションにアクセスしてください。実験的なニーズや利用可能な実験装置やストレージに応じて、組織ではなく、パラフィン包埋し、ミクロトーム19に区分することができます。 - さらにルーチンヘマトキシリン＆エオシン染色、免疫蛍光法、または免疫組織化学18,20,21のための組織スライドを準備します。
結果
（ゼリドビッチ＆Bakardjiev 22から変更） 図1は、関連する胎盤と子宮の解剖学的構造を図である。 図3は、脱落膜組織を実証しながら、 図2は 、代表的なグロスと胎盤絨毛の組織学的画像を示します。
このプロトコルは、最初の病院や診療所で新鮮な胎盤および脱落膜組織の収集について説明しています。採取された検体は、胎児胎盤（絨毛）と母体の子宮コンポーネント（脱落膜）の混合物です。広域抗生物質及び抗真菌剤を含む緩衝液で洗浄した後、全試料を、光ボックスを使用して目で検査します。絨毛および脱落膜は、別々のチューブに入れ、実験室に氷上で輸送されます。研究室では、解剖顕微鏡は、健康な組織の微細形態学的特徴を鑑賞するために使用されます。の代表的な写真絨毛（ 図2A）と脱落膜組織 2つの外部グースネック光源は、参考のために示されて解剖顕微鏡を用いて取得した（ 図3A）。
絨毛器官培養は、最初の学期の検体から生成されています。培養物を2-6支店を持つ小型端末絨毛木で構成されています。絨毛外栄養膜の列に終了し、十分に血管化された絨毛枝を分析することが重要です。これらの機能は、「ふわふわ」や「ファジー」の分岐を終了する（矢じり）、およびその図2Aの左側のツリーの枝を通してコースかすかなピンク色〜赤色の直線色相と見られています。これとは対照的に、血管系および絨毛外栄養膜は容易に培養のための次善のだろうこの画像の右、上の木のために可視化されていません。培養の最初の日が経つにつれて、絨毛外栄養膜は、ECMにトンを移行しますHUSトランスウェル上にマトリクス状に絨毛木を固定します。
脱落膜器官培養は、第1及び早期妊娠第二期の検体から生成されています。全体の子宮のライニングは非常にすぐに移植後の脱落膜に変換されます。具体的には、基底脱落膜が直接胎盤/移植部位の根底にある子宮粘膜を定義し、被包脱落膜は、胎児を覆う粘膜を定義し、壁側脱落膜は、子宮内層の残りの部分を指します。解剖顕微鏡下で可視化は、初期の妊娠試料が（ 図3Aに、それぞれ左右の組織片、）主に壁側脱落膜と被包脱落膜で構成されていることを示している。被包脱落膜が容易にその薄い、膜の性質によって区別されます。器官培養のために、壁側脱落膜は、3ミリメートル3にトリミングされ、 マイクロ解剖ハサミとのadhEを有する断片家賃凝固した血液は、鉗子で除去されます。
一晩のインキュベーションに続いて、組織はL.に感染していますモノサイトゲネス 。プロトコルは、上記の感染症は、通性細胞内細菌16の細胞内増殖および拡散を研究するために使用されるゲンタマイシン保護アッセイに基づいています。抗生物質を含まない培地中の器官培養物をLとインキュベートします5時間モノサイトゲネス 。培養物を培地から細菌を除去するために、滅菌PBSで洗浄します。その後、ゲンタマイシンは、細胞外の生物を除去するために添加されます。我々の研究室からの先行文献には、感染2後の種々の時点で細菌の組織局在を決定するために、免疫蛍光および共焦点顕微鏡を使用していました。器官培養物を4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄され、いずれかの凍結包埋のOCT培地中で、-80℃で保存された、またはパラフィン包埋し、室温で保存しました。組織切片は、STAすることができます免疫蛍光（IF）または細菌や真核生物の細胞局在の免疫組織化学（IHC）分析のためINED。 図2Bは、感染後72時間で8.3週間絨毛器官培養から調製された凍結切片の画像IF代表です。絨毛枝の末端におけるEVTsで重い細菌負荷（緑色蛍光）、およびツリーライニング合胞体栄養細胞（赤色蛍光）層内細菌の相対的な不足に注意してください。染色はL.をローカライズする場合は、以前の研究では、同様の使用しました感染後の異なる時点における絨毛器官培養でモノサイトゲネス 。 72時間、サブ合胞体栄養層とその下の絨毛間質へのEVTからの感染の広がりを超えます。特に、synyctiotrophoblast層は、感染2に耐性でした。
H＆E染色パラフィン包埋脱落膜組織切片の代表的な光顕微鏡画像は、14.3週specimeから調製しますNS は 、 図3Bおよび図3Cに示されています。このECMコーティングされたトランスウェル膜は、 その場での器官培養（ 図3B）を表示するように埋め込 まれていました。画像は、上皮で裏打ち腺（アスタリスク）および内皮で裏打ち血管系（ダイヤモンド）が脱落膜間質細胞区画内に不均一に配置さを示しています。また、可変密度で脱落膜間質に散在母体の免疫細胞が存在します。 IHC染色は、特定の居住者の免疫細胞に比べて細菌の微細解剖局在を決定するために利用することができます。例として、CD14 +マクロファージ（緑色蛍光）血管系の裏地に局在化し、間質（ 図3D）内で散乱され、Lの大きな凝集体ながら、 モノサイトゲネス （赤色蛍光）は感染後48時間で脱落膜間質（ 図3D）で主に観察されます。
| 洗浄緩衝液 | 捕集媒体 | 絨毛メディア | 脱落膜の媒体 |
| PBS | グルタを含むDMEM / F-12 | グルタを含むDMEM / F-12 | グルタを含むDMEM / F-12 |
| ペニシリン100 IU / mlの | ウシ胎児血清、2.5％ | ウシ胎児血清20％ | ウシ胎児血清、2.5％ |
| ストレプトマイシン100μg/ mlの | ペニシリン100 IU / mlの | ペニシリン100 IU / mlの | 17βエストラジオール300 pg / mlで |
| ゲンタマイシン50μg/ mlの | ストレプトマイシン100μg/ mlの | ストレプトマイシン100μg/ mlの | プロゲステロンを20ng / mlの |
| アムホテリシンB 1.25 / mlの | ゲンタマイシン50μg/ mlの | ||
| < / TD> | アムホテリシンB 1.25 / mlの |
表1：メディアのレシピコンポーネントおよび洗浄緩衝液、コレクション媒体、絨毛媒体、及び脱落膜媒体の製造のための濃度。
（A）中の母体の子宮内の胎児胎盤ユニットの図1.胎盤構造。（A）の構造、ボックスの（B）の拡大は、胎児栄養膜（T）は、胎盤絨毛が母体血を浴びるとによって脱落膜に固定されて並んでいることを強調して絨毛外栄養膜（EVT）。絨毛内に含まれては、胎児の血管（FV）、線維芽細胞、および胎児マクロファージです。ゼリドビッチ＆Bakardjiev 22から変更されました。 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 絨毛器官培養-代表肉眼および顕微鏡像 （A）6週間の妊娠期間を有する2つの端子絨毛木、解剖顕微鏡下で見ました。器官培養のためにこの作品が適しています左側の木の枝を通って走る「ふわふわ」が終了（矢じり）と顕著な胎児の血管系に注意してください。 （B）器官培養（在胎齢8.3週）の免疫蛍光顕微鏡リステリア菌と72時間後の感染、絨毛外栄養膜に重い細菌負荷[緑]を強調表示します。 DAPIは、赤、青、およびβHCG+合胞体に示されています。スケールバー= 1ミリ（A）、250マイクロメートル（B）。7 / 54237fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 脱落膜器官培養-代表肉眼および顕微鏡像 （A）脱落膜parietalis [左]と被包脱落膜[右]妊娠期間6週で、解剖顕微鏡下で見ました。 14.3週妊娠期間の脱落膜parietalis器官培養の（B）、H＆E染色切片は、脱落膜間質全体に不均一に編成腺と血管系を示しています。 （ダイヤモンド、◆）および（アスタリスク、*）は、それぞれ、代表的な容器と腺を強調表示します。下端のブラウンラインがエッジに、トランスウェル膜です。 （C）高倍率dにおける14.3週在胎齢の脱落膜parietalis器官培養のH＆E染色切片を脱落膜間質に埋め込まれた筋肉の壁スパイラル動脈をemonstrates。母体の免疫細胞は暗い丸い核と小さく、不規則に間質全体に分散されています。 （D）L.と器官培養48時間後の感染の免疫蛍光顕微鏡モノサイトゲネスは 、脱落膜間質で[赤]、および母体のCD14 +マクロファージ[緑]曲がりくねった血管スペースを裏打ちし、間質に散在する細菌の大規模なゾーンを強調します。スケールバー= 1ミリメートル（A）、250ミクロン（B）、50ミクロン（CおよびD）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
近交系、トランスジェニックおよびノックアウトマウス系統は、堅牢なメカニズムをテストするための実験系に作用することができます。しかし、コア遺伝物質の一般的な保全にもかかわらず、マウスとヒトの機能的ゲノムは調節要素23に有意な差を示しています。これは、動物モデルにおいて有望な前臨床試験は、時には、ヒト患者に再現されていないこと、したがって、驚くべきことではありません。胎盤は、このように、ヒトの疾患24の研究のための動物モデルより少ない理想的なその後のレンダリング、非常に高い種間の多様性を示しています。ヒトおよびマウスの免疫学25、および胎盤の解剖学的構造の顕著な発散進化の顕著な違いの両方を認識し、実験的調査のための人間の妊娠組織のex vivo器官培養の使用を考慮することが賢明です。
このプロトコルで説明、写真画像、および教育ビデオは、上の研究者に指示しますECMコーティングされたトランスウェル組織培養インサート上で絨毛および脱落膜器官培養を確立する方法について説明します。この手法の利点は、特に、このような3次元埋め込みマトリックスまたは器官切片培養のような代替方法と比較して、マイクロ切開の相対的な単純性及び機械的支持のトランスウェルシステムを含みます。膜支持体上の器官培養のサスペンションは、すべての組織表面での栄養交換を可能にし、生存率は、短期培養（絨毛培養のための96時間、脱落膜培養のため72時間）.This技術は、組織でのヒト胎盤生物学を研究することが可能のために維持されています紛れもなくそれ以上の生物学的に関連する単層細胞培養モデルよりレベル、。
このプロトコルの中で最も重要なステップは、器官培養のための適切な絨毛および脱落膜片の顕微解剖です。組織の最適片のための研究者を支援するために写真的に（ 図2Aおよび図3A）を実証しています妊娠標本の可視化が新しく追加されました。これらの細胞はECMに移行し、膜に絨毛を固定するのに役立ちますように、その枝EVTの列に終了絨毛木を選択することが特に重要です。器官培養の両方のタイプのために慎重かつゆったりとした方法で、ピペッティングによりメディアの変更時に組織への障害を最小限に抑えることが有用です。
この技術は、最小限の困難を提示します。機会に、標本は、汚染を示しています。汚染は、通常の細菌（時々ポリ微生物）であり、そして唯一の文化の中で1-2日後に明らかになりました。汚染が観察されたら、漂白剤は、培養物は廃棄し、適用されるべきであり、組織培養インキュベーターは、長期の問題を防ぐために滅菌しました。子宮内感染では、手術中に、収穫/処理検体中、または器官培養メンテナンス時：汚染が発生する可能性のあるいくつかの可能な方法があります。収穫と処理手順は、ほとんどの時間です汚染のための場所を導入します。したがって、試料を収集し、顕微解剖時に操作される時間の量を低減することが重要です。これは、周囲、非無菌環境への試料の曝露を減らすことになります。実験室の設定に応じて、解剖顕微鏡は、無菌の組織培養フードの内側に配置することができます。
医学的に関連する病原体L.感染後器官培養の組織病 理学的分析モノサイトゲネスは 、プロトコルの一つの可能なアプリケーションとしてここに示されています。病原体に対するヒト宿主応答に感染利回り新しい洞察後の両方の細菌と宿主免疫細胞の免疫蛍光局在。脱落膜器官培養は、マウス脱落膜マクロファージの防御機能26,27の欠陥を示す興味深いレポートを含むin vivoでのマウスの感染症、から生成されたデータを検討する補完的なex vivoでの実験手法となる恐れがあります。さらに、人間の組織培養物は、Lのいくつかの同系系統からなる競争接種物として、混合感染戦略において使用することができますモノサイトゲネス 。器官培養の競争感染は、ヒト宿主内の毒性因子の妥当性をテストするための感度の高い方法です。この方法の制約は、短期培養（絨毛培養のための96時間、脱落膜培養のための72時間）に制限されている組織の生存率、です。これは、L.として急成長中の微生物に感染するのに最適ですモノサイトゲネスが、より長い培養は、確立し、組織を介して拡散するのに時間がかかる病原体のために必要があるかもしれません。
妊娠合併症のグローバルな負担を軽減するために、研究は、人間の母体胎児のインターフェイスの病態生理を理解することに焦点を当てる必要があります。細菌、真菌、および妊娠や胎児感染の合併症を壊滅的な胎児の原因に母親から渡るウイルス性病原体。実験室の肛門のインビボ感染制御MALSは、典型的には、病原体がコロニーを形成し、臓器28間の輸送方法を対処するためのゴールドスタンダードと考えられています。胎盤の解剖学的構造は、哺乳動物種間で顕著に変化するので、それは研究戦略にヒト組織を組み込むことが最も重要です。ヒト絨毛および脱落膜の器官培養は、宿主 - 病原体相互作用を調べるために関連性の高いモデル系です。この重要な、まだよくわかっていない臓器を研究するために、研究者は、このような、ここで説明したように器官培養戦略を使用して、そうでなければ捨てヒト胎盤および脱落膜標本の豊富を活用することができます。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、有益な議論をしてくれたクリスティーナ・ファララとデビッド・ロウに感謝しています。マーク・ワインスタイン氏とサンフランシスコ総合病院病理部の専門家のアドバイスに感謝します。この作業は、国立衛生研究所の助成金 R01AI084928 と A.I.B へのバロウズ ウェルカム基金 41259 によって支援されました。G.A.R.は、F32AI108195、Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research助成金、およびUniversity of California Partnerships for Faculty Diversity President's Post-doctoral Fellowshipの支援を受けました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 滅菌ポーチ | フィッシャーサイエンティフィック | 01-812-54 | 個々の解剖ツールのオートクレーブ用 |
| ファインメッシュストレーナー | クイジナート (Amazon.com) | NA | 組織採取前にアルミホイルとオートクレーブで完全に包みます。 |
| スピゴット付きカーボーイ | フィッシャーサイエンティフィック | 03-007-647 | ウォッシュバッファーの大量調製用。 |
| アイスパック | Nortech labs | GB8818 | これらは購入する必要はなく、パッケージに含まれる通常の実験室の出荷からリサイクル/再利用できます。 |
| 70%エタノール | VWR | V1001 | dH20を190または200プルーフの研究用グレードのアルコールに添加して作られた70%溶液。 |
| 10% 漂白剤 | ワキシー サニタリー サプライ | CLO 30966 | dH20 を添加して作られた 10% 溶液。 |
| ライトボックス | ライトボックスルミナ(dickblick.com) | 55305-2009 | 交換用電球はBlick(55305.0100)でも購入されていることに注意してください |
| マイクロ解剖鉗子 | ストールティング | 52102-43 | 4インチ、1 x 2 x 0.5 mm3、わずかなカーブ |
| マイクロ解剖鉗子 | Stoelting | 52102-06 | 4インチ、ストレートファイン、シャープマイクロ |
| 解剖vannasスプリングはさみ | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas スプリングハサミ、8.5 cm、0.33 チップ、わずかなカーブ |
| 解剖顕微鏡 | ライカ マイクロシステム | MZ16 または M60 | リストされたモデルで成功を収めています。 外部グースネックフレキシブル光源は便利ですが、必須ではありません。 |
| 50 mlコニカルチューブ | Sigma-Aldrich(コーニング) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered | Saline Gibco(ThermoFisher Scientific) | 10010023 | 私たちは大学の組織培養コア施設から購入します。このような代替オプションが利用可能です。 |
| 10x リン酸緩衝生理食塩水 | Teknova | P0195 | 洗浄緩衝液の調製には、10x PBS |
| DMEM/F-12 栄養混合物 (ハム) と GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | を使用します 2.438 g/L 重炭酸ナトリウム、55 mg/L ピルビン酸ナトリウム、4.5 g/L グルコース |
| ゲンタマイシン | サーモフィッシャー サイエンティフィ | ック 2.438 | g/L を含むこの特定の培地製剤を購入します1、000x在庫。アリコートを-20°Cで調製して保管することをお勧めします。凍結/融解を避けるためのC。 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Gibco (サーモフィッシャーサイエンティフィック) | 15140-122 | 100x stock. アリコートを-20°Cで調製して保管することをお勧めします。凍結/融解を避けるためのC。 |
| アムホテリシンB | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. アリコートを-20°Cで調製して保管することをお勧めします。凍結/融解を避けるためのC。 |
| プロゲステロン | Sigma-Aldrich | P8783 | 1 mM ストック溶液は、15.7 mg のプロゲステロン粉末を 15.7 ml エタノールに再溶解し、34.3 ml PBS を添加して調製されます。溶液は滅菌ろ過され、分注され、-20°Cで保存されます。 |
| 17β-エストラジオール | シグマ-アルドリッチ | E2758 | A 10 μMストック溶液は、13.5mgのエストラジオール粉末を10mlのエタノールに再溶解し、40mlのPBSを添加して作製します。溶液は滅菌ろ過され、分注され、-20°Cで保存されます。 |
| ボトルトップ真空フィルター(0.22 μm) | Sigma-Aldrich(コーニング) | CLS430769 | 調製後の収集培地の無菌ろ過用 |
| 6ウェル組織培養プレート | BD Falcon | 353224 | ポリスチレン、組織培養処理済み |
| 6ウェルトランスウェル | ミリポア | PICM03050 | インサート - 径30 mm、0.4 μm孔径親水性PTFE膜 |
| 外マトリックス(例えば、マトリゲルマトリックス) | BDバイオサイエンス | 354234 | 研究にマトリゲルマトリックスを利用しています。室温および-20°Cで固体です。凍結/解凍の繰り返しは避けてください。ボトルを粘性のある溶液に4°Cで解凍します。C、および~300 μ冷やしたピペットチップを備えた冷蔵室のLアリコート。アリコートを-20°Cで保存してください。 |
| パラホルムアルデヒド、16%w / v水溶液 | Alfa Aesar | 30525-89-4 | 組織固定のために、このストックをPBSで希釈することにより、4%パラホルムアルデヒドの新鮮な調製物が行われます。 |
| 組織培養インキュベーター、37°Cに維持。C、5%CO2、3%酸素(絨毛器官培養の場合はオプション) | 一部の実験では、低酸素が好まれる場合があります。これは、ガスボンベ、タイゴンチューブ、レギュレーターを介した外因性窒素の添加など、複数の方法で確立できます。 | ||
| ベンチトップ遠心分離機 |
参考文献
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23(2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732(2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308(2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804(2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66(2006).
再版と許可
